1、怎样使微生物生长，即如何培养微生物怎样使微生物生长，即如何培养微生物？微生物如何进行生长微生物如何进行生长？影响微生物生长的因素是什么？影响微生物生长的因素是什么？如何控制微生物的生长？如何控制微生物的生长？第七章微生物的生长及其控制第七章微生物的生长及其控制纯培养：在实验条件下从一个单细胞繁殖得纯培养：在实验条件下从一个单细胞繁殖得到的后代称为纯培养到的后代称为纯培养无菌操作（无菌操作（aseptic technique)：在微生物的分离、：在微生物的分离、转接及培养微生物时防止其被其他微生物污染的技术转接及培养微生物时防止其被其他微生物污染的技术（一）稀释法（一）稀释法 1 液体稀释法液体
2、稀释法 2 固体稀释法固体稀释法（二）平皿划线法（二）平皿划线法（三）单细胞挑取法（三）单细胞挑取法（四）利用选择培养基分离法（四）利用选择培养基分离法(五）二元培养物法五）二元培养物法1液体稀释法液体稀释法适用于大型真菌适用于大型真菌方法方法:接种物在液体培养基中进行顺序稀释，得到高度稀接种物在液体培养基中进行顺序稀释，得到高度稀释，使一支试管中分配不到一个微生物。如果经稀释，使一支试管中分配不到一个微生物。如果经稀释后的大多数试管中没有微生物生长，那么有微生释后的大多数试管中没有微生物生长，那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是纯培养物物生长的试管得到的培养物可能就是纯培养物 适用于大
3、多数微生物的分离适用于大多数微生物的分离2固体稀释法固体稀释法0 1 2 3 4涂布平板法涂布平板法Spread plate method倒平板法倒平板法Pour plate method特点：快速、方便。特点：快速、方便。分区划线（适用于浓度较大的样品）分区划线（适用于浓度较大的样品）连续划线（适用于浓度较小的样品）连续划线（适用于浓度较小的样品）Inoculating an agar plate to obtain single coloniesMixed culturePure culturea 分区划线分离法分区划线分离法.b连续划线分离法连续划线分离法接种针接种针解剖镜解剖镜.Eac
4、h colony was examined microscopically为了从混杂的微生物群体中分离出某种微生物，可为了从混杂的微生物群体中分离出某种微生物，可以根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条以根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养的方法进行分离。件等，采用选择培养的方法进行分离。利用选择培养基进行直接分离利用选择培养基进行直接分离富集培养富集培养(加富培养基加富培养基)含有二种以上微生物的培养物称为混合培养物含有二种以上微生物的培养物称为混合培养物二元培养物：培养物中只含有二种微生物，而且是二元培养物：培养物中只含有二种微生物，而且是有意识的保持二者之间的
5、特定关系有意识的保持二者之间的特定关系例如：病毒的培养例如：病毒的培养 严格的细胞内寄生严格的细胞内寄生五五 二元培养物二元培养物实验室的微生物培养法实验室的微生物培养法好氧培养法好氧培养法 厌氧培养法厌氧培养法好氧菌液体培养法好氧菌液体培养法好氧菌固体培养法好氧菌固体培养法厌氧菌固体培养法厌氧菌固体培养法厌氧菌液体培养法厌氧菌液体培养法试管液体培养试管液体培养浅层液体培养浅层液体培养摇瓶培养摇瓶培养台式发酵罐台式发酵罐高层琼脂柱法高层琼脂柱法厌氧培养皿法厌氧培养皿法厌氧罐技术厌氧罐技术厌氧手套箱技术厌氧手套箱技术亨盖特滚管技术亨盖特滚管技术 试管斜面、平板试管斜面、平板茄瓶、茄瓶、曲盘曲盘二
6、、微生物的培养方法二、微生物的培养方法焦性没食子酸，吸收氧气焦性没食子酸，吸收氧气通通H2-CO2,驱逐氧气驱逐氧气加入还原剂加入还原剂,低氧化还原电位低氧化还原电位制造狭小空间制造狭小空间厌氧培养的基本方法厌氧培养的基本方法.高层琼脂柱高层琼脂柱把含有还原剂的固体或半固体装入把含有还原剂的固体或半固体装入试管中试管中,经灭菌后经灭菌后,除表面有一些溶解除表面有一些溶解氧外氧外,越是深层越是深层,其氧化还原电势越低其氧化还原电势越低.故有利于厌氧菌的生长故有利于厌氧菌的生长培养基中常用的还原剂培养基中常用的还原剂：巯基乙酸、抗坏血酸、硫化氢、：巯基乙酸、抗坏血酸、硫化氢、半胱氨酸、谷胱甘肽、二
7、硫苏糖醇等半胱氨酸、谷胱甘肽、二硫苏糖醇等Brewer 皿厌氧培养皿法厌氧培养皿法1 利用特制皿盖去创利用特制皿盖去创造一个狭窄的空间造一个狭窄的空间,再加上还原性培养再加上还原性培养基的配合使用而达基的配合使用而达到厌氧培养的目的到厌氧培养的目的史史(Spray)氏法氏法:在皿底一边置焦在皿底一边置焦性没食子酸，另一边置氢氧化性没食子酸，另一边置氢氧化钠溶液，将已接种的平皿翻盖钠溶液，将已接种的平皿翻盖于皿上，并将接合处用胶泥或于皿上，并将接合处用胶泥或石蜡密封完全，然后摇动底部，石蜡密封完全，然后摇动底部，使氢氧化钠溶液与焦性没食子使氢氧化钠溶液与焦性没食子酸混合，置温箱中培养。酸混合，置
8、温箱中培养。厌氧罐厌氧罐anaerobic jar使用时使用时,先装入接种后的培养皿先装入接种后的培养皿,然然后封闭罐盖后封闭罐盖,接着采用抽真空接着采用抽真空-灌灌N2-灌混合气体灌混合气体H2-CO2,驱逐氧驱逐氧气气.最后最后,灌内少量剩余氧又在钯催灌内少量剩余氧又在钯催化剂的作用下化剂的作用下,把灌入的混合气体把灌入的混合气体中的中的H2还原成还原成H2O而除去，从而而除去，从而形成良好的无氧环境形成良好的无氧环境美蓝指示剂：由兰色变成无色美蓝指示剂：由兰色变成无色Anaerobic Glove Box箱内始终充满着成分为箱内始终充满着成分为:N2:CO2:H2=85:5:10的惰性气
9、体的惰性气体并有钯催化剂保证箱内处于高度无氧状态并有钯催化剂保证箱内处于高度无氧状态（一）微生物细胞数目的检测方法（一）微生物细胞数目的检测方法 1.总细胞计数法：总细胞计数法：血球计数板法血球计数板法、涂片计数法、涂片计数法、比浊法比浊法 2.活菌计数法：平板涂布法、倒平板法活菌计数法：平板涂布法、倒平板法 3.滤膜过滤法滤膜过滤法（二）微生物生长量和生理指标的测定方法：湿（二）微生物生长量和生理指标的测定方法：湿重法、干重法、测定细胞的化学成分重法、干重法、测定细胞的化学成分（三）丝状微生物菌丝长度的测定方法（三）丝状微生物菌丝长度的测定方法原理：原理：适用范围：个体较大细胞或适用范围：个
10、体较大细胞或颗粒，如血球、酵母菌等。颗粒，如血球、酵母菌等。特点：快速，准确，在菌悬特点：快速，准确，在菌悬液中加入少量美蓝可以区分液中加入少量美蓝可以区分死活细胞。死活细胞。不适于对运动细不适于对运动细菌的计数菌的计数血球计数法血球计数法原理原理:是在一定是在一定范围内，范围内，菌悬菌悬液中的细胞浓液中的细胞浓度与混浊度成度与混浊度成正比正比，即，即与光与光密度成正比密度成正比，菌数越多，光菌数越多，光密度越大。密度越大。一般测定微生一般测定微生物浓度用的波物浓度用的波长是长是:600nm600nm特点：快速、简便；但易受干扰。特点：快速、简便；但易受干扰。00.511.522.500.20
11、.40.60.81OD值活菌数（亿个/毫升）图示 假单胞菌OD值和活菌数的关系方法：用分光光度计测定一系列已知浓度菌液方法：用分光光度计测定一系列已知浓度菌液的透光度，绘出标准曲线，测定未知菌液的透的透光度，绘出标准曲线，测定未知菌液的透光度，从标准曲线上即可查出该菌液的浓度。光度，从标准曲线上即可查出该菌液的浓度。比浊法应用紫外分光光度计测定应用紫外分光光度计测定ODOD值值涂布平板法涂布平板法倒平板法倒平板法将一定量的菌液中的菌体通过离心或过滤分离出来将一定量的菌液中的菌体通过离心或过滤分离出来,然然后烘干后烘干(干燥温度可采用干燥温度可采用105105、100100过夜过夜)、称重。、称
12、重。一般干重为湿重的一般干重为湿重的10%20%10%20%，一个细菌细胞一般干重约一个细菌细胞一般干重约1010-12-121010-13-13g g。将液体培养液离心将液体培养液离心,收集细胞沉淀物收集细胞沉淀物,然后称重然后称重该法适合菌浓较高的样品。该法适合菌浓较高的样品。测含氮量测含氮量蛋白质是细胞的主要物质，含量稳定，而氮是蛋白质的主蛋白质是细胞的主要物质，含量稳定，而氮是蛋白质的主要成分，通过测含氮量就可推知微生物的浓度。要成分，通过测含氮量就可推知微生物的浓度。根据一定体积培养液中的含氮量再乘以根据一定体积培养液中的含氮量再乘以6.256.25，可测得粗蛋，可测得粗蛋白的含量。
13、白的含量。一般细菌含氮量为干重的一般细菌含氮量为干重的12.5%12.5%，酵母菌为，酵母菌为7.5%7.5%，霉菌为，霉菌为6.0%6.0%，其他方法其他方法含碳、磷、含碳、磷、DNADNA、RNARNA、耗氧量、消耗底物量、产二氧化碳、耗氧量、消耗底物量、产二氧化碳、产酸、产热、粘度等，都可用于生长量的测定。产酸、产热、粘度等，都可用于生长量的测定。微生物生长测定方法比较微生物生长测定方法比较测定细胞数目测定细胞数目方法方法特点与应用特点与应用总细胞数总细胞数血球计数板法血球计数板法 较快速简便，但较费时较快速简便，但较费时活细胞数活细胞数 平皿菌落计数法平皿菌落计数法 简易价廉，但花费时
14、间较长，不能立刻知道结果简易价廉，但花费时间较长，不能立刻知道结果测定物质量测定物质量比浊法比浊法 快速简便，敏感度低，适于不发酵液或液体中的快速快速简便，敏感度低，适于不发酵液或液体中的快速 总细胞数估计，但需事先标定总细胞数估计，但需事先标定细胞湿重法细胞湿重法 较为简便，但含水量不定，准确度差较为简便，但含水量不定，准确度差细胞成分含量法细胞成分含量法 如测定蛋白质、核酸、还原糖的含量等如测定蛋白质、核酸、还原糖的含量等细胞干重法细胞干重法 较为费时，易受颗粒杂质干扰，敏感度低较为费时，易受颗粒杂质干扰，敏感度低环境条件诱导法：环境条件诱导法：变换温度、变换温度、光线、培养基等认为诱导控
15、制光线、培养基等认为诱导控制微生物群体处于同一生长阶段微生物群体处于同一生长阶段选择法选择法：选择性过滤选择性过滤 梯度离心梯度离心原理原理：细菌细胞会紧紧粘附于：细菌细胞会紧紧粘附于硝酸纤维微孔滤膜上。硝酸纤维微孔滤膜上。步骤步骤：菌悬液通过滤膜菌悬液通过滤膜,细胞吸附其细胞吸附其上上 反置滤膜，以新鲜培养液通反置滤膜，以新鲜培养液通过滤膜，洗掉未结合的细胞过滤膜，洗掉未结合的细胞将过滤器放置培养将过滤器放置培养再用培养基洗脱后就可以得再用培养基洗脱后就可以得到刚刚分裂下来的新生细胞，到刚刚分裂下来的新生细胞，即为同步培养。即为同步培养。第二节第二节 微生物的生长微生物的生长生长生长微生物细
16、胞吸收营养物质，进行新陈代谢，生命个体的微生物细胞吸收营养物质，进行新陈代谢，生命个体的重量和体积重量和体积不断增大的过程。不断增大的过程。繁殖繁殖生命个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新的生命生命个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体，即引起生命个体数量增加个体数量增加的生物学过程。的生物学过程。个体生长个体生长微生物细胞个体吸收营养物质，进行新陈代谢，微生物细胞个体吸收营养物质，进行新陈代谢，原原生质与细胞组分的增加生质与细胞组分的增加为个体生长。为个体生长。群体生长群体生长群体中群体中个体数目个体数目的增加。可以用重量、体积、密度的增加。可以用重量、体积、密度
17、或浓度来衡量或浓度来衡量 个体生长个体生长个体繁殖个体繁殖 群体生长群体生长 群体生长群体生长=个体生长个体生长+个体繁殖个体繁殖1 细菌细胞的生长细菌细胞的生长2 酵母细胞的生长酵母细胞的生长3丝状真菌菌丝的生长丝状真菌菌丝的生长一一 微生物的个体生长微生物的个体生长细菌细胞的生长细菌细胞的生长：指新生的细胞长大以及最后：指新生的细胞长大以及最后分裂成为两个子细胞的过程分裂成为两个子细胞的过程酵母的生长指酵母的生长指：细胞体积的增加并在一定的间：细胞体积的增加并在一定的间隔时间发生核和细胞的分裂隔时间发生核和细胞的分裂丝状真菌菌丝的生长丝状真菌菌丝的生长：主要以极性的顶端生长：主要以极性的顶
18、端生长方式进行方式进行酵母细胞的生长酵母细胞的生长1、细胞二分裂生长、细胞二分裂生长图图 2 2 粟酒裂殖酵母的二分裂生长粟酒裂殖酵母的二分裂生长2、细胞出芽生长、细胞出芽生长图图 3 3 酿酒酵母的出芽生长酿酒酵母的出芽生长丝状真菌细胞的顶端生长丝状真菌细胞的顶端生长图图 4 4 丝状真菌菌丝细胞顶端生长模型丝状真菌菌丝细胞顶端生长模型图图 示示 Allomyces macrogynus Allomyces macrogynus 菌丝的顶端生长菌丝的顶端生长为什么要研究微生物群体生长为什么要研究微生物群体生长?因为绝大多数微生物个体微小，个体质因为绝大多数微生物个体微小，个体质量和体积的变化
19、不易观察，所以常是以微生量和体积的变化不易观察，所以常是以微生物的群体作为研究对象，以微生物物的群体作为研究对象，以微生物群体细胞群体细胞的数量或群体细胞物质量的增加的数量或群体细胞物质量的增加作为生长的作为生长的指标。指标。（一）无（一）无分支单细胞微生物的群体生长分支单细胞微生物的群体生长 无分支单细胞微生物主要包括原核生物的无分支单细胞微生物主要包括原核生物的细菌和真核生物的酵母菌细菌和真核生物的酵母菌 它们的群体生长是以群体中微生物细胞数它们的群体生长是以群体中微生物细胞数量的增加来表示的，因而其量的增加来表示的，因而其生长速率就是指单生长速率就是指单位时间内细胞数目或细胞生物量的增加
20、位时间内细胞数目或细胞生物量的增加。细胞呈指数增长示例细胞呈指数增长示例特征特征:每经历一个代时，细胞的数目就增加每经历一个代时，细胞的数目就增加1 1倍，呈指数增加，因而倍，呈指数增加，因而被称为指数生长，这就是无分支单细胞微生物的群体生长特征。被称为指数生长，这就是无分支单细胞微生物的群体生长特征。无分支单细胞微生物的群体生长特征无分支单细胞微生物的群体生长特征1log22log23log2细胞数目的对数细胞数目的对数与生长时间呈正与生长时间呈正比直线关系比直线关系指单位时间的分裂代数指单位时间的分裂代数 世代世代:由一个细胞分裂成为两个细胞的时间间隔由一个细胞分裂成为两个细胞的时间间隔
21、代时（代时（eneration time,G):eneration time,G):一个世代所需的时间就是一个世代所需的时间就是代时，有时也称为代时，有时也称为倍增时间倍增时间例如例如t0时每毫升培养液中细胞数的为时每毫升培养液中细胞数的为104，经过，经过4小时小时后该培养液中细胞数量增加到每毫升后该培养液中细胞数量增加到每毫升108(Nt)，则此条，则此条件该菌的比生长速率为件该菌的比生长速率为：R(logNtlogNo)3.322/tt0(84)3.322/4/小时小时3.322/小时。小时。说明该菌在此条件下，每个细菌以每小时增加说明该菌在此条件下，每个细菌以每小时增加3.322个细菌
22、的速度增加。个细菌的速度增加。生长曲线生长曲线：定量描述液体培养基中微生物群体生长规：定量描述液体培养基中微生物群体生长规律的试验曲线律的试验曲线将少量单细胞的纯培养，接种到一恒定容积的新鲜液体培将少量单细胞的纯培养，接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中，在适宜条件下培养，每隔一定时间取样，测菌细养基中，在适宜条件下培养，每隔一定时间取样，测菌细胞数目。以培养时间为横坐标，以胞数目。以培养时间为横坐标，以细菌增长数目的对数细菌增长数目的对数为为纵坐标，绘制所得的曲线。纵坐标，绘制所得的曲线。生长曲线生长曲线(growth curve)描述细菌生长规律描述细菌生长规律总菌数总菌数活菌数活菌数培养时
23、间培养时间.指数期指数期.稳定期稳定期.衰亡期衰亡期.延滞期延滞期细菌数目（个细菌数目（个/ml）对数）对数缩短延滞期的意义和方法缩短延滞期的意义和方法延滞期延滞期(lag phase)(lag phase)出现原因出现原因本期特点本期特点影响本期限长短因素影响本期限长短因素Cncnc-microNoImage延滞期延滞期出现原因出现原因 把细菌接种到新鲜的培养基中培养时，把细菌接种到新鲜的培养基中培养时，并不立即进行分裂繁殖，细菌增殖数为，并不立即进行分裂繁殖，细菌增殖数为，这时需要这时需要合成多种酶，辅酶，要经过一个调合成多种酶，辅酶，要经过一个调整和适应过程整和适应过程 。Cncnc-m
24、icro生长速率常数等于零生长速率常数等于零菌体粗大菌体粗大 代谢活力强代谢活力强对环境变化较敏感对环境变化较敏感,对不良条件抵抗能力降低对不良条件抵抗能力降低含量增加含量增加,特别是特别是rRNArRNA含量增高含量增高Cncnc-microNoImage延滞期延滞期出现的特点出现的特点菌种菌种：繁殖速度较快的菌种的延迟期一般较短；繁殖速度较快的菌种的延迟期一般较短；接种物菌龄接种物菌龄：用对数生长期的菌种接种时，其延用对数生长期的菌种接种时，其延迟期较短，甚至检查不到延迟期；迟期较短，甚至检查不到延迟期；接种量接种量：接种量增大可缩短甚至消除延迟期接种量增大可缩短甚至消除延迟期培养基成分培
25、养基成分：在营养成分丰富的天然培养基上生长的延滞期比在营养成分丰富的天然培养基上生长的延滞期比在合成培养基上生长时短；在合成培养基上生长时短；接种后培养基成分有较大变化时，会使延滞期加长，接种后培养基成分有较大变化时，会使延滞期加长，应尽量使发酵培养基的成分与种子培养基接近。应尽量使发酵培养基的成分与种子培养基接近。现象：现象：细胞数目以几何级数增加，细胞数目以几何级数增加，其对数与时间呈直线关系。其对数与时间呈直线关系。特点：特点：生长速率常数最大，即代时最短生长速率常数最大，即代时最短细胞进行细胞进行平衡生长平衡生长，群体的大小、，群体的大小、形态、生理特征等比较一致形态、生理特征等比较一
26、致代谢最旺盛代谢最旺盛酶系活跃酶系活跃细胞的化学组成及形态，生理特细胞的化学组成及形态，生理特性比较一致性比较一致x2x1t2t1培养时间培养时间Lg Lg 细胞数细胞数/ml/mlt2 -t13.322(lgx2-lgx1)生长速率常数生长速率常数R=t2 -t13.322(lgx2-lgx1)代时代时G=G=指数指数期生长的数学模型期生长的数学模型繁殖代数繁殖代数 n=3.322(lgx n=3.322(lgx2 2-lgx-lgx1 1)菌种：菌种：不同菌种的代时差异极大不同菌种的代时差异极大 营养成分：营养越丰富，代时越短营养成分：营养越丰富，代时越短 营养物浓度：影响微生物的生长速率
27、和总生长量营养物浓度：影响微生物的生长速率和总生长量 培养温度：影响微生物的生长速率培养温度：影响微生物的生长速率指数期的实践意义指数期的实践意义 是代谢、生理研究的良好材料是代谢、生理研究的良好材料 是增殖噬菌体的最适宿主菌龄是增殖噬菌体的最适宿主菌龄 是发酵生产中用作是发酵生产中用作“种子种子”的最佳种龄的最佳种龄 G G+染色鉴定时采用此期微生物染色鉴定时采用此期微生物影响指数期的因素影响指数期的因素又称：恒定期或最高生长期又称：恒定期或最高生长期产生原因：产生原因：营养物尤其是生长限制因子的耗尽营养物尤其是生长限制因子的耗尽 营养物的比例失调，如碳氮比不合适营养物的比例失调，如碳氮比不
28、合适;有害代谢废物的积累（酸、醇、毒素有害代谢废物的积累（酸、醇、毒素等）等）物化条件（物化条件（pHpH、氧化还原势等）不合、氧化还原势等）不合适适;u活菌数保持相对稳定，总菌数达最高水平。活菌数保持相对稳定，总菌数达最高水平。u细菌代谢物积累达到最高峰。细菌代谢物积累达到最高峰。u芽孢杆菌这时开始形成芽孢。芽孢杆菌这时开始形成芽孢。u这是生产收获时期。这是生产收获时期。1 1）发酵生产形成的重要时期（抗生素、氨基酸等），）发酵生产形成的重要时期（抗生素、氨基酸等），生产上应尽量延长此期，提高产量，措施如下：生产上应尽量延长此期，提高产量，措施如下：补充营养物质（补料）补充营养物质（补料）调
29、调pH pH 调整温度调整温度 2 2）稳定期细胞数目及产物积累达到最高。）稳定期细胞数目及产物积累达到最高。应用意义：应用意义：特点特点：1 细菌死亡数大于增殖数细菌死亡数大于增殖数,活菌数减少活菌数减少 2 细胞的形态发生变化，出现不规则的衰退形细胞的形态发生变化，出现不规则的衰退形 3 释放次生代谢产物，芽孢等释放次生代谢产物，芽孢等 4 菌体开始自溶菌体开始自溶产生原因产生原因：生长条件的进一步恶化，使细胞内的分解：生长条件的进一步恶化，使细胞内的分解代谢大大超过合成代谢，继而导致菌体的死亡代谢大大超过合成代谢，继而导致菌体的死亡丝状微生物包括具分支的原核生物放线菌和真核生丝状微生物包
30、括具分支的原核生物放线菌和真核生物丝状真菌。物丝状真菌。1.丝状微生物群体生长的特征丝状微生物群体生长的特征这类微生物在液体培养基中虽然也可以几乎均匀这类微生物在液体培养基中虽然也可以几乎均匀分布的菌丝悬浮液的方式生长（丝状生长）。但大多分布的菌丝悬浮液的方式生长（丝状生长）。但大多数情况下是以分散的沉淀物方式在发酵液中出现（沉数情况下是以分散的沉淀物方式在发酵液中出现（沉淀生长），沉淀物形态从松散的絮状沉淀到堆集紧密淀生长），沉淀物形态从松散的絮状沉淀到堆集紧密的菌丝球不等。的菌丝球不等。图示丝状真菌的沉淀生长1 1、生长停滞期、生长停滞期:造成生长停滞的原造成生长停滞的原因一是孢子萌发前真
31、正的停滞状态，因一是孢子萌发前真正的停滞状态，另一种是生长已经开始，但还无法测另一种是生长已经开始，但还无法测定。定。2 2、迅速生长期、迅速生长期:菌丝体干重迅速增加，菌丝体干重迅速增加，菌丝干重不以几何级数增加，没有对菌丝干重不以几何级数增加，没有对数生长期。生长主要表现在菌丝尖端数生长期。生长主要表现在菌丝尖端的伸长和出现分支、断裂等，此时期的伸长和出现分支、断裂等，此时期的菌体呼吸强度达到高峰，有的开始的菌体呼吸强度达到高峰，有的开始积累代谢产物。积累代谢产物。3 3、衰退期、衰退期:菌丝体干重下降，到一定菌丝体干重下降，到一定时期不再变化。大多数次级代谢产物时期不再变化。大多数次级代
32、谢产物在此期合成，大多数细胞都出现大的在此期合成，大多数细胞都出现大的空泡。有些菌丝体还会发生自溶菌丝空泡。有些菌丝体还会发生自溶菌丝体，这与菌种和培养条件有关。体，这与菌种和培养条件有关。连续培养连续培养：如果在培养器中不断补充新鲜营养物质，如果在培养器中不断补充新鲜营养物质，并及时不断地以同样速度排出培养物并及时不断地以同样速度排出培养物(包括菌体及代谢包括菌体及代谢产物产物)，理论上讲，对数生长期就可无限延长。，理论上讲，对数生长期就可无限延长。这种方法就叫连续培养法。这种方法就叫连续培养法。此法已成为当前发酵工业的发展方向此法已成为当前发酵工业的发展方向优点：缩短发酵周期；便于自动控制
33、；产物质量均一优点：缩短发酵周期；便于自动控制；产物质量均一 缺点：菌种易退化；易染杂菌缺点：菌种易退化；易染杂菌原理：当微生物在单批培养方式下生长达到对数期后期时，原理：当微生物在单批培养方式下生长达到对数期后期时，一方面以一定的速度流进新鲜培养基并搅拌，另一方面以溢流一方面以一定的速度流进新鲜培养基并搅拌，另一方面以溢流方式流出培养液，使培养物达到动态平衡，其中的微生物就能方式流出培养液，使培养物达到动态平衡，其中的微生物就能长期保持对数期的长期保持对数期的平衡生长状态和稳定的生长速平衡生长状态和稳定的生长速率率。单批培养单批培养 恒浊法恒浊法恒化法恒化法 单批培养单批培养连续培养连续培养
34、时间时间连续流入连续流入新鲜培养液新鲜培养液lg细胞数（个细胞数（个/ml）连续培养连续培养 恒化器恒化器恒浊器恒浊器连续培养的类型连续培养的类型概念概念：以：以恒定流速恒定流速使使营养物质浓度恒定营养物质浓度恒定而保持细菌而保持细菌生长速率恒定的方法。生长速率恒定的方法。原理原理：通过控制某一种营养物浓度（如碳、氮源、通过控制某一种营养物浓度（如碳、氮源、生长因子等）生长因子等），使其始终成为生长限制因子，而，使其始终成为生长限制因子，而达到控制达到控制培养液流速保持不变培养液流速保持不变，并使微生物始终在，并使微生物始终在低于其最高生长速率条件下进行生长繁殖。低于其最高生长速率条件下进行生
35、长繁殖。特点：特点：维持营养成分的亚适量，控制微生物生长速维持营养成分的亚适量，控制微生物生长速率。菌体生长速率恒定，菌体均一、密度稳定，产率。菌体生长速率恒定，菌体均一、密度稳定，产量低于最高菌体产量。量低于最高菌体产量。应用范围应用范围：实验室科学研究实验室科学研究概念概念：通过调节培养基流速，通过调节培养基流速，使培养液浊度保持恒定的连续使培养液浊度保持恒定的连续培养方法。培养方法。原理原理：通过调节新鲜培养基流通过调节新鲜培养基流入的速度和培养物流出的速度入的速度和培养物流出的速度来维持来维持菌浓度不变菌浓度不变,即浊度不变。即浊度不变。当浊度高时，使新鲜培养基的当浊度高时，使新鲜培养
36、基的流速加快，浊度降低，则减慢流速加快，浊度降低，则减慢培养基的流速。培养基的流速。特点：特点：基质过量，微生物始终基质过量，微生物始终以以最高速率最高速率进行生长，并可在进行生长，并可在允许范围内控制不同的菌体密允许范围内控制不同的菌体密度；度；使用范围使用范围：用于生产大量菌用于生产大量菌体、生产与菌体生长相平行体、生产与菌体生长相平行的某些代谢产物，如乳酸、的某些代谢产物，如乳酸、乙醇等。乙醇等。单批培养单批培养 恒浊法恒浊法恒化法恒化法 单批培养单批培养连续培养连续培养时间时间连续流入连续流入新鲜培养液新鲜培养液lg细胞数（个细胞数（个/ml）连续培养连续培养 温度对微生物的影响具体表
37、现在温度对微生物的影响具体表现在：u影响酶活性，温度变化影响酶促反应速率，最终影响酶活性，温度变化影响酶促反应速率，最终影响细胞合成。影响细胞合成。u影响细胞膜的流动性，温度高，流动性大，有利影响细胞膜的流动性，温度高，流动性大，有利于物质的运输，温度低，流动性降低，不利于物质于物质的运输，温度低，流动性降低，不利于物质运输，因此，温度变化影响营养物质的吸收与代谢运输，因此，温度变化影响营养物质的吸收与代谢产物的分泌。产物的分泌。u影响物质的溶解度，对生长有影响。影响物质的溶解度，对生长有影响。第三节第三节 环境因素对微生物生长的影响环境因素对微生物生长的影响处于最适生长温度处于最适生长温度时
38、，生长速度最快，时，生长速度最快，代时最短。代时最短。超过最低生长温度超过最低生长温度时，微生物不生长，时，微生物不生长，温度过低，甚至会温度过低，甚至会死亡。死亡。超过最高生长温度超过最高生长温度时，微生物不生长，时，微生物不生长，温度过高，甚至会温度过高，甚至会死亡。死亡。根据微生物的最适生长温度的不同，可将微生物划为根据微生物的最适生长温度的不同，可将微生物划为5个类型：个类型：Temperature effect:1.嗜冷微生物嗜冷微生物Psychrophile (0-20oC)2 耐冷微生物耐冷微生物Psychrotrophs(2-35oC)3.嗜温微生物嗜温微生物Mesophile
39、 (15-45oC)4.嗜热微生物嗜热微生物Thermophile (45-80oC)5.嗜高温微生物嗜高温微生物Hyperthermophile (65-105oC)(1)(1)嗜冷微生物（嗜冷微生物（psychrophilepsychrophile）最低生长温度最低生长温度0 以下，以下，最适生长温度最适生长温度 15，最高生长温度最高生长温度20左右；（地球两极，海洋深处）左右；（地球两极，海洋深处）酶系在低温下仍能起催化作用酶系在低温下仍能起催化作用其酶的二级结构含有较其酶的二级结构含有较多的多的 螺旋，能使酶蛋白在寒冷环境中有较强的弹性螺旋，能使酶蛋白在寒冷环境中有较强的弹性细胞膜的
40、脂类中不饱和脂肪酸的含量较高，在低温下细胞膜的脂类中不饱和脂肪酸的含量较高，在低温下膜也能保持半流动状态。膜也能保持半流动状态。嗜冷机制：嗜冷机制：能在能在0 0 生长，但最适生长温度生长，但最适生长温度 2040 2040 冷水，土壤，引起冰箱食物腐败的主要微生物类冷水，土壤，引起冰箱食物腐败的主要微生物类群群（3）嗜温微生物）嗜温微生物(mesophiles)，又称中温菌，又称中温菌 最低生长温度最低生长温度1010左右，最适生长温度左右，最适生长温度 25 25 37 37，最高生长温度，最高生长温度4545左右（大多数微生物，左右（大多数微生物，人类病原菌）。人类病原菌）。(4)(4)
41、嗜热微生物（嗜热微生物（thermophilesthermophiles）最低生长温度最低生长温度45 45，最适生长温度，最适生长温度 5060 5060，最高生长温度，最高生长温度8080（大部分为细菌。温泉，堆肥）（大部分为细菌。温泉，堆肥）（5 5）嗜高温微生物（）嗜高温微生物（hyperthermophileshyperthermophiles）最低生长温度最低生长温度65 65，最适生长温度，最适生长温度 8090 8090，最高生长温度，最高生长温度100100以上（古生菌，热泉、火山喷气口、海底火山喷气口）以上（古生菌，热泉、火山喷气口、海底火山喷气口）胞内酶和蛋白质在高温时更
42、稳定（分子中胞内酶和蛋白质在高温时更稳定（分子中1个或多个部位被某些氨个或多个部位被某些氨基酸所取代，能以特殊的方式折叠，抵抗温度的变性作用）基酸所取代，能以特殊的方式折叠，抵抗温度的变性作用）;细胞质膜富含饱和脂肪酸，因而膜在高温下仍很稳定并发挥功能细胞质膜富含饱和脂肪酸，因而膜在高温下仍很稳定并发挥功能;其核酸有热稳定性的结构，其核酸有热稳定性的结构，tRNAtRNA在特定的碱基区域含较多在特定的碱基区域含较多GCGC对对.嗜热机制嗜热机制根据微生物与氧的关系根据微生物与氧的关系,可把它们分为几可把它们分为几种类群种类群:专性好氧菌专性好氧菌:A:A 好氧菌好氧菌 微好氧菌：微好氧菌：D
43、D 兼性好氧菌兼性好氧菌C C 耐氧厌氧菌：耐氧厌氧菌：E E 厌氧菌厌氧菌 (专性专性)厌氧菌厌氧菌B B：专性好氧菌（专性好氧菌（strict aerobe）在有分子氧的条件下才能生长，有完整的呼吸链，以在有分子氧的条件下才能生长，有完整的呼吸链，以分子氧作为最终氢受体，细胞含有超氧物歧化酶（分子氧作为最终氢受体，细胞含有超氧物歧化酶（SODSOD，superoxide dismutasesuperoxide dismutase）和过氧化氢酶。）和过氧化氢酶。在有氧或无氧条件下均能生长，但有氧情况下生长得在有氧或无氧条件下均能生长，但有氧情况下生长得更好，在有氧时靠呼吸产能，无氧时接发酵或
44、无氧呼吸产更好，在有氧时靠呼吸产能，无氧时接发酵或无氧呼吸产能；细胞含有能；细胞含有SODSOD和过氧化氢酶。和过氧化氢酶。只能较低的氧分压下才能正常生长，通过呼吸链并以只能较低的氧分压下才能正常生长，通过呼吸链并以氧为最终氢受体而产能，氧为最终氢受体而产能，兼性好氧菌（兼性好氧菌（facultative aerobe）耐氧菌（耐氧菌（aerotolerant anaerobe）可在分子氧存在下进行厌氧生活的厌氧菌。生活不需要可在分子氧存在下进行厌氧生活的厌氧菌。生活不需要氧，分子氧也对它无毒害。不具有呼吸链，依靠专性发酵获氧，分子氧也对它无毒害。不具有呼吸链，依靠专性发酵获得能量。细胞内存在
45、得能量。细胞内存在SODSOD和过氧化物酶，但缺乏过氧化氢酶。和过氧化物酶，但缺乏过氧化氢酶。严格厌氧微生物并不是被气态的氧所杀死，而是由于不能解除严格厌氧微生物并不是被气态的氧所杀死，而是由于不能解除某些氧代谢产物的毒性而死亡。某些氧代谢产物的毒性而死亡。在氧还原为水的过程中，可形成某些有毒的中间产物，例如，在氧还原为水的过程中，可形成某些有毒的中间产物，例如，过氧化氢（过氧化氢（H H2 2O O2 2）、超氧阴离子（）、超氧阴离子（O O2 2 ）等。超氧阴离子为活性）等。超氧阴离子为活性氧，兼有分子和离子的性质，反应力极强，极不稳定，可破坏膜氧，兼有分子和离子的性质，反应力极强，极不稳
46、定，可破坏膜和重要生物大分子，对微生物造成毒害或致死。和重要生物大分子，对微生物造成毒害或致死。好氧微生物具有降解这些产物的酶，如过氧化氢酶、过氧化物好氧微生物具有降解这些产物的酶，如过氧化氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶等，酶、超氧化物歧化酶等，而严格厌氧菌缺乏而严格厌氧菌缺乏SODSOD，故易被生物体内极易产生的超氧阴离，故易被生物体内极易产生的超氧阴离子自由基毒害致死。子自由基毒害致死。H2O+O22 O2 +2H+O2+H2O22H2OO O2 2+e+eO O2 2(OO2 2 )超氧阴离子在细胞内可由酶促或非酶促形成。超氧阴离子在细胞内可由酶促或非酶促形成。超氧阴离子自由基超氧阴离
47、子自由基O2 普遍存在普遍存在。生物体中超氧阴离子的形成与去除生物体中超氧阴离子的形成与去除12SOD好氧生物好氧生物和耐氧细菌和耐氧细菌过氧化氢酶过氧化氢酶 好氧生物好氧生物过氧化物酶过氧化物酶 NADH2NAD耐氧菌耐氧菌在培养不同类型的微生物时，要采用相应的措施保证不同在培养不同类型的微生物时，要采用相应的措施保证不同微生物的生长。微生物的生长。培养好氧微生物：培养好氧微生物：需震荡或通气，保证充足的氧气需震荡或通气，保证充足的氧气。培养专性厌氧微生物培养专性厌氧微生物：需排除环境中的氧气，同时需排除环境中的氧气，同时 在培养基中添加还原剂，降低在培养基中添加还原剂，降低 培养基中的氧化
48、还原电位势。培养基中的氧化还原电位势。培养兼性厌氧或耐氧微生物培养兼性厌氧或耐氧微生物：可深层静止培养。可深层静止培养。培养措施培养措施 微生物的活动也能改变环境中的微生物的活动也能改变环境中的PHPH值值大多数细菌等电点的大多数细菌等电点的pH值为值为34，而水中细菌细胞，而水中细菌细胞表面电荷的性质受表面电荷的性质受pH值控制，即水的值控制，即水的pH值低于细值低于细菌等电点时，细菌细胞表面带正电荷，反之则带负菌等电点时，细菌细胞表面带正电荷，反之则带负电荷电荷 一些微生物生长的一些微生物生长的pHpH值范围值范围2.分类分类：嗜酸性微生物（嗜酸性微生物（pH5.4）嗜中性微生物（嗜中性微
49、生物（pH5.4pH8.5）嗜碱性微生物（嗜碱性微生物（pH7.0 pH11.5）嗜酸或嗜碱微生物耐酸或耐碱的原因：嗜酸或嗜碱微生物耐酸或耐碱的原因：四四 比生长速率与底物浓度比生长速率与底物浓度莫诺经验公式表示比生长速率与生长基质浓度之间的关系莫诺经验公式表示比生长速率与生长基质浓度之间的关系:u=umax(S/Ks+S)Umax:最大生长速率最大生长速率：生长的基质浓度：生长的基质浓度s:比生长速率为最大生长速率一半时的基质浓度比生长速率为最大生长速率一半时的基质浓度同一种基质中同一种基质中s是一个常数它通常值很小是一个常数它通常值很小当很高时，当很高时，s可以忽略不计可以忽略不计Ks+S
50、此时此时u=umax如对数期如对数期当当很低时，很低时，Ks+SKs此时此时u=umaxS/Ks总生长量总生长量总生长量代表在某一时间内，通过培养所获得的微生物总生长量代表在某一时间内，通过培养所获得的微生物总量与原来接种的微生物量之差值，它的大小客观上也总量与原来接种的微生物量之差值，它的大小客观上也反映了培养基与生长条件是否适合于菌的生长反映了培养基与生长条件是否适合于菌的生长产量常数（产量常数（Y）总生长量所消耗基质的总量）总生长量所消耗基质的总量Ytt Y值大小代表微生物对基质同化的效率，反映了微值大小代表微生物对基质同化的效率，反映了微生物利用某种基质生长的效果，因此在生产实践中生物
