1、一、实验原理：1、培养基原理 平板计数琼脂培养基：胰蛋白胨提供碳源和氮源；酵母浸粉提供B族维生素；葡萄糖提供能源；琼脂是培养基的凝固剂。2、细菌最适生长环境 a、多数细菌的最适温度范围基本相似，多为37左右 b、pH细菌对PH的适应范围较大为pH2.08.0，但多数细菌的生长最适PH为6.08.0 c、根据细菌对氧气的需要可分为4类；需氧菌微需氧菌、兼性厌氧菌、厌氧菌、所以培养需氧细菌时，需要高氧分压的环境，而培养厌氧细菌对，就要降低并严格控制环境中的氧分压 3、细菌的菌落特征 一般呈现较湿润、较光滑、质地均匀，且菌落正反面或边缘与中央部位的颜色一致4、菌落总数测定中的注意事项41 所用器皿及
2、稀释液411 检验中所用玻璃器皿，如培养皿，吸管、试 管、移液器的吸头等必须是完全灭菌的，并在灭菌前彻底洗涤干净，不得残留有抑菌物质。412 用作样品稀释的液体，每批都要有空白对照。如果在琼脂对照平板上出现几个菌落时，要查找原因，如可通过追加对照平板，以判定是空白 稀释液，用于倾注平皿的培养基，还是平皿、吸管或空气可能存在的污染。413 检样的稀释液一般用灭菌盐水，如果对含盐量较高的食品(如酱品等)进行稀释，则宜用蒸馏水。做醋时用20 一30 碳酸钠调pH 至中性。实验流程图样品：酸菜汤1 样品的稀释1.1 固体和半固体样品：称取25 g 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均
3、质杯内，8000 r/min10000 r/min 均质1 min2 min，制成1:10 的样品匀液。1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10 的样品匀液。1.3 用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注于盛有9 mL 稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管，制成1:100 的样品匀液。1.4 按6.1.3 操作程序，制备10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1 次1 mL 无菌吸管或吸头。1.5 根据
4、对样品污染状况的估计，做5 个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10 倍递增稀释时，吸取1 mL 样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做3个平皿。同时，分别吸取1 mL 空白稀释液加入1个无菌平皿内作空白对照。1.6 及时将15 mL20 mL 冷却至46 的平板计数琼脂培养基（可放置于46 1 恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。2 培养2.1 待琼脂凝固后，将平板翻转，36 1 培养48 h2 h。2.2 如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4 mL），凝固后翻转平板，按6.2.1 条件进行培养。浓度梯
5、度为1:10浓度梯度为1:100浓度梯度为1:1000浓度梯度为0.0001浓度梯度为0.00001 浓度梯浓度梯度度试管试管0.10.10.010.010.0010.0010.00010.00010.000010.000011多不可计多不可计多不可计34 22多不可计多不可计多不可计2213多不可计多不可计多不可计342根据实验结果计算得样品中的菌落总数：N=（34+22+34）/310000 =300000 本次实验样品取自某食堂的免费汤水，从本次的实验结果可见，如果忽略实验误差，某食堂免费的汤水不符合卫生标准。培养基原理培养基原理：1.月桂荃硫酸盐胰蛋白际(LST)肉汤：胰蛋白胨提供碳源
6、和氮源满足细菌生长的需求；氯化钠可维持均衡的渗透压；乳糖是大肠菌群可发酵的糖类；磷酸二氢钾和磷酸氢二钾是缓冲剂；月桂基硫酸钠可抑制非大肠菌群细菌的生长2.煌绿乳糖胆盐(BGAB)肉汤：蛋白胨提供碳氮源；乳糖是可发酵的糖类；牛胆粉和煌绿抑制非肠杆菌科细菌。3.EC肉汤：胰蛋白胨提供碳氮源；三号胆盐抑制革兰氏阳性菌，特别抑制革兰氏阳性杆菌和粪链球菌；乳糖是可发酵的糖类；磷酸氢二钾和磷酸二氢钾为缓冲剂；氯化钠可维持均衡的渗透压。4.伊红美蓝琼脂(EMB）：蛋白胨提供碳源和氮源；乳糖是大肠菌群可发酵的糖类；磷酸氢二钾是缓冲剂；琼脂是培养基凝固剂；伊红和美蓝是抑菌剂和pH指示剂，可抑制革兰氏阳性菌，在酸
7、性条件下产生沉淀，形成紫黑色菌落或具黑色中心的外围无色透明的菌落。5.营养琼脂斜面：蛋白胨和牛肉粉提供氮源、维生素、氨基酸和碳源；琼脂是培养基的凝固剂。6.色氮酸肉汤：胰 酪胨提供碳源和氮源满足细菌生长需求7.MR-VP培养基：月示胨提供碳氮源、维生素和生长因子；葡萄糖为可发酵的糖类；磷酸氢二钾是缓冲剂；氯化钠维持均衡的渗透压。甲基红（MR）试验：肠杆菌科的细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖，产生丙酮酸，丙酮酸再被分解，生成甲酸、乙酸、乳酸、琥珀酸。大肠杆菌分解丙酮酸，次生的酸类较多，pH为4.5或更低，甲基红呈现红色（阳性）。在产气杆菌的培养液中一部分丙酮酸变为中性的乙酰甲基甲醇，生成的酸类较少
8、，pH在5.4以上，甲基红呈现桔黄色（阴性）。乙酰甲基甲醇生成试验（VP试验）：细菌发酵葡萄糖生成丙酮酸，某些细菌可使丙酮酸脱羧形成乙酰甲基甲醇。在碱性溶液中，乙酰甲基甲醇可在空气中氧化成二乙酰（丁二酮）。二乙酰再与蛋白胨中精氨酸的胍基作用，生成红色化合物。试验中加入萘酚是作催化剂，使反应的颜色加深，提高反应的敏感性。8.结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)：蛋白胨和酵母粉提供碳氮源和微量元素；乳糖是可发酵的糖类；氯化钠可维持均衡的渗透压；胆盐和结晶紫抑制革兰氏阳性菌，特别抑制革兰氏阳性杆菌和粪链球菌；中性红为pH指示剂。伊红为酸性染料，美蓝为碱性染料。当大肠杆菌分解乳糖产酸时细菌带正电荷被染成红
9、色，再与美蓝结合形成紫黑色菌落，并带有绿色金属光泽。而产气杆菌则形成呈棕色的大菌落 通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色 a.将涂
10、片在火焰上固定，滴加结晶紫染液，染1min，水洗。b.滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。c.滴加95%乙醇脱色约15-30s，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。d.滴加复染液，复染1min，水洗、待干、镜检。结果:革 兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。4、样品稀释 所用样品：酸菜汤4.2.1液体食品 以 灭 菌 吸管取样25mL放入装有225m1无菌水的灭菌玻璃瓶(瓶内预置适当数量的玻璃珠)，以30cm幅度、于7s内4.2.2 固振摇25次(或以机械振荡器振摇)，制成1:10的样品匀液。固体和半固体食品 以无 菌 操 作取25g样品，放入装有225mL稀释剂的灭菌均质杯内，干8000
11、r/min均质1-2min，制成1:10样品匀液(也可用灭菌乳钵研磨的方法代替)。5.大肠茵群的测定5.1 大肠菌群MPN值的测定5.1.1 对每个样品，选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液。每个稀释度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白脉(LST)肉汤，每管接种1mL.5.1.2 将接种管置于36士1培养48士2h,5.1.3 观察试管的产气情况:检查倒管内是否有气泡产生，记录在24h Ta 48h内产气的LST肉汤管数。如所有LST肉汤管均未产气，则可报告为大肠菌群阴性;如有产气者，则进一步作证实试验。5.2 大肠菌群的证实试验5.2.1 将所有产气管用直径为3mm的接种环移种到煌绿乳糖胆盐(BGL
12、B)肉汤管中。5.2.2 置BGLB肉汤管于36士1C培养48士2h,5.2.3 记录所有BGLB肉汤管的产气管数。5.2.4 结果报告:按BGLB肉汤产气管数，查MPN表见附录B(补充件)报告每克(毫升)样品中大肠菌群的MPN值。从右图可知，浓度梯度1:10、1:100、1:1000每个梯度的三根管都产气。最右边一根为空白管。6 粪大肠菌群测定6.1 用直径为3mm的接种环将所有48士2h内产气的LST肉汤管培养物移种于EC肉汤管中。6.2 将所有接种的EC肉汤管在30min内放入带盖44.510.5水浴箱内，培养24士2h 水浴箱的水平面应高于肉汤培养基液面。应以已知为44.5产气阳性的大
13、肠杆菌和44.5 C不产气的产气肠杆菌或其他大肠菌群细菌作阳性和阴性对照。6.3 记录EC肉汤管的产气情况。产气管为粪大肠菌群试验阳性;不产气管为粪大肠菌群试验阴性。6.4 结果报告;按产气管数，查MPN表报告每克(毫升)样品中粪大肠菌4的MP值。浓度梯度为0.10.001的样品均产气。结论：本次报告样品检测各个稀释梯度均产气。查MPN表得：每mg样品中粪大肠杆菌群MPN值1100.7.大肠杆菌测定7.1 将6.3条中的EC肉汤管继续培养24h，取其产气管的培养物划线接种于伊红美蓝(EMB)平板，36士IC培养24士2h,7.2 检查平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。7.3 如有典
14、型菌落，则从每个平板上至少挑取2个典型菌落;如无典型菌落，则从每个平板上至少挑取2个可疑菌落.用接种针接触菌落中心部位.移种到营养琼脂斜面上，36士1培养18-24h,7.4 将斜面培养物移种到下列培养基中进行生化试验。7.4.1一色氨酸肉汤:在36士1培养24士2h后，加Kovacs氏试剂。2-0.3m L，上层出现红色为靛基质阳性反应。7.4.2 MR-VP培养基:在36士1培养48士2h。以无菌操作移取培养物1mL至13mm X1 00mm试管中，加5%。一蔡酚乙醇溶液0.6 mL,40%氢氧化钾溶液0.2m L和少许肌酸结晶，振摇试管后静置2h，观察现象。实验结论：未出现伊红色，实验结
15、论：未出现伊红色，为为VP试验阴性。试验阴性。将 M R-VP培养物的剩余部分再培养48h滴加5滴甲基红溶液，观察现象。左图为滴加甲基红前。试管从做到又分别为空白管、样品管、阳性管滴加甲基红后，右图Koser氏枸橼酸盐肉汤在36摄氏度培养96h.观察到到的结果是：液体澄清、无变化。实验结论：koser氏枸橼酸盐肉汤试验为阴性。靛基质靛基质 MRMRVPVP枸橼酸枸橼酸盐盐鉴别鉴别（型别）（型别）+-典型大肠杆菌标准大肠杆菌大肠杆菌与金黄色葡萄球菌培养基原理培养基原理:1.马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）：马铃薯浸出粉有助于各种霉菌的生长；葡萄糖提供能源；琼脂是培养基的凝固剂。2.孟加拉红培养基（虎红
16、培养基）：蛋白胨提供碳源和氮源；葡萄糖提供能源；磷酸二氢钾为缓冲剂；硫酸镁提供必须的微量元素；琼脂是培养基的凝固剂；氯霉素可抑制細菌的生长；孟加拉红作为选择性抑菌剂可抑制細菌的生長，并可减缓某些霉菌因生長過快而导致菌落漫延生長。1、酵母菌a、酵母菌能在pH 值为3-7.5 的范围内生长，最适pH 值为pH4.5-5.0 b、最适生长温度一般在2030之间 c、酵母菌在有氧和无氧的环境中都能生长，即酵母菌是兼性厌氧菌，在缺氧的情况下，酵母菌把糖分解成酒精和水。在有氧的情况下，它把糖分解成二氧化碳和水，在有氧存在时，酵母菌生长较快。d、适于在含糖量较高的物质生长2、霉菌a、大多数霉菌繁殖最适宜的温
17、度为2530 b、一般而言，营养丰富的食品其霉菌生长的可能性就大，天然基质比人工培养基好。c、最适水分活度为0.851、酵母菌：湿润，粘稠，易挑起，表面光华，比细菌的菌落大而厚 2、霉菌菌落的特征：a、形态较大，质地疏松，外观干燥，不透明，呈现或松或紧的形状。b、菌落和培养基间的连接紧密，不易挑取，菌落正面与反面的颜色、构造，以及边缘与中心的颜色、构造常不一致。c、霉菌的菌丝有营养菌丝和气生菌丝的分化，而气生菌丝没有毛细管水，故它们的菌落必然与细菌或酵母菌的不同，较接近放线菌。5 操作步骤5.1 样品的稀释 所用样品：5.1.1 固体和半固体样品：称取25 g 样品至盛有225 mL 灭菌蒸馏
18、水的锥形瓶中，充分振摇，即为1:10稀释液。或放入盛有225 mL 无菌蒸馏水的均质袋中，用拍击式均质器拍打2min，制成1:10 的样品匀液。5.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL 样品至盛有225 mL 无菌蒸馏水的锥形瓶（可在瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10 的样品匀液。5.1.3 取1 mL 1:10 稀释液注入含有9 mL 无菌水的试管中,另换一支1 mL 无菌吸管反复吹吸,此液为1:100 稀释液。5.1.4 按5.1.3 操作程序，制备10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1 次1 mL 无菌吸管。5.1.5 根据对样品污染状况的估计，选择
19、2 个3 个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10 倍递增稀释的同时，每个稀释度分别吸取1 mL 样品匀液于2 个无菌平皿内。同时分别取1 mL样品稀释液加入2 个无菌平皿作空白对照。5.1.6 及时将15 mL20 mL 冷却至46 的马铃薯-葡萄糖-琼脂或孟加拉红培养基(可放置于461恒温水浴箱中保温)倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。5.2 培养待琼脂凝固后，将平板倒置，281培养5d，观察并记录。5.3 菌落计数肉眼观察，必要时可用放大镜，记录各稀释倍数和相应的霉菌和酵母数。以菌落形成单位（colonyforming units，CFU）表示。选取菌落数在10 CFU1
20、50 CFU 的平板，根据菌落形态分别计数霉菌和酵母数。霉菌蔓延生长覆盖整个平板的可记录为多不可计。菌落数应采用两个平板的平均数。用肉眼观察各个稀释度的平板，未发现可疑菌落。所以过期奶茶中菌落数N10。从本次实验结果可见，放置一星期奶茶的霉菌和酵母菌菌落总数小于10，可能是由于奶茶中添加了防腐剂，也可能是取样的奶茶的含糖量较低，营养物质含量低。培养基原理培养基原理：1.10氯化钠胰酪胨大豆肉汤：胰蛋白胨、大豆蛋白胨提供氮源、维生素和生长因子；葡萄糖提供碳源；磷酸氢二钾为缓冲剂；较高含量的氯化钠提供较高的渗透压，抑制大多数非葡萄球菌的微生物；丙酮酸钠促进细菌生长。2.Baird-Parker琼脂
21、基础：胰蛋白胨、牛肉膏浸粉和酵母膏粉提供碳氮源、维生素和生长因子；丙酮酸钠和甘氨酸刺激葡萄球菌的生长；氯化锂和亚碲酸钾抑制非葡萄球菌的微生物；含有卵磷脂酶的葡萄球菌降解卵黄使菌落产生透明圈，而脂酶作用则产生不透明的沉淀环；凝固酶阳性的葡萄球菌还能还原亚碲酸钾而产生黑色菌落；琼脂是培养基的凝固剂。3.营养琼脂斜面：蛋白胨和牛肉粉提供氮源、维生素、氨基酸和碳源；琼脂是培养基的凝固剂。1 样品的稀释 所使用的样品：熟鸡蛋1.1 固体和半固体样品：称取25 g样品置盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min10000 r/min均质1 min2 min，制成1:10的样品
22、匀液。1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL样品置盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。1.3 用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注于盛有9 mL 稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管，制成1:100 的样品匀液。1.4 按8.1.3 操作程序，制备10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1 次1 mL 无菌吸管或吸头。2 接种和培养2.1 每个稀释度的样品（液体样品可包括原液），分别吸取1 mL 样品匀液接种到10%氯化钠胰酪胨大豆
23、肉汤管，每个稀释度接种3管。2.2同时做一个空白对照组。并取一支阳性对照组。2.3将上述接种物，空白对照组及阳性管于36 下培养45h-48h.2.用接种环从有细菌生长的各管中，移取1环，分别接种Baird-Parker平板，36 1 培养45 h48 h。3.1 金黄色葡萄球菌在Baird-Parker 平板上，菌落直径为2 mm3 mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。实验现象实验现象血浆凝固酶试验：挑取、Baird-Parker 平板或血平板上可疑菌落1 个或以上
24、，分别接种到5 mL BHI和营养琼脂小斜面，36 1 培养18 h24 h。取新鲜配置兔血浆0.5 mL，放入小试管中，再加入BHI 培养物0.2 mL0.3 mL，振荡摇匀，置361 温箱或水浴箱内，每半小时观察一次，观察6 h，如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂，按说明书操作，进行血浆凝固酶试验。结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到5 mL BHI，36 1 培养18 h48 h，重复试验。实验结论实验结论：查MPN检索表。每克样品中（熟鸡蛋）金黄色葡萄球菌的最可能数，MPN3.0 通过本次微生物实验，收获甚多。首先增长了自己的实验知识，锻炼了自己的实验能力，特别是无菌操作的意识。其次，增强对实验整体计划的意识，团结合作的心态，以及细节的处理能力。再者，增强对于微生物的了解，特别是食品中常见菌；增长对于培养基的认识，了解其原理与各成分的作用。最后，开阔了眼界，了解专业更多方向。
