1、目的要求目的要求掌握：掌握：Ficoll-hypaque分层液分离分层液分离PBMC的的原理、方法，淋巴细胞亚群分离的原理、原理、方法，淋巴细胞亚群分离的原理、方法及应用，方法及应用，T细胞增殖试验的方法，细胞增殖试验的方法，B细细胞的数量及功能的检测；胞的数量及功能的检测；熟悉：熟悉：T细胞功能的体内试验，细胞功能的体内试验，T细胞介导的细胞介导的细胞毒检测的方法；细胞毒检测的方法；了解：了解：淋巴细胞的纯化与亚群分离的方法、淋巴细胞的纯化与亚群分离的方法、吞噬细胞的分离方法、溶血空斑试验。吞噬细胞的分离方法、溶血空斑试验。第一节第一节 免疫细胞的分离免疫细胞的分离免疫细胞的分离及检测免疫细
2、胞的分离及检测检测：检测：各类免疫细胞及其亚群的数量和各类免疫细胞及其亚群的数量和功能测定功能测定方法：方法：体外法为主体外法为主目的：目的：判断机体免疫状态判断机体免疫状态意义：意义：探讨疾病的发病机制、发展、预后、疗效探讨疾病的发病机制、发展、预后、疗效免疫细胞的分离免疫细胞的分离 是指将各种参与免疫反应的是指将各种参与免疫反应的 细胞从血液或组织中分离出来细胞从血液或组织中分离出来 3 免疫细胞的起源与分化免疫细胞的起源与分化 红细胞 血小板 肥大细胞 中性粒细胞 巨噬细胞 树突状细胞 浆细胞 T细胞 NK细胞免疫细胞种类免疫细胞的分离流程免疫细胞的分离流程外周血外周血PBMC纯淋巴细胞
3、纯淋巴细胞T、B细胞细胞TC亚群亚群/BC亚群亚群 PBMCPBMC包括：淋巴细胞、单核细胞包括：淋巴细胞、单核细胞 各种血细胞比重不同各种血细胞比重不同,利用密度梯度离心进行分离利用密度梯度离心进行分离 常用分层液：常用分层液：ficollhypaque，percoll一、一、外周血单个核细胞的分离和纯化外周血单个核细胞的分离和纯化细胞细胞比重比重血小板血小板1.0301.035PBMC1.0751.090多核白细胞多核白细胞1.092红细胞红细胞1.093外周血各细胞成分的密度 Ficoll分离液法分离液法是一种单次差速密度梯度离心是一种单次差速密度梯度离心的分离法，主要用于分离外周血中的
4、单个核细胞。的分离法，主要用于分离外周血中的单个核细胞。Ficoll分层液：密度分层液：密度1.0771.0770.0010.001 离心：密度梯度离心离心：密度梯度离心 分离：各类细胞按其相应密度重新分布分离：各类细胞按其相应密度重新分布一、一、Ficoll分离法分离法Ficoll分层液分离单个核细胞示意图二、淋巴细胞的分离二、淋巴细胞的分离 纯淋巴细胞群的采集纯淋巴细胞群的采集 原理：利用单核细胞在原理：利用单核细胞在37和和Ca离子存在离子存在条件下，能主动粘附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉条件下，能主动粘附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶的特性，据此建立许多从单花纤维或葡聚糖凝胶的
5、特性，据此建立许多从单个核细胞中除去单核细胞的方法，以获得高纯度个核细胞中除去单核细胞的方法，以获得高纯度的淋巴细胞群。的淋巴细胞群。(一一)粘附贴壁法粘附贴壁法因因B细胞也有贴壁现象，因此，本法分离细胞也有贴壁现象，因此，本法分离的淋巴细胞群中的淋巴细胞群中B细胞有所损失。细胞有所损失。(二二)吸附柱过滤法吸附柱过滤法 将单核将单核 细胞吸附于玻璃柱中，洗脱下来的细胞吸附于玻璃柱中，洗脱下来的主要是淋巴细胞主要是淋巴细胞(三三)磁铁吸引法磁铁吸引法 利用单核细胞具有吞噬的特性，在利用单核细胞具有吞噬的特性，在悬液中加入羰基铁颗粒，待单核细悬液中加入羰基铁颗粒，待单核细胞吞噬铁颗粒后，用磁铁将
6、细胞吸胞吞噬铁颗粒后，用磁铁将细胞吸至管底，上层液中含较纯的淋巴细至管底，上层液中含较纯的淋巴细胞群。胞群。7898（四）Percoll分离法返回章目录返回章目录三、T、B细胞和T细胞亚群的分离 免疫磁珠分离法免疫磁珠分离法 流式细胞术分离法流式细胞术分离法 其他方法其他方法（一）免疫磁珠分离（一）免疫磁珠分离法法 488 nm 激光激光+-前向散射光前向散射光检测器检测器 荧光检测器荧光检测器电磁场电磁场单个细胞被分类单个细胞被分类进入检测管进入检测管流流式式细细胞胞术术分分离离原原理理示示意意图图 第二节第二节 淋巴细胞表面标志淋巴细胞表面标志的检测及亚群分类的检测及亚群分类一、一、T细胞
7、表面标志及亚细胞表面标志及亚群群CD4+TCD8+TCD3+CD4+CD8-CD3+CD4-CD8+主要为主要为Th（help T cell）辅助性）辅助性T细胞细胞主要为主要为Tc（cytotoxic T cell）细胞毒性）细胞毒性T细胞细胞二、二、B细胞表面标志及亚群亚群细胞表面标志及亚群亚群NK细胞典型标志：细胞典型标志：CD56和和CD16三、三、NK细胞表面标志细胞表面标志第三节第三节 抗原提呈细胞表面标志抗原提呈细胞表面标志抗原提呈细胞（抗原提呈细胞（APCAPC）：）：是指能摄取、加工、处理抗原，并将抗原信息提呈是指能摄取、加工、处理抗原，并将抗原信息提呈给抗原特异性淋巴细胞的
8、一类免疫细胞。给抗原特异性淋巴细胞的一类免疫细胞。单核单核-巨噬细胞巨噬细胞树突状细胞树突状细胞（1）分泌TNF-、NO、反应氧中间产物及蛋白水解酶等（2）ADCC效应（3）激活T细胞产生细胞因子等活化巨噬细胞协同杀伤肿瘤细胞。（一）（一）单核吞噬细胞（CD14）1.吞噬和杀伤作用 2.杀伤肿瘤细胞 形态呈树突样 具有一些相对特征性表面标志 抗原提呈能力强能激活初始T细胞 免疫应答的始动者二、树突状细胞二、树突状细胞 （dendritic cells，DC）特征：1.起源于造血干细胞 由髓样干细胞（多数）、淋巴干细胞分化。2.表面标志丰富 如：MHC类分子及类分子、B7-1和B7-2、CD40
9、、CD1以及粘附分子等。3.分泌多种细胞因子 IL-1、IL-6、IL-12、TNF-、IFN-等。DCDC主要标志：主要标志：CD1aCD1a、CD11cCD11c、CD83CD83第四节第四节 T细胞功能检测细胞功能检测 一、一、T细胞功能检测细胞功能检测淋巴细胞淋巴细胞DNADNA合成合成分化分化母细胞母细胞刺激物刺激物细胞变大细胞变大细胞浆扩大细胞浆扩大空泡空泡核仁明显核仁明显核染色质疏松核染色质疏松（一）（一）T淋巴细胞增殖试验淋巴细胞增殖试验 形态学检查法形态学检查法 3H-TdR3H-TdR掺入法掺入法 MTTMTT比色法比色法 淋巴细胞转化的检测方法淋巴细胞转化的检测方法形态学
10、检查法形态学检查法 转化的淋巴细胞转化的淋巴细胞未转化的淋巴细胞未转化的淋巴细胞淋巴母细胞淋巴母细胞 过渡型过渡型细胞大小细胞大小(直径直径m)m)12122020121216166 68 8核大小、染色质核大小、染色质增大、疏松增大、疏松增大、疏松增大、疏松不增大、密集不增大、密集核仁核仁清晰、清晰、1 14 4个个有或无有或无无无有丝分裂有丝分裂有或无有或无无无无无胞质、着色胞质、着色增多、嗜碱增多、嗜碱增多、嗜碱增多、嗜碱极少、天青色极少、天青色浆内空泡浆内空泡有或无有或无有或无有或无无无伪足伪足有或无有或无有或无有或无无无未转化和转化淋巴细胞的形态特征未转化和转化淋巴细胞的形态特征原理
11、：原理：刺激物刺激物3756hG1期期 S1期期 合成合成DNADNA 3H-TdR3716hDNA-3H-TdR测淋巴细胞内放射量（测淋巴细胞内放射量（cpmcpm）计算计算SISI判断淋巴细胞转化程度判断淋巴细胞转化程度外周血（外周血（T T）G G0 0期期3H-TdR掺入法掺入法评价：该方法敏感性高、客观性强、重复评价：该方法敏感性高、客观性强、重复性好、可自动操作；设备昂贵、放射污染性好、可自动操作；设备昂贵、放射污染。刺激指数（刺激指数（stimulating indexstimulating index，SI SI）SI=SI=试验管试验管cpmcpm均值均值/对照管对照管cpm
12、cpm均值均值3H-TdR掺入法掺入法放射性测定放射性测定3H-TdR丝裂原（抗原）刺激丝裂原（抗原）刺激淋淋巴巴细细胞胞转转化化试试验验原原理理示示意意3H-TdR摻入法摻入法原理原理:用刺激剂体外激活淋巴细胞，用蛋白转运抑用刺激剂体外激活淋巴细胞，用蛋白转运抑制如莫能霉素阻止细胞因子分泌到细胞外，细胞制如莫能霉素阻止细胞因子分泌到细胞外，细胞内蛋白质转运方式被打乱，引起细胞因子向高尔内蛋白质转运方式被打乱，引起细胞因子向高尔基体积聚，用流式细胞仪便可测出淋巴细胞内的基体积聚，用流式细胞仪便可测出淋巴细胞内的细胞因子种类，从而确定细胞因子种类，从而确定TH1/TH2TH1/TH2细胞的百分率
13、。细胞的百分率。淋巴细胞内细胞因子检测淋巴细胞内细胞因子检测（二）（二）T细胞分泌功能检定细胞分泌功能检定分泌的细胞因子分泌的细胞因子 Thl Th2Thl Th2 IL-2 +-IFN-+-TNF-+IL-3 +GM-CSF +TNF-+IL-4 -+IL-5 -+IL-6 -+IL-10 -+Thl和和Th2分泌的细胞因子分泌的细胞因子原理原理:靶细胞抗原靶细胞抗原T T细胞细胞观察杀伤活力观察杀伤活力致敏致敏CTLCTL靶细胞靶细胞（三）（三）T细胞介导的细胞毒试验细胞介导的细胞毒试验 试验方法试验方法:同位素法同位素法 淋巴细胞（淋巴细胞（CTLCTL）+含含51Cr 51Cr 的肿瘤
14、细胞的肿瘤细胞 肿瘤细胞破坏肿瘤细胞破坏 51Cr 51Cr 释放释放 测定测定射线射线51Cr特异释放率=均值对照孔均值最大释放孔均值对照孔均值试验孔cpmcpmcpmcpm100%（三）（三）T细胞介导的细胞毒试验细胞介导的细胞毒试验（三）（三）T细胞介导的细胞毒试验细胞介导的细胞毒试验背景无效应细胞背景无效应细胞效应细胞效应细胞/靶细胞靶细胞 1:1效应细胞效应细胞/靶细胞靶细胞 5:1效应细胞效应细胞/靶细胞靶细胞 20:1细胞溶解细胞溶解特异性抗原皮肤试验特异性抗原皮肤试验PHAPHA皮肤试验皮肤试验（四）体内试验（四）体内试验溶血空斑试验溶血空斑试验酶联免疫斑点试验酶联免疫斑点试验
15、体内试验体内试验二、二、B细胞功能检测细胞功能检测（一）溶血空斑试验（一）溶血空斑试验溶血斑溶血斑补体抗血清包被抗血清包被绵羊红细胞绵羊红细胞（二）酶联免疫斑点法（二）酶联免疫斑点法抗体产生抗体产生B细胞细胞抗原抗原包被包被酶联抗酶联抗抗体抗体凝胶底物凝胶底物显色显色刺激体内刺激体内抗体产生的特异性抗原有抗体产生的特异性抗原有白喉类毒素白喉类毒素、破伤风类毒素破伤风类毒素、多价肺炎多价肺炎链球菌链球菌等等。将适量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫前将适量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫前及免疫后及免疫后1 1周、周、2 2周、周、3 3周分别采血，分离血清，周分别采血，分离血清，测定受检者免疫前
16、后相应抗体的效价，判断受测定受检者免疫前后相应抗体的效价，判断受检者体内检者体内B B细胞的细胞的功能。功能。（三）体内试验（三）体内试验染色计数染色计数离心取上清离心取上清测测LDHLDH或或AKPAKP测发光强度测发光强度测测CPMCPM值值形态法形态法酶释法酶释法放射性核素释放射性核素释放法放法流式细胞术流式细胞术靶靶细细胞胞溶溶解解常用靶细胞常用靶细胞:K562:K562细胞株细胞株三、三、NK细胞活性检测细胞活性检测返回章目录返回章目录 大吞噬细胞大吞噬细胞:即单核即单核-吞噬细胞系统吞噬细胞系统 小吞噬细胞小吞噬细胞:即中性粒细胞即中性粒细胞第五节第五节 其他免疫细胞功能检测技术其
17、他免疫细胞功能检测技术吞噬细胞的种类吞噬细胞的种类特征性标志特征性标志 CD14CD14分离技术分离技术 PecollPecoll密度梯度分离法密度梯度分离法 流式细胞仪分离技术流式细胞仪分离技术 免疫磁珠分离法：为目前较常用的方法免疫磁珠分离法：为目前较常用的方法 黏附法黏附法一、吞噬细胞的分离一、吞噬细胞的分离（一）单核细胞的分离斑蝥敷贴法分离人巨噬细胞斑蝥敷贴法分离人巨噬细胞 动物的巨噬细胞直接从腹腔渗出液中获取动物的巨噬细胞直接从腹腔渗出液中获取 （二）巨噬细胞的分离（二）巨噬细胞的分离 聚合物加速沉降法聚合物加速沉降法 可从外周血中分离出白细胞可从外周血中分离出白细胞RBC血浆血浆(
18、抗凝血抗凝血)WBCRBC FicollFicoll分离法分离法 可从白细胞中分离出纯化的中性粒细胞可从白细胞中分离出纯化的中性粒细胞（三）中性粒细胞的分离（三）中性粒细胞的分离Ficoll-Hypaque密度梯度离心分离中性粒细胞密度梯度离心分离中性粒细胞吞噬细胞的吞噬活动大体分为吞噬细胞的吞噬活动大体分为趋化趋化、吞噬吞噬和和胞内杀胞内杀灭灭作用三个阶段，据此建立相应的检测方法。作用三个阶段，据此建立相应的检测方法。（一）中性粒细胞功能检测技术（一）中性粒细胞功能检测技术 （二）巨噬细胞功能检测技术（二）巨噬细胞功能检测技术二、相关功能检测二、相关功能检测细胞趋化功能的检测细胞趋化功能的检
19、测吞噬功能的检测吞噬功能的检测杀菌功能的检测杀菌功能的检测（一）中性粒细胞功能检测（一）中性粒细胞功能检测 体内试验法：皮肤窗法体内试验法：皮肤窗法 体外试验法：滤膜渗透法体外试验法：滤膜渗透法 琼脂糖平板法琼脂糖平板法 趋化功能检测趋化功能检测检测细胞运动功能检测细胞运动功能皮肤窗法皮肤窗法 在在受检者前臂屈侧中央受检者前臂屈侧中央3 3范围内，搔刮范围内，搔刮皮肤后，用盖玻片压紧固定，在第皮肤后，用盖玻片压紧固定，在第2 2，5 5，8 8，1212，2424，3636小时各取样一次，染色观察中性粒细胞聚集小时各取样一次，染色观察中性粒细胞聚集开始时间、聚集程度等。健康正常人一般开始时间、
20、聚集程度等。健康正常人一般2 23h3h后后开始聚集，达开始聚集，达5050100100个，个，6 6小时可达小时可达10001000个以上个以上。原理及技术要点原理及技术要点 在一特制的分上下两层的小盒，将趋化因子加在一特制的分上下两层的小盒，将趋化因子加入下室，待检细胞加入上室，两室用微孔滤膜分入下室，待检细胞加入上室，两室用微孔滤膜分隔，隔，3737温育数小时后，上室的中性粒细胞受下温育数小时后，上室的中性粒细胞受下室趋化因子的吸引，由滤膜微孔进入滤膜内，取室趋化因子的吸引，由滤膜微孔进入滤膜内，取滤膜清洗、固定、干燥、染色和透明，在高倍镜滤膜清洗、固定、干燥、染色和透明，在高倍镜下观察
21、细胞穿越滤膜的移动距离，从而判断其趋下观察细胞穿越滤膜的移动距离，从而判断其趋化功能。化功能。滤膜渗透法滤膜渗透法原理及技术要点原理及技术要点 在琼脂糖凝胶平板的中孔加白细胞悬液，左孔加在琼脂糖凝胶平板的中孔加白细胞悬液，左孔加趋化因子，右孔加对照液，温育趋化因子，右孔加对照液，温育48小时后，用显小时后，用显微镜测微器测定中性粒细胞向左孔的移动距离微镜测微器测定中性粒细胞向左孔的移动距离A和和向右孔的移动距离向右孔的移动距离B，计算趋化指数。，计算趋化指数。趋化指数趋化指数=A/B趋化指数越大，表明中性粒细胞运动功能越强趋化指数越大，表明中性粒细胞运动功能越强 琼脂糖平板法琼脂糖平板法 显微镜检查法显微镜检查法 100(%)计数的白细胞数吞噬细菌的白细胞数吞噬率吞噬指数=（一）中性粒细胞吞噬功能检测（一）中性粒细胞吞噬功能检测NBTNBT还原试验还原试验 原理：原理：N-N-C +H+N=N-R-N-NH2C N=NH四氮唑基（淡黄色）四氮唑基（淡黄色）甲甲chan（紫黑色）（紫黑色）杀菌功能检测杀菌功能检测 方法：方法：1.1.抗凝血抗凝血 +硝基蓝四氮唑（硝基蓝四氮唑（NBTNBT），），3737孵育孵育25min25min。2.2.推片染色、镜检。推片染色、镜检。正常值：正常值：NBTNBT阳性细胞率应阳性细胞率应95%95%NBT还原试验还原试验
