1、第三节 单核细胞增生李斯特氏菌及其检验v主要内容：一、生物学特性一、生物学特性二、流行病学二、流行病学三、检验三、检验四、控制四、控制v李斯特氏菌属包括七个种：单核细胞增生李斯特氏菌、绵羊李斯特氏菌、英诺克李斯特氏菌、威尔斯李斯特氏菌、西尔李斯特氏菌、格氏李斯特氏菌、默氏李斯特氏菌。v其中单核细胞增生李斯特氏菌对人类致病性强，绵羊李斯特氏菌对人类也有一定的致病性，其余李斯特氏菌无致病性。单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的病原菌。病原菌。它能引起人畜的李氏菌的病，感染后主要表现它能引起人畜的李氏菌的病，感染后主要表现为败血症、为败血症、脑膜炎和脑膜炎
2、和单核细胞增多单核细胞增多。它广泛存在于自然界中，食品中存在的单增李它广泛存在于自然界中，食品中存在的单增李氏菌对人类的安全具有危险，该菌在氏菌对人类的安全具有危险，该菌在44的环境中的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一，因此，在食品卫生微生物检验中，病原菌之一，因此，在食品卫生微生物检验中，必须加以重视。必须加以重视。v毒血症：病原菌在入侵的局部生长繁殖，细菌不侵入血流，只是其产生的毒素侵入血流引起全身性状白喉、破伤风v菌血症：病原菌入侵机体后进入血流，但不在血流中繁殖，如伤寒、流行性脑脊髓膜炎的早期有菌血症期.v脓毒血症:病
3、原性球菌引起的败血症.由于病原菌随血流播散,在全身多种组织或脏器(肝肺肾皮下等)引起多发性化脓病灶.如金黄葡萄球菌导致的脓毒血症.v败血症:是球菌、杆菌等侵入血液中并在其中生长繁殖产生毒素和其他代谢产物所引起的急性全身性感染。症状是寒战、高热、皮疹、关节痛及肝脾肿大，部分有感染性休克和迁徙性病灶。v1 1、形态与染色、形态与染色v革兰氏革兰氏阳性短杆菌，大阳性短杆菌，大小为小为0.40.50.40.50.520.52m m，在有些培养基中稍弯，多数菌体一端较大，似棒在有些培养基中稍弯，多数菌体一端较大，似棒状，细胞常呈状，细胞常呈V V字形排列，在较老的或生长不良的字形排列，在较老的或生长不良
4、的培养物中，可能形成丝状。培养物中，可能形成丝状。v20-2520-25以以4 4根周生根周生鞭毛鞭毛运动，在运动，在3737只有较少的只有较少的鞭毛或鞭毛或1 1根鞭毛；根鞭毛；v无芽孢。在血清葡萄糖蛋白胨水中能形成粘多糖无芽孢。在血清葡萄糖蛋白胨水中能形成粘多糖荚膜。荚膜。2、培养特性 该菌营养要求不高，在该菌营养要求不高，在20-2520-25培养有动力，穿刺培培养有动力，穿刺培养养2 25 5天可见伞状生长，肉汤培养物在显微镜下可见天可见伞状生长，肉汤培养物在显微镜下可见翻跟斗运动。翻跟斗运动。该菌的生长范围为该菌的生长范围为2-422-42（也有报道在（也有报道在00能缓慢生能缓慢生
5、长），最适培养温度为长），最适培养温度为35-3735-37，在，在pHpH中性至弱碱性中性至弱碱性（pH9.6pH9.6）、氧分压略低、二氧化碳张力略高的条件下）、氧分压略低、二氧化碳张力略高的条件下该菌生长良好，在该菌生长良好，在pH3.8pH3.84.44.4能缓慢生长，在能缓慢生长，在6.5%6.5%NaCl NaCl 肉汤中生长良好。肉汤中生长良好。产单核细胞李斯特菌在半固体培养基中的生长情况有动力自穿刺线向四周蔓延生长呈典型伞状生长，底部为弯月牙状2、培养特性v在固体培养基上，菌落初始很小，透明，边缘整在固体培养基上，菌落初始很小，透明，边缘整齐，呈露滴状，但随着菌落的增大，变得不
6、透明。齐，呈露滴状，但随着菌落的增大，变得不透明。v在在5-7%5-7%的血平板上，菌落通常也不大，灰白色，的血平板上，菌落通常也不大，灰白色，刺种血平板培养后可产生窄小的刺种血平板培养后可产生窄小的-溶血环溶血环。v在在0.6%0.6%酵母浸膏胰酪大豆琼脂酵母浸膏胰酪大豆琼脂(TSAYE)(TSAYE)琼脂上，琼脂上，用用4545角入射光照射菌落，通过解剖镜垂直观察，角入射光照射菌落，通过解剖镜垂直观察，菌落呈兰色、灰色或兰灰色。菌落呈兰色、灰色或兰灰色。Listeria monocytogenesv3 3、生化反应、生化反应v触酶触酶阳性，阳性，氧化酶氧化酶阴性。阴性。v能发酵多种糖类，产
7、酸不产气，如发酵葡萄糖、能发酵多种糖类，产酸不产气，如发酵葡萄糖、乳糖、水杨素、麦芽糖、乳糖、水杨素、麦芽糖、鼠李糖鼠李糖、七叶苷七叶苷、蔗糖、蔗糖（迟发酵）、山梨醇、海藻糖、果糖。（迟发酵）、山梨醇、海藻糖、果糖。v不发酵不发酵木糖木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、侧金盏、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、侧金盏花醇、棉子糖、卫矛醇和纤维二糖。花醇、棉子糖、卫矛醇和纤维二糖。v不利用枸橼酸盐，不利用枸橼酸盐，40%40%胆汁不溶解。胆汁不溶解。v吲哚、硫化氢、尿素、明胶液化、硝酸盐还原、吲哚、硫化氢、尿素、明胶液化、硝酸盐还原、赖氨酸、鸟氨酸均阴性。赖氨酸、鸟氨酸均阴性。vVPVP、甲基红试验和精氨酸水解
8、阳性。、甲基红试验和精氨酸水解阳性。触酶试验3 3、生化反应、生化反应 过氧化氢酶，又称接触酶，能催过氧化氢酶，又称接触酶，能催 化化过氧化氢水解为氢和氧过氧化氢水解为氢和氧右为阴性左为阳性葡萄糖：阳性糖酵解试验麦芽糖 阳性对照七叶苷 阳性鼠李糖 阳性甘露醇阴性木糖阴性木糖阴性尿素酶试验：有些细菌能产生尿素酶，将尿素分解，产生两个分子的氨，使培养基变为碱性，酚红呈粉红色。穿刺接种尿素琼脂斜面，35培养5天，逐日观察阴性尿素酶试验尿素酶试验1 未接种2 尿素酶阳性3尿素酶阴性硝酸盐还原试验：硝酸盐还原试验：v接种硝酸盐肉汤，接种硝酸盐肉汤，3535培养培养5 5天，加入天，加入0.2ml0.2m
9、l的试剂的试剂A,A,再加入再加入0.2ml0.2ml的试剂的试剂B,B,轻轻摇混合。呈粉红色、玫瑰红色、橙色、摇混合。呈粉红色、玫瑰红色、橙色、棕色者表明有亚硝酸盐存在，为硝酸棕色者表明有亚硝酸盐存在，为硝酸盐还原阳性。盐还原阳性。v若无颜色变化，须加入少量锌粉若无颜色变化，须加入少量锌粉变红者为阴性（硝酸盐未被还原）变红者为阴性（硝酸盐未被还原）不变为阳性（亚硝酸盐已分解成氨和氮）不变为阳性（亚硝酸盐已分解成氨和氮）硝酸盐还原试验v4 4、血清型、血清型v根据菌体（根据菌体（O O）抗原和鞭毛（）抗原和鞭毛（H H）抗原，将单增李）抗原，将单增李氏菌分成氏菌分成1313个血清型，分别是个血
10、清型，分别是1/2a,1/2b,1/2c,3a,3c,3c,4a,4b;4ab,4c,4d,4e1/2a,1/2b,1/2c,3a,3c,3c,4a,4b;4ab,4c,4d,4e和和“7”13“7”13个血清型。个血清型。v致病菌株的血清型一般致病菌株的血清型一般1/2b,1/2c,3a,3b,3c,4a,1/2a,4b,1/2b,1/2c,3a,3b,3c,4a,1/2a,4b,后两型居多。后两型居多。v该菌对理化因素的抵抗力较强，在土壤、粪便、该菌对理化因素的抵抗力较强，在土壤、粪便、青贮饲料和干草内能长期存活。青贮饲料和干草内能长期存活。v对碱和盐的抵抗力较强，对碱和盐的抵抗力较强，6
11、0-7020-30min60-7020-30min即被即被杀死；杀死；70%70%的酒精的酒精5min5min，2.5%2.5%的氢氧化钠、的氢氧化钠、2.5%2.5%的石炭酸、的石炭酸、2.5%2.5%的福尔马林的福尔马林20min20min即可杀死此菌。即可杀死此菌。v该菌对青霉素、氨苄青霉素、四环素、磺胺均该菌对青霉素、氨苄青霉素、四环素、磺胺均敏感。敏感。v单增李氏菌广泛存在于自然界中，不易被冻融，能耐受单增李氏菌广泛存在于自然界中，不易被冻融，能耐受较高的渗透压，在土壤、污水、地表水、废水、植物、较高的渗透压，在土壤、污水、地表水、废水、植物、青贮饲料、烂菜中均有该菌存在，所以，动物
12、很容易误青贮饲料、烂菜中均有该菌存在，所以，动物很容易误食该菌，并通过口腔食该菌，并通过口腔-粪便的途径进行传播。李氏菌是条粪便的途径进行传播。李氏菌是条件致病菌，大多为散发病例，也可因污染食品而爆发。件致病菌，大多为散发病例，也可因污染食品而爆发。v本菌能产生一种溶血性质的外毒素，能引起人、牛、绵本菌能产生一种溶血性质的外毒素，能引起人、牛、绵羊等动物的脑膜炎，可使家兔、豚鼠等实验动物感染引羊等动物的脑膜炎，可使家兔、豚鼠等实验动物感染引起血中单核细胞增高。起血中单核细胞增高。v可引起婴儿及新生儿的化脓性脑膜炎或脑膜脑炎，死亡可引起婴儿及新生儿的化脓性脑膜炎或脑膜脑炎，死亡率可达率可达70%
13、70%，子宫内感染的胎儿，可导致流产、习惯性流，子宫内感染的胎儿，可导致流产、习惯性流产、死胎或新生儿李斯特氏菌病。产、死胎或新生儿李斯特氏菌病。与李斯特氏菌有关的食品与李斯特氏菌有关的食品肉制品（热狗、香肠）肉制品（热狗、香肠）软奶酪软奶酪鲜奶鲜奶生菜色拉生菜色拉 1、样品的采集:冷冻样品：2-5 解冻，不超过18小时。若不能及时检验，应置于-15 保存 非冷冻易腐样品：应尽可能及时检验，若不能及时检验，应置于4 冰箱保存，在24小时之内检验。v2 2、样品的处理、样品的处理:以无菌操作采取样品以无菌操作采取样品25ml(g)25ml(g)置于灭菌均质器中置于灭菌均质器中,加加入入225ml
14、225ml的的EBEB和和LBLB增菌液增菌液,充分搅拌均匀充分搅拌均匀.如不能及如不能及时检验时检验,可保存在可保存在44冰箱中冰箱中.v3 3、增菌培养、增菌培养 EB EB增菌液放入增菌液放入(30+-1)(30+-1)温箱中培养温箱中培养48h-7d.LB148h-7d.LB1增增菌液放入菌液放入(30+-1)(30+-1)温箱中培养温箱中培养24h,24h,取出取出0.1ml0.1ml加入加入10ml10ml的的LB2LB2增菌液中增菌液中2 2次增菌次增菌.v4 4、分离培养、分离培养v将将EBEB增菌液和增菌液和LBLB2 2增菌液分别画线接种于增菌液分别画线接种于MMAMMA选
15、择性选择性培养基琼脂平板上培养基琼脂平板上,置置(30+-1)(30+-1)培养培养48h48h小时小时,挑选挑选可疑菌落可疑菌落,用白炽灯用白炽灯4545度角斜光照射平板度角斜光照射平板,该菌的菌该菌的菌落为灰蓝或兰色小圆形菌落落为灰蓝或兰色小圆形菌落.v选择选择MMAMMA平板上平板上5 5个以上的可疑菌落接种三糖铁琼脂个以上的可疑菌落接种三糖铁琼脂和和SIMSIM动力培养基动力培养基,培养于培养于(25+-1),(25+-1),观察是否有观察是否有动力动力,且伞状或月牙状生长且伞状或月牙状生长.一般观察一般观察,阳性者作下一阳性者作下一步实验步实验.三糖铁（TSI）琼脂试验SIM动力试验
16、接种三糖铁琼脂，35培养5天。v5、纯培养 将上述有动力、伞状，并在三糖铁琼脂培养基上层下层产酸而不产硫化氢的可疑菌落接种于胰酪胨大豆琼脂培养基（YSA-YE）上，做纯培养，供做证实试验鉴定用v6、染色镜检：从YSA-YE平板上挑取可疑纯培养物做革兰氏染色并做湿片查该菌为阳性无芽孢杆菌；用生理盐水制成菌悬液，在油镜或相差显微镜下观察，该菌出现轻微旋转或翻滚样运动革兰氏染色阳性v6、生化试验：将上述可疑菌落做进一步的生化试验，该菌的生化特征及种间区别如下：v+为阳性；为阳性；-为阴性；为阴性；为有反应为有反应菌种项目溶血反应硝酸盐还原尿素酶MR试验V-P试验甘露醇鼠李糖木糖七叶苷H2O2酶试验单
17、增绵羊英诺克威尔斯西尔斯格氏墨氏v6、生化试验溶血试验：溶血试验：7%7%羊血琼脂平板，划分小格，刺种菌落。羊血琼脂平板，划分小格，刺种菌落。做阳性对照和阴性对照（英诺克李斯特氏菌）。做阳性对照和阴性对照（英诺克李斯特氏菌）。3535培养培养24-4824-48小时，于明亮处观察。小时，于明亮处观察。单核细胞增生李斯特氏菌在单核细胞增生李斯特氏菌在刺种点产生窄小的透明刺种点产生窄小的透明溶血环。溶血环。v6 6、生化试验、生化试验 MR-VP MR-VP试验：接种试验：接种MR-VPMR-VP肉汤，肉汤，35 35 培养培养4848小时。移取小时。移取1ml1ml于洁净试管，加入于洁净试管，加
18、入5%5%的的-萘酚萘酚 溶液溶液6ml,6ml,再加入再加入10%10%的的KOHKOH溶液溶液0.2ml,0.2ml,轻摇轻摇1min,1min,静置静置20min.20min.V-P V-P阳性反应：红色。阳性反应：红色。剩余培养液继续培养剩余培养液继续培养2d,2d,加入甲基红指示剂加入甲基红指示剂5 5滴。滴。MR MR阳性反应：红色。阳性反应：红色。v6、生化试验v糖发酵试验糖发酵试验 接种接种0.5%0.5%的糖类发酵管。的糖类发酵管。3535培养培养24-48h24-48h，阴性继续培，阴性继续培养到养到5 5天。李斯特氏菌不产气。天。李斯特氏菌不产气。单增李斯特氏菌生化反应如
19、下：单增李斯特氏菌生化反应如下：葡萄糖：阳性葡萄糖：阳性 麦芽糖：阳性麦芽糖：阳性 七叶苷：阳性七叶苷：阳性 甘露醇：阴性甘露醇：阴性 鼠李糖：阳性鼠李糖：阳性 木糖：阴性木糖：阴性 葡萄糖：阳性6、生化试验鼠李糖 阳性6、生化试验木糖阴性6、生化试验甘露醇阴性6、生化试验七叶苷 阳性6、生化试验麦芽糖 阳性6、生化试验v7、小鼠毒力试验 将符合生化试验的纯培养物接种于将符合生化试验的纯培养物接种于TSB-YETSB-YE中，在中，在3030培养培养24h24h，离心、浓缩，使浓缩液含细菌量，离心、浓缩，使浓缩液含细菌量10101010个个/ml,/ml,取取0.5ml0.5ml浓缩液注射小白
20、鼠腹腔（浓缩液注射小白鼠腹腔（3-53-5只），观只），观察小白鼠的死亡情况。致病菌株于察小白鼠的死亡情况。致病菌株于2-5d2-5d内死亡，同内死亡，同时应做已知菌对照试验。单核细胞增生李斯特氏菌、时应做已知菌对照试验。单核细胞增生李斯特氏菌、绵羊李斯特氏菌对小白鼠有致病性。绵羊李斯特氏菌对小白鼠有致病性。8 8、协同溶血试验（、协同溶血试验（CAMP)CAMP)在血平板上平行接种金黄葡萄球菌和马红球菌，在在血平板上平行接种金黄葡萄球菌和马红球菌，在它们中间垂直接种可疑李斯特氏菌，但不要触及它们，它们中间垂直接种可疑李斯特氏菌，但不要触及它们，在在30 30 培养培养24-48h,24-48
21、h,检查平板中垂直接种点对溶血环检查平板中垂直接种点对溶血环的影响。靠近金黄葡萄球菌接种点的单增李斯特氏菌的影响。靠近金黄葡萄球菌接种点的单增李斯特氏菌的溶血增强，西尔斯李氏菌的溶血也增强，绵羊李氏的溶血增强，西尔斯李氏菌的溶血也增强，绵羊李氏菌在马红球菌附近的溶血也增强，有助于鉴别。菌在马红球菌附近的溶血也增强，有助于鉴别。v结果报告：结果报告：v阳性结果：检出单核细胞增生李斯特氏菌阳性结果：检出单核细胞增生李斯特氏菌 v阴性结果：未检出单核细胞增生李斯特氏菌阴性结果：未检出单核细胞增生李斯特氏菌v单增李斯特氏菌在一般热加工处理中能存活，热处理已单增李斯特氏菌在一般热加工处理中能存活，热处理
22、已杀灭了竞争性细菌群，使单增李斯特氏菌在没有竞争的杀灭了竞争性细菌群，使单增李斯特氏菌在没有竞争的环境条件下易于存活，所以在食品加工中，中心温度必环境条件下易于存活，所以在食品加工中，中心温度必须达到须达到7070持续持续2 2分钟以上。分钟以上。v单增李斯特氏菌在自然界中广泛存在，所以即使产品已单增李斯特氏菌在自然界中广泛存在，所以即使产品已经过热加工处理充分灭活了单增李斯特氏菌，但有可能经过热加工处理充分灭活了单增李斯特氏菌，但有可能造成产品的二次污染，因此蒸煮后防止二次污染是极为造成产品的二次污染，因此蒸煮后防止二次污染是极为重要的。重要的。v由于单增李斯特氏菌在由于单增李斯特氏菌在44下仍然能生长繁殖，所以未加下仍然能生长繁殖，所以未加热的冰箱食品增加了食物中毒的危险。冰箱食品需加热热的冰箱食品增加了食物中毒的危险。冰箱食品需加热后再食用。后再食用。v李斯特氏菌的糖发酵试验主要包括哪些？李斯特氏菌的糖发酵试验主要包括哪些？v李斯特氏菌检验操作步骤有哪些？李斯特氏菌检验操作步骤有哪些？
