1、第一章第一章 绪绪 论论分子生物学分子生物学本章主要内容本章主要内容一、分一、分子生物学的基本含义子生物学的基本含义二、分子生物学的主要研究内容二、分子生物学的主要研究内容三、分子生物学的发展简史三、分子生物学的发展简史四、分子生物学四、分子生物学在兽医上的应用在兽医上的应用Why?一、分一、分子生物学的基本含义子生物学的基本含义是从是从分子水平分子水平研究生命本质，以研究生命本质，以核酸核酸和和蛋白质蛋白质等生物大分子的等生物大分子的结构结构及其在及其在遗传信遗传信息息和和细胞信息细胞信息传递传递中的作用为研究对象的中的作用为研究对象的一门新兴学科。一门新兴学科。二二、分子生物学研究内、分子
2、生物学研究内容容 DNA重组技术（基因工程）基因的表达调控 生物大分子的结构和功能研究(结构分子生物学）基因组、功能基因组与生物信息学研究（一）（一）DNA重组技术重组技术 目的是将不同目的是将不同DNA片段（如某个基因或片段（如某个基因或基因的一部分）按照人们的设计定向连接起基因的一部分）按照人们的设计定向连接起来，在特定的受体细胞中与载体同时复制并来，在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生影响得到表达，产生影响 受体细胞的新的受体细胞的新的 遗传性状遗传性状。以以 质质 粒粒 为为 载载 体体 的的DNA 克克 隆隆 过过 程程目目 录录DNA重组技术1、可用于定向改造某些生物的
3、基因组结构，提高其经济价值；2、可被用于大量生产某些在正常细胞代谢中产量很低的多肽；3、可被用来进行基础研究。replicationtranslationtranscriptionProteinRNADNAreverse transcrirtion（二）（二）基因的表达调控信号转导研究转录因子（transcription factor）研究RAN剪接信号转导研究信号转导研究转录因子研究转录因子研究真核生物帽子结构的加入在细胞核内完成，而且是在RNA链开始合成后即加入。真核基因结构的不连续性真核基因结构的不连续性真核基因结构的不连续性真核基因结构的不连续性RNA剪辑剪辑RNA剪辑剪辑（三）生物大
4、分子的结构功能研究（三）生物大分子的结构功能研究 生物大分子在生物大分子在发挥生物学功能时，发挥生物学功能时，必须具备必须具备两个前提两个前提：A 它拥有它拥有特定特定的的空空间结构间结构（三维结构）（三维结构）B 在它发挥生物学在它发挥生物学功能的过程中，必定功能的过程中，必定存在着存在着结构和构象的结构和构象的变化变化。（四）（四）基因组、功能基因组与生物信息学研究基因组、功能基因组与生物信息学研究 基因组基因组:一个细胞（或生物体）内所有基一个细胞（或生物体）内所有基因的组合因的组合 功能基因组学功能基因组学：研究基因组内每个基因研究基因组内每个基因的具体功能及其相互关系的具体功能及其相
5、互关系 蛋白质组计划：蛋白质组计划：后基因组计划，研究蛋后基因组计划，研究蛋白质的组成、功能白质的组成、功能 生物信息学：生物信息学：以以计算机计算机为工具对为工具对生物信息生物信息进进行储存、检索和行储存、检索和分析分析 人染色体及其标准带纹人染色体及其标准带纹（常染色体和性染色体）（常染色体和性染色体）染色体染色体DNA氨基酸氨基酸三三、分子生物学简史、分子生物学简史20世纪世纪70s以后以后20世纪世纪50s至至20世纪世纪70s19世纪至世纪至20世纪世纪50年代年代改造生命的发展阶段改造生命的发展阶段初步认识生命本质初步认识生命本质建立和发展阶段建立和发展阶段准备和酝酿阶段准备和酝酿
6、阶段（一）准备和酝酿阶段（一）准备和酝酿阶段 产生了两点对生命本质的认识上的重大突破：即确定了蛋白质是生命的主要物质基蛋白质是生命的主要物质基础和生物遗传的物质是础和生物遗传的物质是DNA。蛋白质是生命的主要物质基础蛋白质是生命的主要物质基础1897年，Buchner兄弟用不含细胞的酵母提取液，实现了发酵，提出酶是生物催化剂。1902年Email Fisher证明蛋白质结构是多肽。1953年Sanger和Thompson完成了第一个多肽分子-胰岛素A链和B链的氨基酸全序列分析。1950年Pauling和Corey提出了-角蛋白的螺旋结构模型。生物遗传的物质是生物遗传的物质是 基因的分子载体是基
7、因的分子载体是DNA而不是蛋白质，而不是蛋白质，BacterialStrainInjectionResultsLiving S cellsLiving R cellsHeat killed S cellsHeat killed S cells mixed with living R cellsLiving S cells in blood sample from dead mousecapsule1928 Frederick Griffith&1944 Oswald Avery Transformation of Streptococcus pneumoniae肺炎双球菌转化因子实验肺炎双球菌
8、转化因子实验 1952年Hershey和Chase证实噬菌体DNA侵染细菌实验（二）现代分子生物学的建立和发展阶段现代分子生物学的建立和发展阶段 1 中心法则的建立和完善中心法则的建立和完善50年代末至年代末至60年代，相继提出了年代，相继提出了“中心法则中心法则”和操纵子和操纵子学说学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。流动和表达。Jacob and Monod2 蛋白质结构与功能的深入研究蛋白质结构与功能的深入研究一个碱基突变一个碱基突变氨基酸变异氨基酸变异蛋白质变异蛋白质变异人类疾病人类疾病 （镰刀性贫血病：谷氨酸（镰刀性贫
9、血病：谷氨酸缬氨酸）缬氨酸）但是，如果没有分离和富集单一但是，如果没有分离和富集单一DNADNA分分子的技术，科学家就无法对这类物质进子的技术，科学家就无法对这类物质进行直接的生化分析。行直接的生化分析。（三）初步认识生命本质并开始改造生命（三）初步认识生命本质并开始改造生命的深入发展阶段的深入发展阶段两大两大技术保证：技术保证：1.DNA的体外切割和连接的体外切割和连接1962年年Arber 发现限制性核酸内切酶，发现限制性核酸内切酶，1967Gellert发现了发现了 DNA 连接酶连接酶DNA ligase covalently links two DNA strands Restric
10、tionenzymeRestrictionenzymeLigaseLigase3535Herbert Boyer,Stanley Cohen1972年获得年获得第一个重组第一个重组DNA分子分子Herbert Boyer重组重组DNADNA实验中常见的主要工具酶实验中常见的主要工具酶酶 类功 能限制性核酸内切酶识别并在特定位点切开DNADNA连接酶通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片段连接成一个DNA分子DNA聚合酶I（大肠杆菌）按5到3方向加入新的核苷酸，补平DNA双链中的缺口反转录酶按照RNA分子中的碱基序列，根据碱基互补原则合成DNA链多核苷酸激酶把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5-OH末端（
11、进行末端标记实验或用来进行DNA的连接末端转移酶在双链核酸的3末端加上多聚单核苷酸DNA外切酶III从DNA链的3末端逐个切除单核苷酸噬菌体DNA外切酶从DNA链的5末端逐个切除单核苷酸碱性磷酸酯酶切除位于DNA链5或3末端的磷酸基团 到目前为止，科学家已经几乎能随心所欲地把任何到目前为止，科学家已经几乎能随心所欲地把任何DNA分子切割分子切割成一系列不连续的片段，再利用凝胶电泳技术将这些片段按照分子量大成一系列不连续的片段，再利用凝胶电泳技术将这些片段按照分子量大小逐一分开，以供下一步研究。小逐一分开，以供下一步研究。1972-Paul Berg,Produced first recombi
12、nant DNA using EcoRIEcoRI recognition sites phage DNAEcoRI cuts DNA into fragmentsSticky endSV40 DNAThe two fragments stick together by base pairingDNA ligaseRecombinant DNA 仅仅能在体外利用限制性核仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和酸内切酶和DNA连接酶进行连接酶进行DNA的切割和重组远不能满足的切割和重组远不能满足基因研究的需要。基因研究的需要。DNA片段在体外不具备自我片段在体外不具备自我复制能力，要想得到足够量和复制
13、能力，要想得到足够量和足够纯度的足够纯度的DNA，必须将它们，必须将它们连接到具备自主复制能力的连接到具备自主复制能力的DNA分子上（载体上），并转分子上（载体上），并转入寄主细胞中进行繁殖。入寄主细胞中进行繁殖。这就是这就是基因克隆，或分子克基因克隆，或分子克隆隆。分子克隆的载分子克隆的载体体-具备自主具备自主复制能力的复制能力的DNA分子分子（vector），），如如病毒、噬菌体病毒、噬菌体和质粒等小分和质粒等小分子量复制子都子量复制子都可以作为基因可以作为基因导入的载体导入的载体。从此，大肠杆菌就成了分从此，大肠杆菌就成了分子克隆中最常用的转化受子克隆中最常用的转化受体。体。1970年年
14、Mandel和和Higa发现，大肠杆菌细胞经发现，大肠杆菌细胞经适量氯化钙处理后，能有效地吸收适量氯化钙处理后，能有效地吸收噬菌体噬菌体DNA。1972年，年，Cohen等人又报道，经氯化钙处理的等人又报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细胞同样能够摄取质粒大肠杆菌细胞同样能够摄取质粒DNA。1973-Boyer,Cohen&ChangTransform E.coli with recombinant plasmidStanley Cohen&Annie ChanHerbert BoyerKanamycin resistance genePlasmid pSC101Tetracycline resis
15、tance geneE.coli transformed with recombinant plasmidTransformed cells plated onto medium with kanamycin and tetracyclineOnly cells with recombinant plasmid survive to produce colonies(1)从此，大肠杆菌就成了从此，大肠杆菌就成了分子克隆中最常用的转化分子克隆中最常用的转化受体。受体。（2 2）像非洲爪蟾这样的高等）像非洲爪蟾这样的高等生物的基因也可以被成功地生物的基因也可以被成功地转移到原核细胞中并实现其转移到
16、原核细胞中并实现其功能表达；功能表达；（3 3）质粒）质粒DNA-DNA-大肠杆菌大肠杆菌细胞作为一种成功的基因细胞作为一种成功的基因克隆体系，有可能在重组克隆体系，有可能在重组DNADNA或基因工程研究中发或基因工程研究中发挥重要作用。挥重要作用。DNA的核苷酸序列分析技术的核苷酸序列分析技术 DNA核苷酸序列分析法是在核酸的酶学和生物化核苷酸序列分析法是在核酸的酶学和生物化学的基础上创立并发站起来的一门重要的学的基础上创立并发站起来的一门重要的DNA技术技术学，这门技术，学，这门技术，对于从分子水平上研究基因的结构与对于从分子水平上研究基因的结构与功能的关系，以及克隆功能的关系，以及克隆D
17、NA片断的操作方面，片断的操作方面，都有都有着十分广泛的使用价值。着十分广泛的使用价值。四四、分子生物学的应用分子生物学的应用品种改良品种改良转基因牛 作为生物反应器 改善牛奶的品质，提高酪蛋白含量 转入生长激素基因，提高产奶量转基因羊 获得人的凝血酶原激活剂、凝血因子、尿激酶等。改变羊毛的颜色。转基因猪 生长激素基因 人的血红蛋白基因提高畜牧业的生产力发展水平提高畜牧业的生产力发展水平分子生物学在兽医中的应用分子生物学在中兽医中的应用分子生物学在中兽医中的应用分子生物学软件在动物医学研分子生物学软件在动物医学研究中的应用究中的应用分子生物学技术在传染病中的分子生物学技术在传染病中的应用应用分
18、分子生物学技术在中兽医基础理论中的应子生物学技术在中兽医基础理论中的应用 阴阳学说与分子生物学技术 阴阳学说贯穿于中兽医学理论体系的各个方面。对分子生物学的主要研究对象核酸和蛋白质及与其密切相关的细胞核和细胞质进行了阴阳属性的划分。核酸属阴，蛋白质属阳；胞核属阴，胞质属阳。近几年来，我国对cAMP、cGMP与中兽医阴阳学说进行了研究。李芳生报道，阳虚者cAMP水平升高；阴虚者cGMP水平升高。进一步分析cAMP、cGMP与阴虚和阳虚的关系可知，阳虚者表现副交感神经系统活动加强；阴虚者主要表现交感神经系统活动加强。这些研究都为推动中医理论向现代化迈进有重要意义。素问至真要大论中说“谨察阴阳所在而
19、调之，以平为期”，是中医临床诊断和治疗的基本原则。与此理论相一致，分子生物学技术研究发现，正常细胞染色体上存在非活化状态的原癌基因，同时还存在抑癌基因。如前者激活，基因异常表达；或后者缺失而不能发挥正常细胞生长调节和终止分化作用，就可导致肿瘤发生，这说明原癌基因与抑癌基因两者平衡失调对肿瘤发生起着重要作用。脏脏腑学说与分子生物学技术腑学说与分子生物学技术 脏腑学说是研究动物机体各脏腑器官的生理活动、病理变化及其相互关系的学说。肾藏精，主命门之火，是机体的先天之本。杨金蓉运用“恐伤肾”原理恐吓母鼠，造成子鼠先天肾气亏虚的动物模型，然后检验子鼠胸腺核酸含量，发现恐吓各组DNA、RNA含量及RNAD
20、NA值均有所降低，且恐吓程度越重，降低越明显。王米渠报道受惊吓母鼠所产子鼠大脑皮层厚度变薄，尤以分子层明显变薄，说明围产期紧张情绪直接影响到下一代子鼠的生长发育。用RTPCR技术发现肾阳虚证和下丘脑室旁核促肾上腺皮质激素的mRNA表达受抑，将肾阳虚证定位在下丘脑。脾统血，主运化，是机体的后天之本。王晓明等通过脾气虚证大白鼠模型及其相关抗氧化酶变化研究，提示中医认为“脾为后天之本”在生理上同分子生物学水平的抗氧化酶活性和(含量)的正常，对中医“脾”的本质的现代化科学解释有一定的学术意义。这一切都说明中医脏象学说是有分子生物学基础的。中中兽医证的研究与分子生物学技术兽医证的研究与分子生物学技术 中
21、兽医中的同病异治、异病同治在分子生物学上的体现就是将同一疾病不同证候和同一证候不同疾病的动物进行基因图谱表达，观察分析其基因突变、异常表达同疾病的关系。从中西医结合的角度，中医证本质的含义是指引起证发生发展的物质基础，这些物质决定着证的动态变化过程。分子生物学对于蛋白质研究的突破将为证候与蛋白质的结合研究奠定基础，在这一方面，有关蛋白质芯片的深入研究和纳米技术的使用将为蛋白质的研究与中医证候的研究提供发展的契机。而证候一基因组学也是中医现阶段研究的一个重要课题，将宏观的中医证候与微观的基因功能相联系。为中医证候的现代化研究提供了新的探索路径。发现“阳虚”动物骨髓细胞DNA合成率下降，认为中医肾
22、主骨生髓藏精理论与促进核酸蛋白质代谢有关。通过对中药抗衰老作用机制的研究发现端粒长度缩短与衰老有关。端粒是线形染色体末端的特殊结构，含有DNA高度重复序列，随着细胞的衰老，血液及结肠黏膜细胞中端粒的平均长度在不断减少，抗衰老中药的作用可能表现在对端粒DNA重复序列有保护作用。而中药通过提高DNA的修复能力、清除自由基、增强神经生长因子(NCF)受体等作用来达到抗衰老之目的。分子生物学技术在中药研究中的应用 1994年，Wilkins和Williams首先提出了蛋白质组。化学蛋白质组学是利用化学小分子直接从功能角度切入蛋白质组的研究，通过化学小分子处理前后的差异蛋白质组展示，研究蛋白质的翻译后修
23、饰过程。这种研究模式为中药对机体的作用机制提供了研究平台。分子生物学技术应用于中药药理的研究开始于中药单体的研究，集中于人参三醇皂苷、云芝多糖等中药单体对细胞内相关因子及受体mRNA转录、基因表达上有调控作用。对于中药复方的研究尚处于起步阶段。我国学者曾对人参、黄芪、青蒿、淫羊藿、银耳、灵芝等药物对体内重要的细胞因子(ILl、IL一2、IL一3、IL一6、TNF等)的基因表达调控机体的免疫反应做了探讨。曹颖英等应用斑点杂交法研究表明，淫羊藿苷(ICA)可促进刀豆蛋白(ConA)诱导的淋巴细胞IL一3 mRNA、IL一6 mRNA的表达初步阐明了ICA促进某些细胞因子产生的分子机制。2 分子生物
24、学软件在动物医学研究中的应用 分子生物学作为基础学科，在动物医学研究领域（动物疾病发生机理、诊断与预防）中的应用不断拓展，其相关应用软件已成为广大研究人员必不可少的辅助工具，熟练掌握一套相关生物学软件的使用，可以为科研工作者节省大量宝贵的时间，并起到事半功倍的效果。参考文献收集整理 书目资料库管理系统v 11.0(Reference Manager v 11.0)。Reference Manager是一个专门设计来管理书目参考文献的资料库程序。收集参考文献和制作书目都可以使用Reference Manager轻易地管理资料。目前提供新资料库可以将您收集完成的Reference Manager资
25、料库放在网络环境中，可以通过网络进入您的Web Publisher网站检索并建立参考文献清单或输出参考文献。实验设计与实施 本阶段包括限制酶分析、引物设计、同源序列比较、质粒作图、结构域(motif)查找、RNA二级结构预测、蛋白二级结构分析、克隆策略图谱、三维结构显示、电泳条带定量分析、数据统计分析作图等方面的内容3 分子生物学技术在传染病领域中的应用分子生物学技术在传染病领域中的应用（1）基因工程疫苗 重组亚单位疫苗 重组活载体疫苗 基因缺失疫苗 基因疫苗 多肽疫苗 转基因植物疫苗 应用基因工程首先研制出了伪狂犬病病毒(PRV)基因工程苗。最初，从胸苷激酶TK 基因编码缺失148个核苷酸的
26、病毒而减毒，TK催化胸苷嘧啶脱氧核苷转化为单磷酸形式作为核苷合成补救途径的部分物质，认为这对病毒在细胞上增殖是极其重要的，当在体外细胞培养系统上培养时，完全不要TK，且缺失不影响病毒的生长。然而，当在体内检测时，发现TK 阴性病毒严重地减毒，建议这作为理想的疫苗候选株，对这株TK阴性突变株来说，减毒的基础是规定的和稳定的，由于减毒牵涉到基因基本组分的转移，因而转变成致病力株是不可能的，相比之下，突变株常有常规的减毒疫苗，随后，使TK阴性PRV进一步衍化，这涉及到非必需糖蛋白基因编码组分缺失，病毒糖蛋白是含有蛋白的糖，它位于许多病毒(或病毒感染细胞)的表面。对抗宿主的免疫反应，在一种改进的翻译中
27、，从g 基因中移去l100个核苷酸片断。其它研究人员研制的PRV疫苗，缺失TK和gx基因随后建立了几个其它缺失突变株。（2）兽医细菌学研究中的应用）兽医细菌学研究中的应用 PCRPCR在细菌病诊断中的应用在细菌病诊断中的应用PCR 尤其适用于那些培养困难的细菌检测以及那些抗原性复杂的细菌鉴定。如通过检测毒素来监测产毒素菌株,如巴氏杆菌、肉毒梭菌等。细菌细菌DNA 中中G+C mo l%含量的测定含量的测定 细菌DNA 中G+C mo l%含量是细菌分类鉴定的一个重要指征,可作为细菌分类的依据和判定细菌科属间亲缘关系的标准,同时也是新发现细菌的鉴定依据之一。基因探针技术基因探针技术 实验室中制备了多种临床应用的DNA 探针与rRNA 杂交,具有高度的特异性,可检测所有细菌纲内的细菌、一个细菌科内细菌、一个细菌属内细菌或仅对某一个种内细菌。Virus destroys the cell as a result of budding基因诊断与基因治疗基因诊断与基因治疗标记基因标记基因 启动子启动子 外源目的基因外源目的基因 终止序列终止序列DNA-mRNA-蛋白质性状蛋白质性状口蹄疫口蹄疫暴发后暴发后用于医药生产的基因工程用于医药生产的基因工程猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测试剂盒THE END
