1、实验实验四四肠道致病菌的微生物学检查肠道致病菌的微生物学检查结核分枝杆菌的培养及形态观察结核分枝杆菌的培养及形态观察 医学微生物学医学微生物学实验实验 实验内容：实验内容：1.1.肠道致病菌的微生物学检查肠道致病菌的微生物学检查 2.2.结核分枝杆菌的培养及形态观察结核分枝杆菌的培养及形态观察（抗酸染色）（抗酸染色）1.肠道致病菌的微生物学检查肠道致病菌的微生物学检查 实验目的：实验目的：肠道细菌营养要求不高，普通培养基均肠道细菌营养要求不高，普通培养基均能生长。所有肠道杆菌形态、菌落特点相似，能生长。所有肠道杆菌形态、菌落特点相似，无鉴别意义。但生化反应十分活泼，是鉴定无鉴别意义。但生化反应
2、十分活泼，是鉴定肠道菌的重要依据。肠道菌的重要依据。（2）常用培养基介绍常用培养基介绍 主要包括：主要包括：SS琼脂平板琼脂平板 伊红美蓝培养基伊红美蓝培养基（EMB）双糖铁培养基双糖铁培养基SS平板分离肠道病原菌的强选择培养基平板分离肠道病原菌的强选择培养基成分和作用成分和作用：基础培养基基础培养基：提供氮源和碳源：提供氮源和碳源 胆盐、枸橼酸钠、煌绿胆盐、枸橼酸钠、煌绿：可抑制肠道非：可抑制肠道非致病菌的生长，而对肠道致病菌抑制作致病菌的生长，而对肠道致病菌抑制作用弱。用弱。乳糖，中性红乳糖，中性红（pH6.8-8.0pH6.8-8.0，红，红橙橙黄）黄）：致病菌不分解乳糖，但分解蛋白：致
3、病菌不分解乳糖，但分解蛋白胨产生碱性物质胨产生碱性物质菌落淡黄色菌落淡黄色。H2S:致病菌致病菌:不分解乳糖，不分解乳糖，透明透明,无色，小菌落无色，小菌落 非致病菌非致病菌:分解乳糖，分解乳糖，紫黑色紫黑色EMB（Eosin Methyl Blue)平板平板分离肠道病原菌的弱选择培养基分离肠道病原菌的弱选择培养基Double sugar iron agar slant乳糖乳糖FeSO4葡萄糖葡萄糖指示剂指示剂:酚红酚红固体固体半固体半固体373718-24hrs18-24hrsDouble sugar iron agar slantlactoseFe2SO4glucose指示剂指示剂:酚红酚
4、红 solidSemi-solid373718-24hrs18-24hrsobserve upperlayer Lactose fermemtation：pathogenic bacillired nonpathogenic bacilli-yellow H2S uderlayer Glucose fermemtation（acid,gas）Motivation gas 如何观察如何观察 上层含乳糖部分上层含乳糖部分 乳糖发酵：致病菌红色，非致病菌乳糖发酵：致病菌红色，非致病菌黄色黄色 H2S 然后观察下层然后观察下层 发酵葡萄糖（产酸产气）发酵葡萄糖（产酸产气）动力动力Lactose fer
5、memtationglucose fermemtationH2S-（3）肠道致病菌的分离鉴定肠道致病菌的分离鉴定 标本收集标本收集 分离培养分离培养 初步鉴定初步鉴定 生化反应生化反应 血清学鉴定血清学鉴定标本标本选择鉴别培养基选择鉴别培养基 SS平板平板生化反应生化反应血清学鉴定血清学鉴定双糖双糖铁铁已知已知Ab检测检测未知未知Ag(玻片玻片凝集试验凝集试验)3724h粪便标本肠道致病菌分离鉴别流程粪便标本肠道致病菌分离鉴别流程菌落菌落鉴别肠道致病菌的生化反应鉴别肠道致病菌的生化反应 糖发酵试验糖发酵试验 甲基红试验甲基红试验 VPVP实验实验 枸橼酸盐利用试验枸橼酸盐利用试验 硫化物（硫化
6、氢）生成试验硫化物（硫化氢）生成试验 吲哚生成试验吲哚生成试验 尿素水解试验尿素水解试验糖发酵试验糖发酵试验(fermentaton test)示教：单糖发酵管示教：单糖发酵管-+-+VP（Voges-Proskauer）试验）试验 +-Urease Test 尿素酶试验尿素酶试验：H2S Production 硫化氢试验硫化氢试验 -+IMViC试验试验(Indole Test;Methyl Red(MR)Test;Voges-Proskauer(VP)Test;Citrate Utilization Test)大肠埃希菌大肠埃希菌 产气杆菌产气杆菌 2.2.结核分枝杆菌的培养及形态观察结核
7、分枝杆菌的培养及形态观察 发病趋势和临床意义发病趋势和临床意义:世界人口中大约世界人口中大约1/31/3感染结核分枝杆菌。据感染结核分枝杆菌。据WHOWHO报道，报道，每年约有每年约有800800万新病例发生，至少有万新病例发生，至少有300300万人死于该病。近万人死于该病。近年来，世界上有些地区因艾滋病、吸毒、免疫抑制剂的应年来，世界上有些地区因艾滋病、吸毒、免疫抑制剂的应用、酗酒和贫困等原因，发病率又有上升趋势。用、酗酒和贫困等原因，发病率又有上升趋势。抗酸染色试验是确定结核病诊断和化疗方案的重要依抗酸染色试验是确定结核病诊断和化疗方案的重要依据，也是考核疗效、评价防治效果的可靠标准。但
8、抗酸染据，也是考核疗效、评价防治效果的可靠标准。但抗酸染色阳性也不一定是结核杆菌，应注意鉴别。色阳性也不一定是结核杆菌，应注意鉴别。结核分枝杆菌结核分枝杆菌形态：形态：细长，略弯曲的杆菌，多聚集成团。无鞭毛细长，略弯曲的杆菌，多聚集成团。无鞭毛,芽胞。芽胞。染色性：染色性：不易着色，齐尼抗酸染色阳性。菌体呈红色，背景中不易着色，齐尼抗酸染色阳性。菌体呈红色，背景中其他物质蓝色。其他物质蓝色。培养特性：培养特性：专性需氧，最适专性需氧，最适3737 ，营养要求高，生长缓慢，营养要求高，生长缓慢，18h18h分裂一代。分裂一代。罗氏罗氏(Lowenstein-Jensen)(Lowenstein-
9、Jensen)培养基含蛋黄、培养基含蛋黄、甘油、马铃薯、无机盐、孔雀绿，甘油、马铃薯、无机盐、孔雀绿，2626周可见菌落生周可见菌落生长，菜花、颗粒或结节状菌落，乳白色或黄色，不透长，菜花、颗粒或结节状菌落，乳白色或黄色，不透明。在液体培养基，生长于表面，有皱褶。明。在液体培养基，生长于表面，有皱褶。结核分枝杆菌的培养方法结核分枝杆菌的培养方法 1 1痰标本培养前处理痰标本培养前处理（1 1）酸处理法：痰标本加入）酸处理法：痰标本加入4 4硫酸稀释硫酸稀释2 24 4倍，倍，置室温下置室温下30min30min，期间振荡，期间振荡2 23 3次，使痰液化后即次，使痰液化后即可接种。可接种。（2
10、 2）碱处理法：痰标本加入）碱处理法：痰标本加入2 2氢氧化钠溶液稀释氢氧化钠溶液稀释2 24 4倍，置倍，置3737温箱内温箱内30min30min，期间振荡，期间振荡2 23 3次，次，痰液化后即可接种。痰液化后即可接种。2 2接种培养法接种培养法 取上述处理过的痰液取上述处理过的痰液0.1ml0.1ml均匀接种于改良罗均匀接种于改良罗氏培养基斜面，氏培养基斜面，3737孵育孵育3 34 4周后观察菌落特点。周后观察菌落特点。菌落为乳白色或米黄色，表面粗糙呈颗菌落为乳白色或米黄色，表面粗糙呈颗粒状或菜花状粒状或菜花状 抗酸染色抗酸染色 结核杆菌对苯胺染料一般不易着色，但经结核杆菌对苯胺染料
11、一般不易着色，但经加温或延长染色时间后能抵抗加温或延长染色时间后能抵抗3 3盐酸乙醇盐酸乙醇的脱色作用。经此法染色后，结核杆菌及的脱色作用。经此法染色后，结核杆菌及其他分枝杆菌呈红色，非抗酸菌呈蓝色。其他分枝杆菌呈红色，非抗酸菌呈蓝色。示教：结核分枝杆示教：结核分枝杆菌抗酸染色菌抗酸染色 实验步骤：实验步骤：1 1用竹签挑取开放性肺结核病人晨痰标本中干酪样用竹签挑取开放性肺结核病人晨痰标本中干酪样小粒或脓性部分，或用取菌环挑取经酸、碱处理小粒或脓性部分，或用取菌环挑取经酸、碱处理后的痰标本，置载玻片中央，均匀涂布成后的痰标本，置载玻片中央，均匀涂布成1.51.52.0cm2.0cm卵圆形痰膜，
12、干燥，固定。卵圆形痰膜，干燥，固定。2 2滴加石炭酸复红液于涂片上，玻片置于酒精灯火滴加石炭酸复红液于涂片上，玻片置于酒精灯火焰缓缓加热，至有蒸汽冒出，约维持焰缓缓加热，至有蒸汽冒出，约维持5min5min（切勿切勿沸腾或使染液干涸于玻片上沸腾或使染液干涸于玻片上）。如有染液干涸趋）。如有染液干涸趋势，应补加染液。然后自然势，应补加染液。然后自然冷却冷却，用流水漂去多，用流水漂去多余染余染液。液。3 3滴加滴加3 3盐酸乙醇脱色，至涂片较厚处无颜色脱盐酸乙醇脱色，至涂片较厚处无颜色脱出为止，约出为止，约30s30s，水洗。，水洗。4 4滴加碱性亚甲蓝液复染滴加碱性亚甲蓝液复染1min1min，水洗。，水洗。5 5滤纸吸干后镜检。滤纸吸干后镜检。涂片涂片 痰标本痰标本固定固定干燥干燥石炭酸复红石炭酸复红加热加热注意：不要让染料干枯，需补加染注意：不要让染料干枯，需补加染料，保持冒蒸汽。料，保持冒蒸汽。5水冲水冲 脱色脱色3%盐酸乙醇盐酸乙醇 30”水冲水冲 美兰美兰 1 水水冲冲干燥干燥观察观察 抗酸染色抗酸染色-结核杆菌结核杆菌 实验材料实验材料痰液痰液1 1管管/小组，抗酸染色染液小组，抗酸染色染液1 1套套/小组，玻小组，玻片片1 1个个/人人实验报告内容实验报告内容 抗酸染色法抗酸染色法实验原理、实验步骤、实验结果绘图实验原理、实验步骤、实验结果绘图和结果分析。和结果分析。
