1、LAMP微流控芯片即时检测骨髓增殖性肿瘤分子标志物微流控芯片即时检测骨髓增殖性肿瘤分子标志物JAK2 V617F、MPL W515K/L的研究的研究 复旦大学附属华山医院复旦大学附属华山医院 关关 明明研究背景研究背景-骨髓增殖性肿瘤骨髓增殖性肿瘤n骨髓增殖性肿瘤（MPN）：慢性粒细胞白血病（CML）、真性红细胞增多症（PV）、原发性血小板增多症（ET）、原发性骨髓纤维化（PMF）n临床困扰的问题临床困扰的问题:经典MPN（PV,ET和PMF）之间可互相转化或合并存在，不同类型的MPN与反应性增生之间的鉴别诊断困难。n PVn ETn PMFMPN诊断革命性的突破诊断革命性的突破-分子标志物的
2、发现分子标志物的发现nWHO：JAK2 V617F和MPL W515K/L基因突变列入PV、ET、PMF的诊断标准之一。nJAK2 V617F：JAK2基因14外显子1849位碱基GT点突变,PV 95%，ET/PMF 50%-60%。nMPL W515K/L:MPL基因10号外显子515位密码子色氨酸TGG替换为赖氨酸AAG(515K)/亮氨酸TTG(515L)，ET/PMF 5%10%。梅奥诊所制定经典MPN分子诊断的路径 n 临床医生能有序使用这两种分子指标n 避免昂贵的检测费用n 联合检测意义重大l 明确MPN诊断l 有助于MPN治疗及预后l 脑卒中的社区筛查脑卒中的社区筛查骨髓增殖性
3、肿瘤与缺血性卒中nMPN是脑卒中的病因之一，部分患者在诊断为MPN之前，就因发生血栓导致急性缺血性脑卒中。nJAK2V617F 突变阳性为MPN患者脑血栓形成的独立预测因子，血栓形成是MPN患者死亡主要原因。nJAK2V617F 突变的检测有助于判定脑血管事件风险。n专家建议在社区开展脑卒中MPN分子标志物筛查。社区筛查亟需建立MPN分子标志物POCT方法n社区筛查：急性缺血性脑卒中患者早治疗，减少血栓并发症。n基因突变检测方法：PCR，测序。n 即时检验（POCT)：现场、便携和快速。n 建立即时检测JAK2 V617F、MPL W515K/L基因突变新方法，以实现对MPN的早期诊断，为脑卒
4、中患者提供MPN分子标志物的社区筛查手段。研究目的研究目的研究方法研究方法-微流控芯片结合微流控芯片结合等温扩增技术等温扩增技术n 微流控芯片微流控芯片(Microchip)：实验室的功能集成在几平方厘米芯片上，可集成化、便于携带。Lab on chipn 环介导等温扩增环介导等温扩增(LAMP)：快速、灵敏度高,特异性强、操作方便。n Microchip-LAMP 可摆脱对可摆脱对精良仪器设备精良仪器设备及精确及精确温度温度的依赖的依赖研究内容n 单位点基因突变检测微流控芯片的研制及其即时检测 JAK2 V617F突变的应用。n 多位点基因突变检测微流控芯片的研制及其在即时检测 JAK2 V
5、617F，MPL W515K/L突变的应用。第一部分单位点基因突变检测微流控芯片的研制及其即时检测 JAK2 V617F突变的应用技术路线研究方法与结果-引物设计n JAK2 V617 F 野生型引物：F3-W，B3-W，FIP-W,BIP-W，P-W,PNA-Mn JAK2 V617 F 突变型引物：F3-M，B3-M，FIP-M,BIP-M，P-M,PNA-W研究方法与结果-荧光染料钙黄绿素n 反应前加入LAMP反应体系，一步反应后无需开盖，可根据是否有肉眼可见绿色荧光准确判断反应结果。引物验证-可视化检测V617F 突变型引物突变型引物V617F 野生型引物野生型引物HELHELHL-6
6、0 HL-60 n HEL:纯合JAK2 V617F 突变的人红白血病细胞株作为阳性对照n HL-60:人早幼粒白血病细胞细胞株作为突变阴性对照引物验证-实时浊度检测n JAK2 V617F突变LAMP引物特异性扩增V617F阳性DNA引物验证-实时浊度检测n JAK2 V617F野生型LAMP引物特异性扩增V617F突变阴性DNALAMP产物测序分析产物测序分析n JAK2基因14外显子1849位碱基GT点突变LAMP产物产物酶切鉴定酶切鉴定方法与结果方法与结果-单位点基因突变微控芯片设计单位点基因突变微控芯片设计全血细胞热热裂解区扩增及检测区滤过区螺丝阀阴性对照阳性对照方法与结果方法与结果
7、-JAK2 V617F等温微流控芯片设计与制作等温微流控芯片设计与制作ibLchip问题：问题：1.1.核酸提取核酸提取2.2.直观检测直观检测 芯片3D示意图样品进n 授权国家发明专利：整合全血核酸提取、扩增即可视化检测肿瘤基因突变的微流控芯片（ZL 201410554594.0）结果出方法与结果方法与结果-芯片核酸提取芯片核酸提取ABCn 0.5 l全血：6 ngn 50 kb:基因组DNA完整性方法与结果方法与结果-芯片灵敏度检测n 基于芯片微通道LAMP V617F 突变检出限荧光染料钙黄绿素617F(+)(-)0.01%NWMP结果结果-临床样本分析临床样本分析A:野生型B:杂合型
8、C:纯合突变 n 方法学准确性分析方法学准确性分析（30例PV,30例对照）非标记探针高分辨率熔解曲线分析(MCA)，ibLchipJournal of Chromatography A,1410(2015)28-34V617F结果结果-临床样本分析临床样本分析n PV患者基因组DNA PCR扩增产物克隆后测序结果（反向）非标记探针技术：JAK2 V617F野生型；ibLchip：JAK2 V617F杂合突变第一部分小结n 创新点l ibLchip：整合全血核酸提取、基因扩增、可视化检测 国家发明专利：（ZL 201410554594.0）l 1小时内完成JAK2 V617F突变检测n 不足之
9、处：l ibLchip只能检测单个基因突变l 细胞裂解液中获得基因组DNA量有限l 需热板、水浴锅等插电设备，限制即时检测的应用第二部分多位点基因突变检测微流控芯片的研制及其在即时检测 JAK2 V617F，MPL W515K/L突变的应用前言nMPN是多位点基因突变引起的疾病,诊断、治疗和脑卒中社区筛查均需多重指标联合检测。n即时检测的主要标准：不需固定的检测场所，试剂和仪器是便携式的，并且可及时操作。研究目的n 研制一款多位点基因突变的LAMP微流控芯片，结合自主研发的便携式核酸快速提取装置和便携式微型温控仪，实现对MPN分子标志物的即时检测。技术路线第二部分研究工作3D 示意图研究方法与
10、结果-聚丙烯丝束/毛细管提取基因组DNAn Qubit 定量l 5 l全血：50 2.5 ng；10 l全血：81 4.2 ng；20 l 全血150 5.8ngl 15分钟内完成采血、基因组DNA提取n 基因组DNA具有完整性n 授权专利：一种快速提取全血基因组DNA的装置（ZL 201510532629.5）研究方法与结果-便携式微型温控仪n 温控仪设计图n 温控仪实物图n 温控仪控制温度为37100C，控制精度0.3研究方法与结果-MPL W515K/L引物设计及验证n W515k 引物特异性扩增W515K突变质粒n W515L引物特异性扩增W515L突变质粒可视化检测（515K 引物）
11、（515L 引物）515K 突变质粒515L 突变质粒n W515野生型引物特异性扩增W515野生型质粒研究方法与结果可视化检测515野生型引物515 野生型质粒研究方法与结果-MPL W515K/L引物设计及验证实时浊度法n W515k 引物特异性扩增W515K突变质粒nW515L引物特异性扩增W515L突变质粒研究方法与结果-MPL W515K/L引物设计及验证实时浊度法n W515野生型引物特异性扩增W515野生型质粒方法与结果-MPL515K/L LAMP产物测序515L TGG-TTG 515 K TGG-AAG方法与结果-MPL515K LAMP产物酶切鉴定方法与结果-MPL515
12、L LAMP产物酶切鉴定设计及制作检测MPN多个分子标志物的LAMP微流控芯片mLchip：A LAMP microchip for simultaneous multi-gene mutation screening in patient with MPN）检测基因检测基因检测槽检测槽道道阳性对照槽道阳性对照槽道V617F 野生型1P1V617F 突变型2P2W515K突变型3P3W515L 突变型4P4W515野生型5P5n N,阴性对照；P,阳性对照；N*,空白对照mLchipn mL chip A，SU-8阳模；B，mL chip实物图研究流体控制的芯片n 流体控制芯片 A,SU-8阳
13、模；B,芯片实物图检测基因突变率的微流控芯片n 灵敏度检测微流控芯片 A，SU-8阳模；B，芯片实物图芯片流体控制研究n 矿物油阀控制矿物油阀控制LAMP芯片流体芯片流体 A，加热前；B，65加热1小时后LAMP微流控芯片检测基因突变灵敏度分析 A,W515K（0.1%）；B,W515L（0.1%）；V617F（0.01%）方法学准确度分析n 本室自建方法作为参考方法本室自建方法作为参考方法l 非标记探针HRM分析JAK2 V617F突变，荧光定量PCR分析MPL W515K/L突变n 临床样本：临床样本：30例例ET患者，患者，10例例PMF患者患者l ET患者：12例JAK2 V617F突
14、变阳性，1例MPL W515K 突变阳性（同时伴JAK2 V617F突变阳性，1例MPL W515L突变阳性。l PMF患者：4例JAK2 V617F突变阳性，1例MPL W515L突变阳性。n mLchip 与参考方法基本一致与参考方法基本一致l 对1例未确认样本（mLchip：JAK2 V617F突变阳性；非标记探针HRM法：阴性）进行亚克隆测序，测序结果确定此标本存在JAK2 V617F突变。mLchip检测结果模式JAK2 V617F 突变型 MPL W515K突变型MPL W515L突变型mLchip检测结果MPL 515K和JAK2 V617F同时突变型第二部分小结第二部分小结n 聚丙烯丝束/毛细管l国家发明专利：一种快速提取全血基因组DNA的装置和方法 申请号：201510532629.5l实用新型专利：一种快速提取全血基因组DNA的装置 专利号：ZL 201510532629.5n 便携式微型温控仪n mLchip:JAK2 V617F、MPL W515K/L 同步即时检测
