1、-1第五讲 代谢组学-2植物产生次生代谢物适应不良自然环境 Pollination and seed dispersalScentsColoursFlavours Chemical defencePestsPathogensAllelopathy-3次生代谢与植物发育有着不可分割的联系薄荷薄荷Glandular trichomes百里香百里香Trichomes monoterpenes and sesquiterpenes柠檬柠檬Secretory cavity-4次生代谢物是很多中药的主要成分Traditional Chinese MedicinesNatural products as d
2、rugs-5人体需要的特殊营养物质主要来源于植物人体需要的特殊营养物质主要来源于植物异黄酮异黄酮(植物雌激素植物雌激素)维生素维生素 E 叶酸叶酸b-胡萝卜素胡萝卜素-6维生素A缺乏导致眼睛疾病。我国儿童VA缺乏率达9.3%维生素C缺乏导致坏血病维生素缺乏导致人体多种疾病的发生维生素E缺乏导致皮肤病、早衰等叶酸缺乏导致新生儿神经系统疾病、贫血等-7生长发育适应不良环境人体必需营养成分药用化合物b-胡萝卜素GA1BrStrigolactone植物萜类代谢物具有重要功能和作用-8主要内容代谢组学的概念代谢组学的应用代谢组学的主要研究方法-9TraitsDNARNAProteinsMetabolit
3、esNH2OHOOHOHOHOHOHOOHPhenomicsGenomicsGenomicsTranscriptomicsTranscriptomicsProteomicsProteomics MetabolomicsMetabolomics -10代谢组的概念细胞内的生命活动均以代谢为基础，代谢物的变化可更直接反映细胞所处的环境，如营养状态、药物作用和环境改变等。Metabolome：代谢组，指一个细胞、组织或器官中,所有代谢产物的集合,一般指分子量小于1000D的物质。-11代谢组学的概念Metabolomics：在新陈代谢的动态进程中,系统地研究代谢产物的变化规律,揭示机体生命活动代谢本
4、质的科学。-12代谢组学的发展过程 代谢组学的研究可以追溯至上世纪80年代。1970s代谢轮廓分析(Metabolic profiling),Devaux等人于上世纪70 年代提出。1985年,Nicholson研究小组利用核磁共振(NMR)技术分析大鼠的尿液,意识到这可能是生命科学研究的巨大突破。1986 年,Journal of Chromatography A 出版了一期关于Metabolic profiling 的专辑。90 年代后期,随着基因组学的提出和迅速发展,Oliver 于1997 年提出了代谢组学(metabolomics)的概念,之后很多植物化学家开展了这方面的研究。-13
5、代谢组学的创建 普遍认为代谢组学的概念是英国帝国理工大学的Nicholson教授于1999年首先提出来的。Nicholson因为他在代谢组学发展上的开拓性贡献，被学术界公认为代谢组学创始人（代谢组学之父）。Nicholson JK,Lindon JC,Holmes E(November 1999).Metabonomics:understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological
6、 NMR spectroscopic data.Xenobiotica 2929(11):11819-14 1999 年Jeremy K.Nicholson 等人提出metabonomics 的概念,并在疾病诊断、药物筛选等方面做了大量的卓有成效的工作,使得代谢组学得到了极大的充实,同时也形成了当前代谢组学的两大主流领域：metabolomics 和metabonomics。metabolomics 是通过考察生物体系受刺激或扰动后(如将某个特定的基因变异或环境变化后)代谢产物的变化或其随时间的变化,来研究生物体系的代谢途径的一种技术。metabonomics 是生物体对病理生理刺激或基因修饰
7、产生的代谢物质的质和量的动态变化的研究。前者一般以细胞做研究对象,后者则更注重动物的体液和组织。-15代谢组学与其他组学关系 基因组学主要研究生物系统的基因结构组成,即DNA 的序列及表达。蛋白组学研究由生物系统表达的蛋白及由外部刺激引起的差异。代谢组学是研究生物体系(细胞,组织或生物体)受外部刺激所产生的所有代谢产物的变化。基因组学和转录组学告诉你可能发生什么。基因组学和转录组学告诉你可能发生什么。蛋白质组学告诉你如何发生什么。蛋白质组学告诉你如何发生什么。代谢组学告诉你已经发生了什么。代谢组学告诉你已经发生了什么。-16 基因组的变化不一定能够得到表达，从而并不一定对系统产生影响；某些蛋白
8、的浓度会由于外部条件的变化而升高，但由于这个蛋白可能不具备活性，从而也不对系统产生影响；由于基因或蛋白的功能补偿作用，某个基因或蛋白的缺失会由于其他基因或蛋白的存在而得到补偿，最后反应的净结果为零；小分子的产生和代谢才是这一系列事件的最终结果，它能够更准确的反映生物体系的状态。代谢组学是代谢组学是“组学组学”研究的最终方向研究的最终方向-17-18代谢组学优点 1)基因和蛋白表达的有效的微小变化会在代谢物上得到放大,从而使检测更容易；2)代谢组学的技术不需建立全基因组测序的数据库；3)代谢物的种类要远小于基因和蛋白的数目。每个生物体(organism)中代谢产物大约在10数量级,而最小的细菌,
9、其基因组中也有几千个基因；4)因为代谢产物在各个生物体系中都是类似的,所以代谢组学研究中采用的技术更通用。-19生物体系的代谢产物分析的四个层次 1)代谢物靶标分析(Metabolite target analysis):对某个或某几个特定组分的分析;2)代谢轮廓/谱分析(Metabolic profiling analysis):对一系列少数预设的一些代谢产物的定量分析。如某一类结构、性质相关的化合物(氨基酸、有机酸、顺二醇类)或某一代谢途径的所有中间产物或多条代谢途径的标志性组分析;3)代谢组学(Metabolomics):对某一生物体或细胞在（限定条件下的特定生物样品中）所有代谢组分的定
10、性和定量;4)代谢物指纹分析(Metabolic fingerp-rinting):不分离鉴定具体单一组分,而是对样品进行高通量的快速定性分析。真正意义的代谢组学研究。真正意义的代谢组学研究。预处理和检测技术需满足高预处理和检测技术需满足高灵敏度、高选择性和高通量灵敏度、高选择性和高通量的要求。需要对获得的数据的要求。需要对获得的数据进行解析。进行解析。-20代谢组学的内容和特点代谢组学的内容和特点代谢组学的研究技术代谢组学的研究技术 核心技术是对不同状态下基因表达的不同核心技术是对不同状态下基因表达的不同代谢产物进行比较代谢产物进行比较 代谢物群矩阵代谢物群矩阵clique-metaboli
11、te matricesclique-metabolite matrices 单一代谢物单一代谢物首先被鉴定出来，然后在不同的代谢物组首先被鉴定出来，然后在不同的代谢物组中寻找相关性；中寻找相关性；这些既独立又相关的代谢物被用来这些既独立又相关的代谢物被用来鉴定代谢途径鉴定代谢途径，寻，寻找在已经受到影响的情况下植物的找在已经受到影响的情况下植物的代谢网络代谢网络，而这些，而这些网络途径则用来测定和研究更加广泛的生物学反应和网络途径则用来测定和研究更加广泛的生物学反应和基因功能。基因功能。-21代谢组学的内容和特点代谢组学的内容和特点 局限性：局限性：不能将生物体所有的代谢产物全面涵盖，活的生物
12、体的内在生物学变化，不能将生物体所有的代谢产物全面涵盖，活的生物体的内在生物学变化，大多实验仪器存在动力学局限性，导致代谢物的化学复杂性大多实验仪器存在动力学局限性，导致代谢物的化学复杂性 技术难题：代谢组学中的主要技术难点在于分析物浓度的动态范技术难题：代谢组学中的主要技术难点在于分析物浓度的动态范围围？-22代谢组学的研究策略代谢组学的研究策略代谢物靶标分析代谢物靶标分析（Metabolite target analysisMetabolite target analysis）直接研究基因变化的初级影响，可对专有的底物或相直接研究基因变化的初级影响，可对专有的底物或相应编码蛋白进行分析。应
13、编码蛋白进行分析。可以详细而精确的完成某个或某几个特定组分的分析。可以详细而精确的完成某个或某几个特定组分的分析。容易被其他相似的混合物所干扰。容易被其他相似的混合物所干扰。为使分析准确，应用大量制备方法来清除样品中的杂为使分析准确，应用大量制备方法来清除样品中的杂质，并用灵敏度高的分析方法对样品进行检测。质，并用灵敏度高的分析方法对样品进行检测。-23代谢组学的研究策略代谢轮廓分析代谢轮廓分析（Metabolic profilingMetabolic profiling）：）：代谢轮廓分析是少数预设的一些代谢产物的识别代谢轮廓分析是少数预设的一些代谢产物的识别和定量分析，如某一类结构、性质相
14、关的化合物和定量分析，如某一类结构、性质相关的化合物（氨基酸、有机酸、顺二醇类）或某一代谢途径（氨基酸、有机酸、顺二醇类）或某一代谢途径的所有中间产物或多条代谢途径的标志性组分。的所有中间产物或多条代谢途径的标志性组分。有时在代谢物分析中，不必分析生物样本中的所有时在代谢物分析中，不必分析生物样本中的所有化合物，只要分析所研究的特定生化代谢途径有化合物，只要分析所研究的特定生化代谢途径即可。因此，在样品制备过程中某一代谢途径的即可。因此，在样品制备过程中某一代谢途径的中间化合物时需要特别留意中间化合物时需要特别留意-24代谢组学的研究策略代谢组学代谢组学（MetabolomicsMetabol
15、omics）：）：代谢组学分析揭示了研究的生物学系统中对限定代谢组学分析揭示了研究的生物学系统中对限定条件下的特定生物样品中所有代谢组分的全面的条件下的特定生物样品中所有代谢组分的全面的定性和定量变化。外界环境的变化总是诱导植物定性和定量变化。外界环境的变化总是诱导植物体产生交互式影响，有时这些影响会导致一些与体产生交互式影响，有时这些影响会导致一些与之不相关的代谢途径发生改变。为了弄清所有的之不相关的代谢途径发生改变。为了弄清所有的这些影响，代谢组学的分析是必不可少的。在这这些影响，代谢组学的分析是必不可少的。在这个分析过程中，精密的分析方法用来对一个样品个分析过程中，精密的分析方法用来对一
16、个样品种所有的化合物进行分析而不需要对样品进行纯种所有的化合物进行分析而不需要对样品进行纯化。化。-25代谢组学的研究策略代谢物指纹分析代谢物指纹分析（Metabolic fingerprintingMetabolic fingerprinting）：）：代谢物图谱有其特质性，类似样品的代谢物图谱有其特质性，类似样品的“指纹指纹”一一样；对这种特质性进行区分、鉴定，被称为样；对这种特质性进行区分、鉴定，被称为“代代谢指纹分析谢指纹分析”，帮助找出机体代谢的共性与个性。，帮助找出机体代谢的共性与个性。代谢物指纹分析的目的在于根据其来源和生物学代谢物指纹分析的目的在于根据其来源和生物学相关性对样品
17、进行快速分类。在工业和临床应用相关性对样品进行快速分类。在工业和临床应用上，它有时不能在一个样品中测定所有代谢物，上，它有时不能在一个样品中测定所有代谢物，也不能分离鉴定具体单一组分，但是对于样品的也不能分离鉴定具体单一组分，但是对于样品的快速分类是很合适的（如表型的快速鉴定）。快速分类是很合适的（如表型的快速鉴定）。-26广泛靶向代谢组学 传统的液相色谱-质谱方法有靶向代谢组学（Targeted metabolomics）和非靶向（Non-targeted/Untargeted metabolomics）两种。靶向代谢组学方法只能对少数已知代谢物进行定性和定量检测，但其具有灵敏度高、定量准确
18、的特点。需要用分析标准品进行定量分析。非靶向代谢组学方法能够同时检测数百乃至数千种代谢物（包括已知和未知代谢物），但其灵敏度较之前者减低 1-2 个数量级，定性定量准确性也相对较差。针对上述两种方法的优缺点，近年来相继发展出能够同时定性、定量数百种已知代谢物和定量近千种已知及未知代谢物的广泛靶向代谢组学分析方法（Widely-targeted metabolomics）-27-28-29代谢组学研究的主要应用领域-30健康与疾病诊断健康与疾病诊断中药药理、毒理中药药理、毒理药效筛选药效筛选代谢组学有望彻底代谢组学有望彻底揭开中药的奥秘揭开中药的奥秘-31代谢组学在疾病研究中的应用代谢组研究的一
19、个重要部分是比较分析健康状态与疾病状态下小分子代谢物表达的差异,这有助于人们寻找各种疾病早期诊断的标志物（biological marker）,并可用于疾病预后及治疗效果的评判。肝脏是机体内负责能量合成和物质代谢的中心器官,各种肝脏疾病严重威胁人类健康,对肝病进行研究很有必要,代谢组学技术为肝病的诊断、机制研究等提供了一个好的技术平台。-32肝病标志物慢性乙型肝炎引发的急性肝衰的诊断标志物（diagnostic markers）,羟鹅脱氧胆酸。半乳糖胺(galactosamine,galN)是一种经典的肝毒素,已被广泛的用于肝损伤实验研究中。用galN结合脂多糖(lipopolysacchar
20、ide,LPS)造成小鼠突发性肝损伤然后利用气相色谱飞行时间质谱联用技术对代谢图谱进行了研究,结果表明血浆中的5-羟基吲哚乙酸(5-hydroxylindoleacetic acid)、-羟基丁酸(-hydroxybutyrate)以及磷酸盐的浓度变化可作为FHF 的早期诊断标志物。-33代谢组学在肿瘤研究中的应用近来的研究表明,不同肿瘤制备样品(比如培养细胞、组织切片、体内肿瘤块等)的代谢图谱与肿瘤类型、增殖、代谢活性以及细胞死亡有较强的相关性。对肿瘤代谢表型图谱的研究有助于人们了解肿瘤发生、发展以及致死的机制;在临床条件下,这些代谢图谱可以作为肿瘤诊断、预后以及治疗的评判标准。-34轻度肝
21、癌(hepatocellular carcinoma,HCC)及重度肝癌与毗邻的正常肝组织在代谢物表达上有显著差异,且轻度肝癌与重度肝癌之间也有显著差异,这对于肝癌的早期诊断很重要。此外,代谢组技术已应用于脑瘤、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌等引发的代谢物变化的体内检测。-35代谢组学在其他疾病研究中的应用老年抑郁症可能与脂类、神经递质等的代谢改变有关。风湿性关节炎研究。肾病、高血压、II型糖尿病、心血管病、炎症性肠病、哮喘、脑膜炎以及精神分裂症等多种疾病研究中,代谢组技术也已得到广泛应用。除在疾病诊断中发挥作用外,代谢组学技术也已被用于机体健康状况的评价,特别是营养水平对健康的影响。-36代谢组学
22、在毒理学中的应用在毒理学研究中,组织病理学检测并不提示分子方面的信息。组织病理学检测往往依赖于病理检测人员的经验,这种检测具有一定的主观性,可提供定性信息,而不能提供定量信息。代谢物组成的变化是毒物胁迫对机体造成的最终影响,利用代谢组技术可以直接反映毒物对机体的影响。-37它莫西林(tamoxifen,TMX)是一种常用的抗乳腺癌药物,可引发非酒精性脂肪肝炎利用NMR与转录组技术相结合进行研究,结果表明TMX作用通过降低脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)的表达及活性严重影响了肝脏内脂肪代谢。-38代谢物组成的改变可以直接或间接地反映在流经受损器官的血液中,进而经过肾
23、脏过滤后,这种改变还可反映在尿液中。采集尿液或血液,利用代谢组技术分析毒物作用后代谢物组成变化,可以无损伤性的评估目标器官的受损程度。两种肝毒剂四氯化碳、-萘异硫氰酸和两种肾毒剂2-溴乙胺、对氨基苯酚对大鼠尿液代谢物组成的影响,结果表明利用代谢组技术可以快速进行毒剂的体内检测。-39代谢组学在药物研发中的应用在药物研发过程中,确定候选药物的药物代谢动力学、代谢特性以及毒副作用等是必需的,药物代谢物质的检测、鉴定已经成为药物研发的首要任务。传统的药物代谢物质检测、鉴定过程比较耗时费力,MS、NMR技术的应用使得这一过程可以快速完成,并能鉴定低丰度的药物代谢物质。-40 对候选药物进行大规模筛选需
24、要多家机构进行科研合作,在这方面,大制药公司和伦敦帝国学院发起成立了毒物代谢组联盟(Consortium for Metabonomic Toxicology,COMET)计划。该联盟开发新的代谢组数据采集、分析方法,利用NMR对大鼠和小鼠尿液、血清进行代谢物分析,对候选药物进行临床前毒副效应研究。评估分析仪器以及生物体的差异对结果的影响,提高结果的可重复性,其最终目的在于建立药物毒副作用的专家预测系统,并对种属间药物毒性差异进行研究。-41 药物基因组学(pharmacogenomics)研究的一个长期目标是了解遗传差异(基因多态性)导致不同个体间药物代谢能力的差异,以及药物在不同个体间作用
25、效果及副作用的差异,从而实现根据个体情况进行个体化用药。新近出现的药物代谢组学(pharma-cometabonomics)也能帮助人们了解不同个体对药物作用反应的差异,这种研究方法对遗传差异和环境影响都很敏感,通过对代谢物变化进行分析能很好的揭示这些差异。-42膳食营养评价膳食营养评价临床营养临床营养猫的营养猫的营养-43代谢组学在植物的应用 代谢组学的很多研究集中在植物的细胞代谢组学这个相对独立的分支。在一些实例中，基因改造的突变导致了可测量的表现型的变化，利用代谢组学的方法可以描述生物化学引起的可观察的表现型结果。我们可以通过以下几个领域来获得生物学信息：1）物种和基因型的指纹识别 2）
26、检测特殊代谢物种类（植物对外界刺激的反应）3）研究植物建立共生关系或果实成熟的发展过程 4）比较基因突变或转基因的植物与它们相对应的野生型的代谢物的异同。靶标分析：脂肪酸、类胡萝卜素、多糖、次级代谢物等-44-45代谢组学研究流程-46代谢组学各分析流程技术代谢组学各分析流程技术 样品的提取样品的提取样品预处理样品预处理自动进样自动进样检测及鉴定检测及鉴定化合物的分离化合物的分离数据分析与可数据分析与可视化，建模与视化，建模与仿真仿真固相微萃取固相微萃取固相萃取固相萃取亲和色谱亲和色谱气相色谱气相色谱液相色谱液相色谱毛细管电泳毛细管电泳光谱光谱质谱质谱核磁共振核磁共振电化学电化学生物信息学生物
27、信息学化学信息学化学信息学化学计量学化学计量学计算生物学计算生物学-47代谢组学的研究流程代谢组学的研究流程-48-49Mass Spectrometry Equipment Available in The National Centre for Plant and Microbial Metabolomics,UKThermoFinnigan LCQLC-MSWaters GC-MSAccurate mass GC-MSAgilent GC-MSThermoFinnigan GCQGC-MSThermoFinnigan MaT95 XPWaters Q-TOFWaters Maldi-TO
28、FLeco Pegasus TOFFast Scanning GC-MS(bought under MeT-RO)-50核磁共振技术（NMR）核磁共振技术（NMR），能够对样品实现非破坏性、非选择性分析。它是唯一既能定性,又能在微摩尔范围定量有机化合物的技术。缺陷是灵敏度相对较低,不适合分析低浓度代谢物。色谱技术具有分离性能好、灵敏度高等特点，被广泛用于复杂体系中的成分分析。但在色谱峰识别和方法的重现性方面仍存在难以克服的问题。-51色谱-质谱联用质谱(MS)或与色谱联用技术具有普适性、高灵敏度和特异性等特点，已经在代谢组学研究中成为首选技术。更先进的检测方法是电喷雾四级杆飞行时间质谱（Q-T
29、OF）技术，能够快速、准确地测定从小分子到生物大分子或不稳定有机分子的分子量。-52毛细管电泳 毛细管电泳(capillary electrophoresis,CE)技术是在高电场强度作用下,对毛细管内径中的样品按分子质量电荷、电泳迁移率等差异进行有效分离。包括：毛细管区电泳(CZE,依据不同蛋白质的电荷质量比差异进行分离)、毛细管等电聚焦(CIEF,依据蛋白质等电点不同在毛细管内形成pH梯度实现分离)筛板-SDS毛细管电泳(依据SDS-蛋白质复合物在网状骨架中迁移速率的不同而实现分离)优点是可实现在线自动分析,可用于相对分子质量范围不适于2-DE的样品,缺点是存在对复杂样品分离不完全的现象-
30、53代谢组学的技术平台 红外线光谱技术（IR），核磁共振技术（NMR），稀薄气液色谱技术（TLC），高效液相色谱技术（HPLC），高效毛细管电泳技术（HPCE），毛细管电泳与紫外线吸光率检测连用技术（CE/UV），毛细管电泳与激光诱导荧光检测连用技术（CE/LIF），毛细管电泳与质谱连用技术（CE/MS），气相色谱与质谱共用技术（GC/MS），液相色谱与质谱共用技术（LC/MS），液相色谱与质谱先后使用技术（LC/MS/MS），高效液相与质谱和核磁共振技术功用（LC/NMR/MS）-54 目前最常用的分离分析手段是：气相色谱与质谱联用(GCMS)液相色谱与质谱联用(LCMS)毛细管电泳与质谱联
31、用(CEMS)核磁共振(NMR)-55代谢组学研究步骤途径分析标记物识别-56生物样品收集与预处理 代谢组学研究常用的检测技术，一般不需要对标本特别分离、纯化等，但须立即阻断内在酶的活性，常用方法：冷冻/液氮降温法 冷冻、干燥 细胞间仍始终有低水平的代谢活动，需尽量避免氧化等活化因素-57样品采集 常有样品：生物体液，包括尿液、血液、组织提取液及活体组织等 在代谢组学研究中，根据研究对象、目的和采用的分析技术不同，所需的样品提取和预处理方法各异。代谢产物通常用水或有机溶剂(如甲醇、己烷等)分别提取，获得水提取物和有机溶剂提取物，从而把非极性相和极性相分开，以便进行分析-58样品预处理 代谢产物
32、的变化对分析结果有较大的影响，在处理生物样本时要特别注意避免由于残留酶活性或氧化还原过程降解代谢产物、产生新的代谢产物。1.微生物和细胞样本：迅速钝化代谢活动（淬灭），同时保持细胞不裂解 2.动物体液（如尿、血、组织、器官、唾液）：采样后要迅速预处理，如加入抗凝血剂、防腐剂，并立即冷冻处理。3.植物样本：采集后迅速冷冻（液氮），冷冻保存。4.血清样品：一定避免反复冻融。(血液收集在离心管中静置30分钟进行凝固。离心取上清装载干净的离心管中，再离心5分钟，冷冻保存。）5.尿液样品：离心去沉淀，冷冻保存。-59数据采集（分析技术平台）-60色谱法:一种分离技术原理：使混合物中各组分在两相间进行分配
33、,其中一相是不动的(固定相),另一相(流动相)携带混合物流过此固定相,与固定相发生作用,在同一推动力下,不同组分在固定相中滞留的时间不同,依次从固定相中流出,又称色层法,层析法。分类：(1)气相色谱和液相色谱(2)柱色谱,纸(PC)色谱,薄层色谱(TLC)(3)吸附色谱,分配色谱,离子交换色谱,排阻色谱(物理化学原理)-61气相色谱（气相色谱（Gas ChromatographyGas Chromatography）气相色谱（Gas Chromatography，GC）的流动向为惰性气体(氮气或氦气)以表面积大且具有一定活性的吸附剂作为固定相当多组分的混合样品进入色谱柱后，由于吸附剂对每个组分
34、的吸附力不同，经过一定时间后，各组分在色谱柱中的运行速度也就不同。吸附力弱的组分容易被解吸下来，最先离开色谱柱进入检测器，而吸附力最强的组分最不容易被解吸下来，因此最后离开色谱柱。各组分得以在色谱柱中彼此分离，顺序进入检测器中被检测、记录下来。-62气相色谱固定相1.气-固固定相 气固色谱固定相通常是具有一定活性的固体吸附剂细小颗粒，常见的有：活性炭，三氧化二铝，硅胶，分子筛，高分子多孔微球（GDX系列）等。2.气-液固定相 气液色谱固定相是以一种惰性固体微粒作支持剂（称其为担体或载体），在其表面涂敷上一高沸点的物质（其在色谱分离操作温度下呈液态，称其为固定液）而构成。-63 当气化的组分与气
35、相和固定相共存时，它就根据对两相相对当气化的组分与气相和固定相共存时，它就根据对两相相对吸附性能吸附性能的不同而在两相间进行分配。的不同而在两相间进行分配。吸附性能吸附性能：可以是：可以是溶解度溶解度，挥发性挥发性，极性极性，特殊的化学相互作用，或，特殊的化学相互作用，或其他任何存在于样品组分间的性质差异。其他任何存在于样品组分间的性质差异。如果一相是固定的（涂层）而另一相是流动的（载气），组分将会以比流如果一相是固定的（涂层）而另一相是流动的（载气），组分将会以比流动相慢的速度迁移。迁移速度慢的程度取决于相互作用的大小；如果不同组动相慢的速度迁移。迁移速度慢的程度取决于相互作用的大小；如果不
36、同组分有不同的分有不同的“吸附性能吸附性能”，它们将会随时间而被分离。，它们将会随时间而被分离。色谱柱如何对混合物进行分离色谱柱如何对混合物进行分离？-64气相色谱（GC）基本构造载气源载气源进样口进样口色谱柱色谱柱检测器检测器样样 品品数据处理数据处理以以气体气体作为流动相（载气）作为流动相（载气）分分 离离分分 析析输输 出出-65气相色谱仪的组成及各部分的作用气相色谱仪的组成及各部分的作用2、进样系统进样系统（包括进样器和汽化室）（包括进样器和汽化室）汽化室可控制温度为汽化室可控制温度为20400 汽化室的作用是将液体或固体样品瞬间气化为蒸气，汽化室的作用是将液体或固体样品瞬间气化为蒸气
37、，1、载气系统载气系统（包括气源、气体净化、气体流速控制和测量）（包括气源、气体净化、气体流速控制和测量）常用的载气，常用的载气，氨气氨气、氮气氮气并很快被载气带入色谱柱。并很快被载气带入色谱柱。3、分离系统分离系统 色谱柱（色谱柱（心脏部分心脏部分）、柱箱和恒温控制装置）、柱箱和恒温控制装置 -664、检测系统检测系统 检测器，控温装置检测器，控温装置 检测恒温箱中的温度，一般选择与柱温相同或略高于柱温检测恒温箱中的温度，一般选择与柱温相同或略高于柱温。5、记录系统记录系统 放大器和记录器，数据处理装置。放大器和记录器，数据处理装置。-67检 测 器 检测器检测器：将色谱柱分离后的各组分按其
38、特性及含量转换为相：将色谱柱分离后的各组分按其特性及含量转换为相应的电讯号。应的电讯号。浓度型检测器：浓度型检测器：测量的是载气中某组分浓度瞬间的变化，即检测测量的是载气中某组分浓度瞬间的变化，即检测器的器的响应值和组分浓度成正比，响应值和组分浓度成正比，热导检测器热导检测器；质量型检测器：质量型检测器：测量的是载气中某组分进入检测器的速度变化，即测量的是载气中某组分进入检测器的速度变化，即检测器的响应值和单位时间内进入检测器某组分的质量成正比检测器的响应值和单位时间内进入检测器某组分的质量成正比 ，氢氢火焰离子检测器火焰离子检测器。-68检测器有多种类型的检测器可供选择，但是所有的检测器的功
39、能都是相同的：检测器有多种类型的检测器可供选择，但是所有的检测器的功能都是相同的：当纯的载气当纯的载气(没有待分离组分没有待分离组分)流经检测器时，产生流经检测器时，产生稳定稳定的电信号的电信号(基线基线)；当有待分离组分通过检测器时，产生当有待分离组分通过检测器时，产生不同不同的电信号。的电信号。热导检测器热导检测器氮磷检测器氮磷检测器电子捕获检测器电子捕获检测器火焰光度检测器火焰光度检测器原子发射检测器原子发射检测器火焰离子化检测器火焰离子化检测器质量选择性检测器质量选择性检测器热导率的差异热导率的差异含氮和含磷化合物含氮和含磷化合物电子电子含磷和含硫化合物含磷和含硫化合物适用于多种元素适
40、用于多种元素产生离子的任何物质，有机物产生离子的任何物质，有机物利用质谱图对组分进行鉴定利用质谱图对组分进行鉴定和色谱图联用时，成为有力的鉴定手段和色谱图联用时，成为有力的鉴定手段-69微量注射器：微量注射器：0.1，1，5，10，50 L自动进样器自动进样器-70色色 谱谱 柱柱-71氢火焰离子化检测器（氢火焰离子化检测器（flame ionization detector）FID 对含碳有机化合物有很高的灵敏度。适用于痕对含碳有机化合物有很高的灵敏度。适用于痕量有机物的分析；量有机物的分析；特点：特点：结构简单、灵敏度高、响应块、稳定性好、结构简单、灵敏度高、响应块、稳定性好、死体积小、线
41、性范围宽。死体积小、线性范围宽。结构：结构：离子化室、火焰喷嘴、一对电极、外罩离子化室、火焰喷嘴、一对电极、外罩-72数数 据据 处处 理理v 良好的峰面积重现性，一般良好的峰面积重现性，一般RSD%在在0.53%（RSD：相对标准偏差）：相对标准偏差）v 工作曲线具有良好的线性工作曲线具有良好的线性v 峰形正常，避免拖尾峰和前沿峰峰形正常，避免拖尾峰和前沿峰(柱选择恰当、衬管无污染、温度及流量设定柱选择恰当、衬管无污染、温度及流量设定)v 色谱峰分离良好色谱峰分离良好(分离度分离度1.5)一、数据可靠性判断一、数据可靠性判断-73二、数据不良时的检查措施二、数据不良时的检查措施1.检查是否漏
42、气：用检漏液检查各连接部位，并确认峰检查是否漏气：用检漏液检查各连接部位，并确认峰面积重现性面积重现性2.检查色谱柱是否良好：长时间使用，因吸附、固定液检查色谱柱是否良好：长时间使用，因吸附、固定液流失、固定液分解及污染，造成柱劣化，更换新柱流失、固定液分解及污染，造成柱劣化，更换新柱3.检查衬管是否正常：认衬管有无破损、污染，确认石检查衬管是否正常：认衬管有无破损、污染，确认石英棉的位置英棉的位置4.样品性质，是否易分解，对于不稳定的样品应注意保样品性质，是否易分解，对于不稳定的样品应注意保存温度，要避光并注意存放时间。存温度，要避光并注意存放时间。-74三、气相色谱定性分析方法三、气相色谱
43、定性分析方法A、根据色谱保留值进行定性分析、根据色谱保留值进行定性分析 根据色谱保留值进行定性分析，但要求柱效要高根据色谱保留值进行定性分析，但要求柱效要高 ，混合物组分简单，且已，混合物组分简单，且已知，可一一分离。即使这样，也只能做其它定性方法的旁证。该方法采用的指知，可一一分离。即使这样，也只能做其它定性方法的旁证。该方法采用的指标为保留指数；标为保留指数；B、与其他方法结合的定性分析方法：、与其他方法结合的定性分析方法：（1）与质谱、红外等仪器联用；）与质谱、红外等仪器联用；（2）与化学方法配合进行定性分析。）与化学方法配合进行定性分析。C、利用检测器的选择性进行定性分析、利用检测器的
44、选择性进行定性分析-75 GC-MS-76GC-MSGC-MS的基本流路图的基本流路图GC接口接口MS数据处理数据处理真空系统真空系统-77GC-MSGC-MS联用仪器联用仪器SampleSample 58901.0 DEG/MINHEWLETTPACKARDHEWLETTPACKARD5972AMass Selective DetectorDCBA ABCDGas Chromatograph(GC)Mass SpectrometerSeparationIdentificationBACDADBCMS-78 优点：集色谱法的高分离能力和质谱法的结构鉴定能力于一体，灵敏度高，可检测到大量低含量的
45、小分子代谢产物。缺点：无法分析热不稳定性的物质和分子量较大的代谢产物。-79控制器控制器输液泵输液泵储液瓶储液瓶溶剂组织器溶剂组织器进样器进样器色谱柱（柱温箱）色谱柱（柱温箱）检测器检测器高效液相色谱（HPLC）-80输液泵输液泵进样器进样器色谱柱色谱柱检测器检测器色谱工作站色谱工作站储液瓶储液瓶-81-82-83AcetoneTHFMeOHMeCNEtOHMeOH水乙醇甲醇正己烷异丙醇二氯甲烷四氰呋喃乙酸乙脂非极性极性乙腈-84HPLC的分离机理 按溶质在两相分离过程的物理化学原理可分为 分离基于分子量大小达到分离效果-85 评价一个HPLC方法的标准之一：分离度。下面两个图哪个分离更好些？
46、图1图2-86LC-MSLC-MS概述概述 色谱质谱的在线联用将色谱的分离能力与质谱的定性功能结合起来，实现对复杂混合物更准确的定量和定性分析。气质联用仪分析仪器中较早实现联用技术的仪器。相继地，液相色谱-质谱（LC-MS）联用技术自70年代以来，经过20多年的发展也日渐成熟，应用广泛。-87气质联用仪气质联用仪(GC-MS)(GC-MS)是是最早商品化的联用仪最早商品化的联用仪器，适宜分析小分子、器，适宜分析小分子、易挥发、热稳定、能易挥发、热稳定、能气化的化合物；用电气化的化合物；用电子轰击方式（子轰击方式（EIEI）得）得到的谱图，可与标准到的谱图，可与标准谱库对比。谱库对比。n液质联用
47、液质联用(LC-MS)(LC-MS)主主要适用于不挥发性化要适用于不挥发性化合物，极性化合物，合物，极性化合物，热不稳定化合物，大热不稳定化合物，大分子量化合物（包括分子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物蛋白、多肽、多聚物等），即药物杂质，等），即药物杂质，药物代谢物及内源性药物代谢物及内源性化合物的分析测定。化合物的分析测定。样品需要水解样品需要水解或者衍生化，或者衍生化，处理繁琐，且处理繁琐，且使用范围窄。使用范围窄。-88液相质谱的组成液相色谱系统、真空系统、进样系统、离子源、质量分析器、液相色谱系统、真空系统、进样系统、离子源、质量分析器、数据处理系统数据处理系统液相色谱系统离子源质量分
48、析器离子检测器样品导入系统真空系统计算机数据处理系统-89 ESI-MS示意图CID区液相入口喷雾毛细管传输毛细管锥形分离器八极杆离子透镜质量分析器大气压腔大气压腔真空接口和离子传输区真空接口和离子传输区质量分析器（离子阱质量分析器（离子阱）-90APCI组成液相入口喷雾毛细管APCI蒸发器电晕放电针传输毛细管CID区锥形分离器八极杆离子透镜单极四极杆质量分析器质量检测器 与与ESI区别：区别：增加了增加了电晕放电针电晕放电针，作为发射自由电子并启动后续离子化过程；，作为发射自由电子并启动后续离子化过程；增加增加APCI蒸发器蒸发器，对喷雾气体进行加热，扩大干燥气体的可加热范围，对喷雾气体进行
49、加热，扩大干燥气体的可加热范围-91APCI与ESI比较-92CID技术碰撞诱导解离 (collision induced dissociation，CID)指离子经过接口指离子经过接口离子化后离子化后，在，在进入质量进入质量分析器之前分析器之前，在毛细管和锥形分离器，在毛细管和锥形分离器(取样取样锥锥)CIDCID区区中，被施加一定的中，被施加一定的加速电压加速电压(fragmentor voltage)(fragmentor voltage)，使离子运动速度提高，使离子运动速度提高，与与中性分子碰撞中性分子碰撞(如如N N2 2，Ar)Ar)而产生碎片离子过而产生碎片离子过程。程。-93C
50、ADCAD技术技术 碰撞活化解离 (collision active dissociation，CAD)指由指由串联质谱（串联质谱（LC-MS/MS）产生碎片离子的过程产生碎片离子的过程相当于相当于LC-MS/MS的的子离子检测模式子离子检测模式。第一级质量分析器第二级质量分析器选择母离子碰撞室N N2 2，ArAr碰撞裂解-94-95磁共振成像磁共振成像(NMRI,Nuclear Magnetic Resonance Imaging)磁共振定域谱磁共振定域谱(MRS,Magnetic Resonance Spectroscopy)核磁共振波谱核磁共振波谱(NMR,Nuclear Magnet
