1、微生物的应用微生物的应用土壤中微生物的分离与计数土壤中微生物的分离与计数实验设计一实验设计一实验目的：实验目的：（1）从土壤中能分离出能够分解尿素的细菌）从土壤中能分离出能够分解尿素的细菌（2）统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细）统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌菌实验原理：实验原理：（1）尿素）尿素CO（NH2）2，可以被含有脲酶的微生物降解，可以被含有脲酶的微生物降解，降解成氨后可以被植物吸收，是重要的农田氮肥降解成氨后可以被植物吸收，是重要的农田氮肥（2）尿素略呈中性，如果被分解将产生）尿素略呈中性，如果被分解将产生NH3，溶液略呈碱性溶液略呈碱性（3）尿素高温、高压下会被降解
2、）尿素高温、高压下会被降解过滤灭菌：使用过滤灭菌：使用0.22m 0.22m 孔径过滤器孔径过滤器尿素的灭菌可供参考的资料可供参考的资料v资料资料1：土壤是：土壤是“微生物的天然培养基微生物的天然培养基”，土壤，土壤中的微生物大约中的微生物大约70%90%是细菌，主要分布是细菌，主要分布在距地表约在距地表约38cm的土壤层的土壤层v资料资料2：样品稀释程度直接影响平板上生长的菌：样品稀释程度直接影响平板上生长的菌落数，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养落数，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在，以保证获得菌落数在30300之间，适于计数之间，适于计数的平板的平板v资料资料
3、3：不同微生物需要不同的培养温度和时间：不同微生物需要不同的培养温度和时间，细菌一般在，细菌一般在3037的温度下培养的温度下培养12d；放线菌一般在放线菌一般在2528温度下培养温度下培养57d；而；而霉菌一般在霉菌一般在2528的温度下培养的温度下培养34d；定；定期观察菌落的形态期观察菌落的形态 特征包括菌落的形状、大小、特征包括菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等，统计并记录数据隆起程度和颜色等，统计并记录数据可以参考的实验用具可以参考的实验用具可供使用的实验技术可供使用的实验技术v1.培养基的制备技术培养基的制备技术v2.无菌操作技术无菌操作技术v3.接种技术接种技术v4.培养技术培养
4、技术v5.微生物的数量统计技术（计数）：在统微生物的数量统计技术（计数）：在统计菌落数目时，常用来统计样品中活菌数计菌落数目时，常用来统计样品中活菌数目的方法是目的方法是 稀释涂布平板法稀释涂布平板法。除此之外，。除此之外，显微镜直接计数显微镜直接计数 也是测定微生物数量的常也是测定微生物数量的常用方法。用方法。稀释涂布计数法稀释涂布计数法v采用稀释涂布平板法统计菌落数目时，培养基表采用稀释涂布平板法统计菌落数目时，培养基表面生长的一个菌落，来源于面生长的一个菌落，来源于 样品稀释液中一个活样品稀释液中一个活菌菌。通过统计。通过统计 平板上的菌落数平板上的菌落数，就能推测出样，就能推测出样品中
5、大约含有多少活菌。为了保证结果准确，一品中大约含有多少活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数在般选择菌落数在 30300 的平板进行计数的平板进行计数v从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数的从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数的计算方法是计算方法是（平均菌落数（平均菌落数涂布的稀释液体涂布的稀释液体积）积）稀释倍数稀释倍数。v利用稀释涂布平板法成功统计菌落数目的利用稀释涂布平板法成功统计菌落数目的关键是关键是 恰当的稀释度恰当的稀释度。显微直接计数法显微直接计数法v又称为血球计数板直接计数又称为血球计数板直接计数v观察到的红细胞平均数观察到的红细胞平均数 观察到的细菌平均数观察到的细菌
6、平均数红细胞含量红细胞含量 细菌含量细菌含量血球计数板，通常是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台。中间的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网。如左图。显微直接计数法显微直接计数法（血球计数板直接计数）血球计数板直接计数）v 每个方格网共分九个大方格，中间的大每个方格网共分九个大方格，中间的大方格即为计数室，微生物的计数就在计方格即为计数室，微生物的计数就在计数室中进行。计数室构造如左图。数室中进行。计数室构造如左图。v 计数室的刻度一般有两种规格，一种计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成是一个大方格分成2525个中方格，而每个个中方格，而每个中方格又分成
7、中方格又分成1616个小方格；另一种是一个小方格；另一种是一个大方格分成个大方格分成1616个中方格，而每个中方个中方格，而每个中方格又分成格又分成2525个小方格。但无论是哪种规个小方格。但无论是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方格格的计数板，每一个大方格中的小方格数都是相同的，即数都是相同的，即161625=40025=400小方格，小方格，如左图。如左图。计数室血球计数板25161625v 每一个大方格边长为每一个大方格边长为l mml mm，则每一大方格的面积，则每一大方格的面积为为l mm l mm 2 2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高
8、度为高度为0.1 mm0.1 mm，所以计数室的容积为，所以计数室的容积为0.1 mm0.1 mm3 3。v设五个中方格中总菌数为设五个中方格中总菌数为A A，菌液稀释倍数为，菌液稀释倍数为B B，那么，一个大方格中的总菌数那么，一个大方格中的总菌数(即即0.1mm0.1mm3 3中的总菌中的总菌数数)为为A/5A/52525B B。因为因为:1 ml=lc m:1 ml=lc m3 3=1 000mm=1 000mm3 3，故，故:l ml:l ml菌液中的菌液中的总菌数为：总菌数为：可供参考的实验流程可供参考的实验流程可供参考的实验流程可供参考的实验流程请依据实验请依据实验目的、原理目的、
9、原理和可供参考和可供参考的资料和实的资料和实验流程进行验流程进行实验设计并实验设计并将方案写在将方案写在学案的相应学案的相应位置位置实验设计方案实验设计方案v土壤微生物种类最多、数量最大的原因是什么？土壤微生物种类最多、数量最大的原因是什么？土壤中营养物质含量丰富，环境条件适宜等。土壤中营养物质含量丰富，环境条件适宜等。v29 实验过程：实验过程：1）取土样用的小铁铲和盛土样）取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要的的信封在使用前都要灭菌灭菌。2）应在）应在火焰火焰旁称旁称取土壤取土壤 10 g。将称好的土样倒入盛有。将称好的土样倒入盛有90mL无无菌水的菌水的锥形瓶锥形瓶中，塞好棉塞。
10、中，塞好棉塞。3）在稀释土壤溶）在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在液的过程中，每一步都要在火焰火焰旁进行。旁进行。4）实）实验时要对验时要对培养皿培养皿作好标记。注明作好标记。注明培养基类型、培培养基类型、培养时间、稀释度、培养物养时间、稀释度、培养物等。等。5）为了提高效率）为了提高效率，在操作时更加有条不紊，应当，在操作时更加有条不紊，应当事先规划时间事先规划时间。结果分析和评价结果分析和评价v对分离的菌种作进一步的鉴定，还需要借对分离的菌种作进一步的鉴定，还需要借助助 生物化学生物化学 的方法。的方法。32在细菌分解在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的尿素的化学反应中，细菌合成的 脲
11、酶脲酶 将尿将尿素分解成了素分解成了 氨氨。氨会使培养基的碱性。氨会使培养基的碱性 增增强强，PH 升高升高。因此，我们可以通过检测。因此，我们可以通过检测培养基培养基 pH 变化来判断该化学反应是否发变化来判断该化学反应是否发生。生。33在以在以 尿素尿素 为唯一氮源的培养为唯一氮源的培养基中加入基中加入 酚红酚红 指示剂。培养某种细菌后，指示剂。培养某种细菌后，如果如果PH升高，指示剂将变升高，指示剂将变 红红，说明该细，说明该细菌能够菌能够 分解尿素分解尿素。设计过程中应思考的问题设计过程中应思考的问题v1.如何进行实验设计如何进行实验设计v2.设计时为了避免一些无关实验因素设计时为了避
12、免一些无关实验因素对于实验可信度的影响，我们该采取对于实验可信度的影响，我们该采取怎样的措施？怎样的措施？v3.在对菌落进行计数时，为了避免一在对菌落进行计数时，为了避免一次实验的偶然性，我们该采取怎样的次实验的偶然性，我们该采取怎样的方法以减少误差？方法以减少误差？设置对照实验设置对照实验v设置对照的主要目的是设置对照的主要目的是排除实验排除实验组中非测试因素对实验结果的影响组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度，提高实验结果的可信度。v对照实验是指除了对照实验是指除了 被测试被测试 的条的条件外，其他条件都件外，其他条件都 相同相同 的实验。的实验。满足该条件的称为满足该条件
13、的称为 对照对照组，未满组，未满足该条件的称为足该条件的称为 实验实验 组。组。配制培养基配制培养基v尿素培养基（尿素培养基（1L）葡萄糖葡萄糖 10g NaCl 4.8g K2HPO4 4.8g 琼脂琼脂 20g 酚红酚红 0.01g 尿素尿素 2g LB培养基（培养基（1L）蛋白胨：蛋白胨：10g 酵母粉：酵母粉：5g NaCl：10g 琼脂：琼脂：20g 对照组对照组选择培养基选择培养基实验组实验组（1 1）进行微生物的分离和培养。研究培养）进行微生物的分离和培养。研究培养 基对微生物的选择作用。基对微生物的选择作用。（2 2）利用特定指示剂对微生物进行鉴定。）利用特定指示剂对微生物进行
14、鉴定。（3 3）讨论微生物的利用。）讨论微生物的利用。操操作作流流程程及及示示意意图图v1 1 培养基的制备及灭菌培养基的制备及灭菌v2 2 准备器皿和材料准备器皿和材料v3 3 采集土样采集土样v1.1.称取待测液样品土称取待测液样品土l0gl0g，放入装有，放入装有90ml90ml无菌水无菌水的的250ml250ml三角瓶中，振荡三角瓶中，振荡2020分钟，使细胞分散，分钟，使细胞分散，静置静置20302030秒，即成秒，即成1010-1-1稀释液。稀释液。v2.2.再用再用1ml1ml移液器，移液器，吸取吸取1010-1-1稀释液稀释液1ml1ml，移入装，移入装有有9ml9ml无菌试管
15、，即成无菌试管，即成1010-2-2稀释液。再换一支无菌稀释液。再换一支无菌枪头取枪头取1010-2-2稀释液稀释液1ml 1ml，移入装有，移入装有9ml9ml无菌水的试无菌水的试管，摇匀，即成管，摇匀，即成1010-3-3稀释液。以次类推，连续稀稀释液。以次类推，连续稀释，制成释，制成1010-4-4稀释液。稀释液。土壤稀释液的制备土壤稀释液的制备实验拓展练习题练习题1 1、选择培养基：在微生物学中，将允许、选择培养基：在微生物学中，将允许 种类的微生物种类的微生物生长，同时生长，同时 和和 其他种类微生物生长的培养基，称作其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。选择培养基。阻止阻止
16、特定特定抑制抑制2 2、常用稀释涂布平板法来统计样品中活菌的数目。当样品、常用稀释涂布平板法来统计样品中活菌的数目。当样品的的 足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个于样品稀释液中的一个 。通过统计平板上的菌落数，。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为了保证结果准确，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数在一般选择菌落数在 的平板进行计数。此外，测定的平板进行计数。此外，测定微生物数量的常用方法还有微生物数量的常用方法还有 直接计数。直接计数。显微镜显微镜 稀释度稀释度细菌细菌30
17、-30030-3003 3、在同一稀释度下，至少对、在同一稀释度下，至少对3 3个平板进行重复计数，然后个平板进行重复计数，然后求出求出 ，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。细菌的数目。平均数平均数 4 4、用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀、用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为释倍数为10106 6的培养基中得到以下几种统计结果，正确的是的培养基中得到以下几种统计结果，正确的是 A A涂布了一个平板，统计的菌落数是涂布了一个平板，统计的菌落数是230230 B B涂布了两个平板，统计的菌落数是涂布了
18、两个平板，统计的菌落数是215215和和260260，取平均值，取平均值238238 C C涂布了三个平板，统计的菌落数分别是涂布了三个平板，统计的菌落数分别是2121、212212和和256256，取，取平均值平均值163163 D D涂布了三个平板，统计的菌落数分别是涂布了三个平板，统计的菌落数分别是2l02l0、240240和和250250，取，取平均值平均值233233D 5.5.在做分离分解尿素的细菌实验时，在做分离分解尿素的细菌实验时，A A同学从对应同学从对应10106 6培养基上培养基上筛选出大约筛选出大约150150个菌落，而其他同学只选择出大约个菌落，而其他同学只选择出大约5050个菌落。个菌落。A A同学的结果产生原因可能有同学的结果产生原因可能有()()由于土样不同由于土样不同 由于培养基污染由于培养基污染 由于操作失误由于操作失误 没有设置对照没有设置对照 A A B B C C D DA
