1、LCMSMS在食品检测分析中的应用在食品检测分析中的应用分析化学的两大核心问题分析化学的两大核心问题是什么（定性）分子量（m/z）同位素分布碎片（MS/MS）有多少（定量）标准曲线 灵敏度 准确度 重现性 线性范围内容提要内容提要 液相色谱的概念和分类 质谱的概念和分类 三重四级杆质谱的主要结构和功能 三重四级杆质谱在食品安全检测中的应用液相色谱质谱联用技术基本原理液相色谱质谱联用技术基本原理色谱法原理色谱法原理 色谱法的原理利用混合物中各组份在不同的两相中溶解，分配，吸附等化学作用性能的差异，当两相作相对运动时,使各组分在两相中反复多次受到上述各作用力而达到相互分离两相中有一相是固定的，叫作
2、固定相(Stationary Phase)，有一相是流动的，称为流动相(Mobile Phase)，流动相又叫洗脱剂或溶剂俄罗斯植物学家 Mikhail S.茨维特混合物 分离系统 作用力不同 移动速度不同 分离液相色谱质谱联用技术基本原理液相色谱质谱联用技术基本原理色谱法原理色谱法原理观众 博物馆 兴趣爱好不同 参观速度不同 分离液相的单泵结构液相的单泵结构液相的双泵结构液相的双泵结构制备液相制备液相HPLC/UPLC(UHPLC)内容提要内容提要 液相色谱的概念和分类 质谱的概念和分类质谱的概念和分类 三重四级杆质谱的主要结构和功能 三重四级杆质谱在食品安全检测中的应用质谱的基本概念质谱的
3、基本概念 质谱是什么？质谱是什么？一种测定各种物质的原子、分子质量的分析方法 一款特殊的天平 质质谱能做什么？谱能做什么？测量离子质量和信号强度 与色谱系统联用，可对单个或混合物进行定性定量分析 广泛应用于食品，环境，化工，生命科学，医学，药学，材料，能源和国防等领域 质谱的特点是什么？质谱的特点是什么？Specificity 特异性 Selectivity 选择性 Sensitivity 灵敏度 Speed 快 速质谱基本原理：质荷比质谱基本原理：质荷比m/z平均质量（分子量）平均质量（分子量）Average Mass277.190 Da精确质量精确质量Exact Mass276.07962
4、Da单同位素质量单同位素质量Monoisotopic Mass276.07962Da克仑特罗：C12H18Cl2N2O电离离子的质荷比，m/zH+质谱基本原理：同位素质谱基本原理：同位素、分辨率、分辨率Cl同位素质谱图Br同位素质谱图聚丙二醇，分辨率为1Da质谱图聚丙二醇，分辨率为0.7Da质谱图35Cl:37Cl=3:1Cl 3:1Cl2 9:6:1（例：克仑特罗）（例：克仑特罗）Cl3 27:27:9:179Br:81Br=1:1Br 1:1Br2 1:2:1BrCl 2:2:1同位素分布网页版计算器：http:/www.envipat.eawag.ch/index.php质谱发展历史质谱
5、发展历史JJ Tompson,1912MS prototypeFW Aston,1919First MSW Paul,1955QuadrupoleJ Fenn,1984ESIK Tanaka 1955SLD质谱的基本结构质谱的基本结构样品引入样品引入 离子化离子化质量分析器质量分析器质量分析质量分析 检测器检测器 检测检测数据分析数据分析离子源离子源+样品引入样品引入SolidLiquidVapor检测离子离子的形成(带电荷的离子)根据质荷比(m/z)分离质谱图质谱图质量分析器类型质量分析器类型四级杆离子阱飞行时间质谱轨道阱质谱质谱的分类（质谱的分类（1）质谱仪单级质谱串级质谱单四级杆质谱SQ
6、飞行时间质谱TOF静电场轨道阱质谱OrbiTrap串联四级杆质谱TQ离子阱质谱IT四级杆串联飞行时间质谱Q-TOF离子阱串联飞行时间质谱IT-TOF四级杆串联静电场轨道阱质谱Q-OrbiTrap离子阱串联静电场轨道阱质谱IT-OrbiTrap质谱的分类（质谱的分类（2）质谱仪低分辨质谱高分辨质谱单四级杆质谱SQ串联四级杆质谱TQ离子阱质谱IT静电场轨道阱质谱OrbiTrap四级杆串联静电场轨道阱质谱Q-OrbiTrap离子阱串联静电场轨道阱质谱IT-OrbiTrap飞行时间质谱TOF四级杆串联飞行时间质谱Q-TOF离子阱杆串联飞行时间质谱IT-TOF实验室的常规仪器实验室的常规仪器GC&GCM
7、SLCLCMS&LCMSMSGCMS与与LCMS的区别的区别大气压离子化接口大气压离子化接口大气压离子源（API)，是一种非常温和的、低能量离子化过程，很容易形成分子离子峰。利血平 m/z 609GCMS EI 源源 硬电离方式硬电离方式LCMS ESI 源源 软电离方式软电离方式Tim e0.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.50%01000.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.50AU0.01.0e-12.0e-13.0e-14.0e-15.0e-16.0e-17.0e-18.0e-10.574.51
8、0.884.163.793.071.581.673.484.244.663.48灵敏度灵敏度&选择性选择性UV Vs MS(B5,泛酸钙泛酸钙)UV检测器 MS检测器液相色谱液相色谱单四极杆单四极杆串联三重四极杆串联三重四极杆液相分离保留时间 选择离子扫描液相分离保留时间液相分离保留时间SIM选择离子扫描子离子扫描母离子扫描中性丢失扫描MRM 多反应监测更高的特异性，选择性和灵敏度更高的特异性，选择性和灵敏度液质联用技术的优点液质联用技术的优点 结合了液相色谱的强大分离功能，对极性化合物分析无须衍生化 可检测多种弱极性或强极性的化合物 结合了质谱分析的高选择性，高特异性，高灵敏度，高稳定性，特
9、别适合于低含量的检测分析 样品处理简单，易于自动化，分析通量高 分析复杂样品时干扰小，数据准确度高，可信度高 内容提要内容提要 液相色谱的概念和分类 质谱的概念和分类 三重四级杆质谱的主要结构和功能三重四级杆质谱的主要结构和功能 三重四级杆质谱在食品安全检测中的应用即插即用即插即用配件安装替换不依赖工具减少80%布线QSightTM三重四极杆质谱的创新设计三重四极杆质谱的创新设计第一台直立四级杆质谱系统第一台直立四级杆质谱系统尺寸:50 x50 x110 cm最小的占地面积节省实验室空间节省实验室空间无无须专门配备减震试验台须专门配备减震试验台模块化的设计模块化的设计易于维护大大提高维修速度智
10、能智能完整的诊断软件可远程控制全球首台直立式的三重四极杆质谱全球首台直立式的三重四极杆质谱三重四极杆质谱的结构特点三重四极杆质谱的结构特点离子产生离子产生质谱接口质谱接口离子传输离子传输离子选择离子选择生成碎片生成碎片再次选择再次选择离子检测离子检测串联四级杆质谱的核心串联四级杆质谱的核心四级杆的两个功能：选择离子监测选择离子监测 （SIM）全扫描（全扫描（SCAN）串联四极杆质谱的工作模式串联四极杆质谱的工作模式扫描 Q1 和 Q3同时计算质量数差异中性丢失扫描子离子扫描过滤母离子扫描子离子扫描母离子母离子扫描过滤子离子多反应监测(MRM)过滤母离子过滤子离子Q1 SIMQ3 ScanQ1
11、ScanQ3 SIMQ1 ScanQ3 ScanQ1 SIMQ3 SIM碰撞气碰撞气MRM原理原理母离子母离子子离子子离子Q1 质量过滤器Q2 碰撞池Q3 质量过滤器磺胺 Q1母离子m/z 21515 evQ3子离子m/z 156 国标中对国标中对LCMSMS方法的要求方法的要求国标中对国标中对LCMSMS方法的要求方法的要求标准品标准品样品样品内容提要内容提要 液相色谱的概念和分类 质谱的概念和分类 三重四级杆质谱的主要结构和功能 液相三液相三重四级杆质重四级杆质谱在食品检测分析中的应用谱在食品检测分析中的应用“毒鸡蛋毒鸡蛋”食品安全突发事件食品安全突发事件欧洲欧洲“毒鸡蛋毒鸡蛋”事件事件“
12、毒鸡蛋毒鸡蛋”氟虫腈是个什么鬼？离你我有多远呢？氟虫腈是个什么鬼？离你我有多远呢？氟虫腈（商品名：锐劲特）是首个用于有害生物防治的苯吡唑类杀虫剂，1987年由罗纳普朗克农公司（现属拜耳公司）研制，广泛用于农业和兽医等多个领域。氟虫腈有一种“通杀”的效果，对一些有益于作物生长的动物如蜜蜂、蝴蝶等也有着强烈的毒性氟虫腈能够过量刺激啮齿类动物的甲状腺激素分泌，而有可能形成甲状腺癌；氟虫腈对人体的神经、消化和循环系统等都有明显的毒副作用。氟虫腈在外界环境中能够代谢生成毒性更高的氟虫腈砜和氟虫腈亚砜等化合物。最常见的三种代谢物为氟甲腈、氟虫腈砜和氟虫腈亚砜。表表1 氟虫腈已知代谢物列表氟虫腈已知代谢物列
13、表崔新仪,储晓刚,王大宁,等.氟虫腈及其代谢物的研究进展A.农药,2008,47(2),1-4氟虫腈代谢物产生路径：氟虫腈代谢物产生路径：氟虫腈氟虫腈砜MB46136氟甲腈MB46513氟虫腈硫醚MB45950氧化反应还原反应脱硫反应光解作用主要产物体内代谢主要产物体内代谢主要产物氧化氧化还原作用还原作用关于氟虫腈国内外法规规定关于氟虫腈国内外法规规定 国内法规：GB2763-2016食品中农药最大残留限量已制定了氟虫腈24项植物源性食品残留限量标准，限量在0.02-0.1mg/kg之间，但对于其在蛋类和禽类中的最大残留限量没有做出规定。农业部组织制定了农药每日允许摄入量制定指南中规定了氟虫腈
14、每日允许摄入量ADI：0.0002 mg/kg bw。2009年发布了氟虫腈限用管理规定：除卫生用、玉米等部分旱田种子包衣剂外，在我国境内停止销售和使用用于其他方面的含氟虫腈成分的农药制剂。关于氟虫腈国内外法规规定关于氟虫腈国内外法规规定 国外法规：国际食品法典（CAC）和日本食品安全标准中规定，氟虫腈在蛋中的最大残留限量为0.02 mg/kg；美国相关标准规定，氟虫腈在蛋中的最大残留限量为0.03 mg/kg；欧盟法规(EU)No.1127/2014中规定了，蛋类中氟虫腈（氟虫腈+氟虫腈砜）的残留限量为0.005mg/kg。PE公司第一时间推出公司第一时间推出鸡蛋中氟虫腈及其代谢物的检测方法
15、鸡蛋中氟虫腈及其代谢物的检测方法PerkinElmer携手食品安全检测研发联合实验室广州甘蔗糖业研究所共同开发建立高效液相串联质谱法测定鸡蛋中氟虫腈及其代谢物检测整体解决方案。样品前处理方法样品前处理方法液相色谱条件液相色谱条件 色谱柱:Brownlee SPP C18,100mm*2.1mm,2.7m 柱温:35 流速:0.4 mL/min 流动相:A:水 B:乙腈 梯度洗脱条件：TimeA/%B/%0.0060402.805954.05954.160406.006040质谱参数质谱参数MS:Qsight 220离子源模式：电喷雾离子源，负离子模式（ESI-）反吹气:100雾化气:180离子
16、源温度:450离子源喷雾电压:-5000V质谱参数质谱参数化合物Q1m/zQ3m/z碰撞能量CE/eV氟虫腈434.8329.823434.8249.836氟虫腈砜450.8281.836450.8243.866氟甲腈386.8350.819386.8281.844氟虫腈硫醚418.8382.820418.8261.839氟虫腈及其代谢物提取离子色谱图氟虫腈及其代谢物提取离子色谱图鸡蛋基质配标曲线：鸡蛋基质配标曲线：0.05-10.0 g/L营养成分分析营养成分分析 Nutrition Label Claims婴幼儿奶粉中乳清蛋白的检测方法婴幼儿奶粉中乳清蛋白的检测方法营养成分分析营养成分分析
17、 Nutrition Label Claims-乳白蛋白乳白蛋白 牛奶蛋白分为酪蛋白(80%)和乳清蛋白(20%)；乳清蛋白中重要的是-乳白蛋白，-乳球蛋白和乳铁蛋白等-乳白蛋白是一种主要的乳清蛋白，对婴幼儿发育至关重要，需要在奶粉中强化。牛乳中-乳白蛋白由123个氨基酸组成，平均分子量为14186 Da。由于在生产加工过程中，-乳白蛋白因加热而使其蛋白质四级结构发生变化，所产生的的多电荷随之发生变化，直接测定结果往往不准确。使用牛胰蛋白酶将蛋白质酶解成多肽后由MRM检测，成为稳定可靠的方法。-lactalbumin-乳白蛋白的氨基酸序列和乳白蛋白的氨基酸序列和Trypsin酶解后的肽段酶解后
18、的肽段-乳白蛋白的检测方法开发乳白蛋白的检测方法开发序列Q1Q3ILDK 488 262EQLTK618129VGINYWLAHK1201110酶解过程酶解过程 称取1 g样品，加水至100 mL超声溶解 取500 uL加500 mM NH4HCO3溶液，加入10 uL 500 mM DTT溶液，混匀，50恒温静置30 min 冷却至室温后加入30 uL 500 mM IAA溶液，暗处静置30 min后加入10 uL100 mM CaCl2溶液和30 uL 100 ug/mL的胰蛋白酶溶液 与37恒温水浴摇床中过夜去除，加20 uL甲酸终止酶解反应，室温静置1 h 用0.1%甲酸水溶液定容至1
19、0 mL，12000转离心5 min后过0.22 um滤膜上样LC 条件C18 色谱柱梯度分离流动相：0.1%FA H20+0.1%FA ACN酶解蛋白酶解蛋白优化优化LCMSMS-乳白蛋白的检测乳白蛋白的检测胰蛋白酶酶解肽段胰蛋白酶酶解肽段ILDK m/z 488 EQLTKm/z 618VGINYWLAHKm/z 601乳制品中乳制品中-乳白蛋白的检测结果乳白蛋白的检测结果母乳母乳婴幼儿奶粉婴幼儿奶粉酸奶酸奶牛奶牛奶花椒、萝卜样品成分分析花椒、萝卜样品成分分析样品信息样品信息 客户 某学院的烹饪系 样品花椒；萝卜 要求检测样品中成分及含量 实验方案 使用预测型预测型MRM来对样品进行目标筛
20、查-花椒可能的成分主要为挥发油类、酰胺类、木质素类和黄酮类化合物，因挥发油多为GCMS检测，本实验重点检测后面三类。-萝卜可能的成分主要为糖苷或甙，其次为小分子有机酸，本实验重点检测这两类化合物-通过峰高的强弱初步判断化合物的含量高低实验思路实验思路 液相三重四极杆质谱预测型MRM实验思路一般情况下MRM是由Q1母离子和Q3碎片离子来组成一个离子对，在未知物筛查和定性实验中，根据样品信息可以在MRM中设置成Q1和Q3相同的离子对，这样的设置可看为假的MRM，简称为MIM。MIM的效果使得方法的灵敏度和特异性都能大大增强，在此基础上，根据碎片信息在同一个方法中附加上MRM离子对，对结果进行再次确
21、认。实验结果有母离子，碎片离子和相同的保留时间和峰形这几个信息共同参考，大大提高结果的准确性。MIM:母离子和碎片离子都为291MRM:母离子为291，碎片离子为139如右上图所示，291-291的MIM离子对的色谱图，存在6.87 min和7.35 min两个色谱峰，很难判断具体哪个是对应的化合物，加上右下图291-139的MRM离子对的信息，大幅去除了背景噪音并提高了方法的特异性，很容易就看出6.87 min的色谱峰即为m/z 291对应的色谱峰，从而排除7.35 min色谱峰。花椒检测结果小结花椒检测结果小结序序号号英文名称英文名称中文名称中文名称母离子母离子M+H+碎片离子碎片离子M+
22、H+1Catechin儿茶酸*2911392Rutin/Hesperidin芸香苷/橘皮苷6113033Hydroxy-sanshool-羟基山椒素*264246,175,147,139,1074Xanthoxylin花椒油素*1971795Sesamin/Asarinin芝麻素/细辛脂素*355337,319,203,162,1356-Sanshool-花椒麻素*248175,1477Zanthosin356175,1458Vitexin/Isovitexin牡荆素/异牡荆素*433415,397,313,2839N-(4-methoxy-phenethyl)-3,4-dimethoxy-c
23、innamamideN-(4-甲氧基-苯乙基)-3,4-二甲氧基-肉桂酰胺*342191,163,135萝卜检测结果小结萝卜检测结果小结序序号号英文名称英文名称中文名称中文名称母离子母离子M-H-碎片离子碎片离子M-H-1Glucoiberin屈曲花苷*422259,1622Glucoraphanin萝卜硫苷4363723N-butyl-or Isobutyl-or Methyl propyl-glucosinolate正丁基/异丁基/甲基丙基-芥子油苷*3749744-hydroxy glucobrassicin4-羟基芸苔葡萄糖硫甙4632695Gluconapin丁烯基硫甙*372259
24、,1956Methoxy glucobrassicin甲氧基芸苔葡萄糖硫甙*477259,977Glucobrassicanapin葡萄糖异硫氰酸戊-4-烯酯386978Gluconapoleiferin/C6-aliphatic glucosinolate402195,979Protocatechui acid原儿茶酸15310910Caffeic acid咖啡酸17913511Ferulic acid 阿魏酸193177,13412Coumaric acid香豆酸163119检出成分提取离子流图检出成分提取离子流图 下图为检出成分提取离子流图，从各检出化合物的峰高和峰面积的大小可以初步看出
25、含量高低，各化合物详细谱图参见后面内容。花椒花椒萝卜萝卜ABCD萝卜信号比较高的化合物：萝卜信号比较高的化合物：a 丁烯基硫甙（Rt 1.76 min）b 芥子油苷（Rt 1.74 or 2.73 min）c 屈曲花苷（Rt 7.66 min）abc实验条件实验条件样品处理样品处理o 取100 mg花椒粉末于离心管中，加5 ml甲醇水（甲醇/水，1:4）；o 涡旋混匀超声提取5 min后10000转离心5 min；o 取上清液，过0.22 um 滤膜后上LCMSMS检测。*萝卜样品处理同上花椒粉末溶解和超声离心最终样品实验条件实验条件液相条件液相条件 LC Method PerkinElmer
26、 Altus A30 UPLC System Column:Brownlee SPP C18 aq column 2.1x100 mm,3.0 um Mobile Phases:A:Water,containing 0.1%Formic Acid;B:MeOH Flow rate:0.3 mL/min Gradient:5%-95%B in 20 minutes Column Oven:40实验条件实验条件质谱条件质谱条件 MS Method MS:QSight 210 Ion Source:ESI POS/NEG Mode Dry Gas:90 Nebulizer Gas:180 Sourc
27、eTemp:400 IS:5000/-5500 v实验结果实验结果花椒花椒-羟基山椒素（羟基山椒素（Rt 11.45 min）实验结果实验结果花椒花椒花椒油素（花椒油素（Rt 8.05 min）芝麻素芝麻素/细辛脂素（细辛脂素（Rt 5.37 or 6.66 min）实验结果实验结果萝卜萝卜屈曲花苷（屈曲花苷（Rt 7.66 min）萝卜硫苷（萝卜硫苷（Rt 1.15 min）实验结果实验结果萝卜萝卜丁烯基硫甙（丁烯基硫甙（Rt 1.76 min）真假蜂胶的鉴定真假蜂胶的鉴定 Cheng-Yuan Cai Mass Product Specialist 2017-02-15蜂蜜与蜂胶蜂蜜与蜂胶
28、蜂蜜蜂蜜因蜂种、蜜源、环境之不同，其化学组成有很大差异。其主要成分是果糖和葡萄糖果糖和葡萄糖，两者含量合计约占70%，尚含少量蔗糖、麦芽糖、糊精、树胶以及含氮化合物、有机酸、挥发油、色素、蜡、天然香料、植物残片（特别是花粉粒）、酵母、酶类、无机盐等。蜂胶蜂胶是一种极为稀少的天然资源，素有“紫色黄金”之称。蜂胶的成分中，最具代表性的活性物质是黄酮类黄酮类化合物。黄酮化合物包括黄酮类、黄酮醇类和双氢黄酮类等，约占蜂胶的4.13%，代表性的有槲皮素、芦丁等样品信息样品信息 客户 University of Indonesia 样品 Bee Propolis 检测要求 鉴别真伪蜂胶制品 实验设计 使用
29、预测型MRM（pMRM）检测两个未知样品实验条件实验条件 样品处理样品处理 取取0.5 g样品溶解于样品溶解于 4.5 mL Water/MeOH(9:1)中中 过过0.22 um滤膜后进样分析滤膜后进样分析 LC方法方法 PerkinElmer Altus A30 UPLC System Column:Brownlee SPP C18 aq column 2.1x100 mm,3.0 um Mobile Phases:A:Water,containing 0.1%Formic Acid;B:Acetonitrile Flow rate:0.3 mL/min Gradient:0%-95%B
30、in 20 minutes Column Oven:40实验条件实验条件 MS方法方法 MS:QSight 210 Ion Source:ESI NEG Mode Dry Gas:90 Nebulizer Gas:180 SourceTemp:400 IS:-5500 v Predicted MRMPolyphenols NameQ1 M-H-Q3 M-H-Gallic acid169169,125Protocatechuic acid153153,109Caffeic acid179179,135Ferulic acid193193,177,134Chlorogenic acid353353
31、,191,179para-Coumaric acid163163,119ortho-Coumaric acid163163,119Luteolin285285,151,133Apigenin269269,151,117Rutin609609,301,271Naringenin271271,151,119Pinocembrin255255,213,151实验结果实验结果-TIC总离子流图总离子流图Sample ASample B结果结果-Gallic acid 没食子酸没食子酸(Rt 3.92 min)Sample ASample B结果结果-Rutin 芦丁芦丁 (Rt 8.24 min)Sa
32、mple ASample BResults summary 12 Polyphenols were found in samples.(*note:relative quantification)Polyphenols NameSample ASample BAbundanceSample A*AbundanceSample B*Gallic acidyesno+Protocatechuic acidyesyes+Caffeic acidunknown Ferulic acidyesyes+Chlorogenic acidyesyes+para-Coumaric acidyesunknown+ortho-Coumaric acidyesunknown+Luteolinyesyes+Apigeninyesno+Rutinyesyes+Naringeninyesno+Pinocembrinyesno+总结总结 液相色谱的概念和分类 质谱的概念和分类 三重四级杆质谱的主要结构和功能 三重四级杆质谱在食品安全检测中的应用 两种思路的方法开发蔡成元蔡成元cheng-
