1、会计学1免疫细胞分离与免疫细胞功能检测及应免疫细胞分离与免疫细胞功能检测及应用用第1页/共73页第2页/共73页第3页/共73页第4页/共73页第5页/共73页第6页/共73页第7页/共73页第8页/共73页人的红细胞密度为1.093 粒细胞密度为1.092 单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为1.075-1.090 第9页/共73页不同细胞密度不同第10页/共73页1.单次密度梯度分离法 单次密度梯度 连续密度梯度第11页/共73页2.试剂：FicollHypaqueFicoll：聚蔗糖，MW：40 000，高密度，低渗透压、无毒性，6Ficoll密度为1.020Hypaque：泛影葡糖
2、胺，34 hypaque的密度为1.200，用于调整分离液的密度。分离人外周血单个核细胞用1.0770.001的密度分离液。第12页/共73页第13页/共73页4.收集细胞5.洗涤、计数第14页/共73页密度梯度离心(Ficoll)离心第15页/共73页第16页/共73页（去单核细胞）第17页/共73页缺点：B细胞也有较弱贴壁，使B细胞收率第18页/共73页BC TC=RBC第19页/共73页第20页/共73页l将PBMC加在分离液上低速离心后可分离PBMC中的单核细胞和淋巴细胞第21页/共73页第22页/共73页l加入细胞悬液，IMB上的Ab与细胞表面的Ag反应，形成抗体/抗原的复合物。l外
3、加磁场，分选出结合有免疫细胞的IMB。第23页/共73页磁珠大小可以选择第24页/共73页第25页/共73页第26页/共73页免疫磁珠法细胞分选过程第27页/共73页免疫磁珠细胞分选装置特点:简便,快速,费用低,无需特殊设备第28页/共73页全自动细胞分选系统第29页/共73页荧光激活细胞分离仪分离法 第30页/共73页流式细胞分析仪第31页/共73页第32页/共73页适用于T、B细胞的分离已知CD抗原细胞亚群的分离未知CD抗原细胞亚群的分离（阴性分选）第33页/共73页第34页/共73页Th1细胞细胞CD3+CD4+CD30-Th2细胞细胞CD3+CD4+CD30+分泌IL-2、IFN-、T
4、NF-，辅助细胞免疫分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10，辅助体液免疫参与迟发型超敏反应参与速发型超敏反应具有明显的细胞毒作用没有明显的细胞毒作用第35页/共73页第36页/共73页第37页/共73页特点特点B1(CD19+CD5+)B2(CD19+CD5-）发生时间早晚分布（成年）腹腔、胸腔周围免疫器官针对抗原多糖抗原蛋白质抗原抗体产生细菌抗原及自身抗原广谱抗原抗体种类IgMIgGIgGIgM更新情况自我更新不断新生（骨髓）第38页/共73页第39页/共73页T细胞及NK细胞第40页/共73页第41页/共73页第42页/共73页作用）作用）第43页/共73页体内试验体内试验第44页/
5、共73页淋巴细胞DNA合成分化母细胞刺激物细胞变大细胞浆扩大空泡核仁明显核染色质疏松第45页/共73页 未转化和转化淋巴细胞的形态特征未转化和转化淋巴细胞的形态特征转化的淋巴细胞转化的淋巴细胞未转化的淋巴细未转化的淋巴细胞胞淋巴母细胞淋巴母细胞 过渡型过渡型细胞大小细胞大小(直径直径m)m)12122020121216166 68 8核大小、染色质核大小、染色质增大、疏松增大、疏松增大、疏松增大、疏松不增大、密集不增大、密集核仁核仁清晰、清晰、1 14 4个个有或无有或无无无有丝分裂有丝分裂有或无有或无无无无无胞质、着色胞质、着色增多、嗜碱增多、嗜碱增多、嗜碱增多、嗜碱极少、天青色极少、天青色
6、浆内空泡浆内空泡有或无有或无有或无有或无无无伪足伪足有或无有或无有或无有或无无无第46页/共73页第47页/共73页 形态法：刺激物 淋巴细胞（4-6天）母细胞化 同位素法：PHA 淋巴细胞（54h）DNA合成期 +3HTdR掺入 收集细胞 检测射线 测定细胞内的3HTdR第48页/共73页%100胞数转化和未转化的淋巴细转化的淋巴细胞数转化率第49页/共73页性较差。性较差。第50页/共73页均值对照孔A均值试验孔A570nm570nmSI 第51页/共73页第52页/共73页靶细胞抗原T细胞观察杀伤活力致敏CTL靶细胞第53页/共73页意义：肿瘤患者CTL杀伤肿瘤细胞的能力 第54页/共7
7、3页图图15-2 T15-2 T细胞细胞毒试验示意图细胞细胞毒试验示意图第55页/共73页第56页/共73页第57页/共73页B细胞增殖形态学3HTdR掺入法第58页/共73页第59页/共73页第60页/共73页第61页/共73页第62页/共73页第63页/共73页第64页/共73页染色计数离心取上清测LDH或AKP离心取沉淀测活细胞荧光测发光强度测CPM值形态法酶释法荧光法同位素法化学发光法靶细胞溶解常用靶细胞:K562细胞株第65页/共73页第六节 免疫细胞表面标志和功能检测的临床应用淋巴细胞表面标志检测是评价免疫功能的重要指标。对CD4+和CD8+T细胞的测定，有助于免疫缺陷疾病、自身免疫性疾病和移植排斥反应的监测。第66页/共73页反映机体免疫功能状态。肿瘤、免疫缺陷病等疾病的诊断和疾病预后监测。组织器官移植后对受者的细胞免疫学功能监测则有利于排斥反应的早期发现，以便及时采取有效措施。第67页/共73页第68页/共73页第69页/共73页第70页/共73页第71页/共73页第72页/共73页
