1、第第1 1节节 发酵的概念及一般工艺过程发酵的概念及一般工艺过程 第第2 2节节 菌种选育菌种选育 第第3 3节节 发酵类型发酵类型 第第4 4节节 发酵工艺过程控制发酵工艺过程控制 第第5 5节节 发酵产物提取与精制发酵产物提取与精制 第第6 6节节 污染防止与挽救污染防止与挽救 第第1 1节节 发酵的概念及一般工艺过程发酵的概念及一般工艺过程 一、发酵的概念一、发酵的概念 二、发酵的一般工艺过程二、发酵的一般工艺过程 nQ:你认为什么是发酵？一、发酵的概念一、发酵的概念n传统发酵：在我国，人们习惯把通过微生物纯种或混种作用后，不经过单一成分的分离提取和精制，获得的成分复杂、有较高风味要求的
2、食品生产称为发酵，也即酿造。n如啤酒、葡萄酒、黄酒、白酒等酒类发酵及酱油、食醋、酱品、豆豉、腐乳、盐渍菜、酸泡菜、酸奶等调味和发酵食品的生产，均称为酿造一、发酵的概念一、发酵的概念n广义发酵：指微生物在无氧或有氧条件下，通过分解代谢或合成代谢或次生代谢等微生物代谢活动，大量积累人类所需的微生物体或微生物酶或微生物代谢产物的所有过程。n如有机溶剂、抗生素、有机酸、酶制剂、氨基酸等的生产，均称为发酵。发酵工程发酵工程提供微生物适宜生长条件，利用微生物的某种特定功提供微生物适宜生长条件，利用微生物的某种特定功能，通过现代化的技术手段，生产出所需要的产品。能，通过现代化的技术手段，生产出所需要的产品。
3、菌体或菌体代菌体或菌体代谢产物谢产物微生物微生物主体主体现代化的技术手现代化的技术手段段技术支撑技术支撑产物的提取产物的提取与精制与精制菌种选育菌种选育发酵条件的发酵条件的工艺控制工艺控制细胞细胞甾体生物转化甾体生物转化葡萄糖异构酶葡萄糖异构酶青霉素青霉素氨基酸氨基酸乙醇乙醇柠檬酸柠檬酸定义：是指利用生物的生命活动产生的酶，对无定义：是指利用生物的生命活动产生的酶，对无机或有机原料进行加工，获得产品的工业。机或有机原料进行加工，获得产品的工业。发酵工业发酵工业传统发酵（酿造）工业：成分复杂，较高风味要求的发酵传统发酵（酿造）工业：成分复杂，较高风味要求的发酵食品的工业。食品的工业。近代发酵工业
4、：需要纯种接种发酵，精制产品的发酵工业。近代发酵工业：需要纯种接种发酵，精制产品的发酵工业。食品发酵食品发酵：微生物在食品工业中应用的一个领域。：微生物在食品工业中应用的一个领域。二、发酵的一般工艺过程 原料原料预处理预处理配料配料灭菌灭菌冷却冷却菌种菌种菌种活化菌种活化种子扩培种子扩培种子罐种子罐发酵罐发酵罐空气空气空压机空压机贮气罐贮气罐油水分离油水分离过滤器过滤器发酵液发酵液提取精制提取精制产品产品副产物副产物原料原料空气空气原料原料补料补料酸碱酸碱消泡消泡菌种筛选菌种筛选摇瓶试验摇瓶试验发酵罐试验发酵罐试验发酵的一般工艺过程 发酵工艺要点n发酵原料及其预处理原料特点：糖质或淀粉质等含量
5、较高，价格相对低廉，易得。粉碎、酶解菌种的活化及扩大培养种子扩培技术种子扩培技术u概念：是指将保存于沙土管、冷冻干燥管中处于概念：是指将保存于沙土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级放大培养而获得一定过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯培养物称为种子。数量和质量的纯种过程。这些纯培养物称为种子。u种子扩培流程种子扩培流程图 种子扩大培养流程图1-沙土孢子；2-冻干菌种；3-斜面种子；4-摇瓶液体种子；5-茄子瓶斜面种子；6-固体培养基种子；7、8-种子罐培养物；9-发酵
6、罐u 种子质量的控制种子质量的控制 影响种子质量的因素：培养基、培养条件、种龄、接种量等种子质量的控制措施：菌种稳定性的检查；无杂菌检查 例：生产啤酒酵母菌种子扩培流程例：生产啤酒酵母菌种子扩培流程保藏菌种菌种活化10mL麦芽汁250mL麦芽汁5-10L麦芽汁100L麦芽汁25 2天天25 2-3天天25 2天天15-20 3-5天天菌种菌种u直投式发酵剂直投式发酵剂是指一系列高度浓缩和标准化的冷冻干燥发酵剂是指一系列高度浓缩和标准化的冷冻干燥发酵剂菌种，直接加入到灭菌的原料中进行发酵，无需菌种，直接加入到灭菌的原料中进行发酵，无需对其活化、扩培等其它预处理工作。对其活化、扩培等其它预处理工作
7、。活菌数：活菌数：101010-1210-12CFU/gCFU/g；优势：优势：省去菌种车间，减少人员、简化工艺省去菌种车间，减少人员、简化工艺,污染小污染小价格：价格：200-300200-300元元/吨产品（酸奶）吨产品（酸奶）发酵培养基的配制与灭菌Q:一般培养基里面应该含有什么成分呢？u培养基、培养设备、空气等的灭菌处理发酵过程控制发酵氧温度补料pH发酵产物纯化及副产物的处理发酵产物的提取（细胞、代谢产物）副产物的利用和处理（饲料、工业原料）第第2 2节节 菌种选育及扩培技术菌种选育及扩培技术 一、生产菌种的要求和来源 二、菌种选育的方法 一、生产菌种的要求和来源一、生产菌种的要求和来源
8、 1、生产菌种的要求：、生产菌种的要求：在较短的发酵过程中在较短的发酵过程中高产有价值的发酵产品高产有价值的发酵产品。发酵培养基应价廉，来源充足发酵培养基应价廉，来源充足，被转化为产品的效率，被转化为产品的效率高。如农副产品。高。如农副产品。菌种对人、动物、植物和环境菌种对人、动物、植物和环境不应该造成危害，还应不应该造成危害，还应注意潜在的、慢性的、长期的危害注意潜在的、慢性的、长期的危害。发酵后，所产发酵后，所产不需要的代谢产物少不需要的代谢产物少，而且产品相对，而且产品相对容容易分离易分离，下游技术能用于规模化生产。，下游技术能用于规模化生产。遗传特性稳定遗传特性稳定，抗逆能力强，抗逆能
9、力强，而且易于进行基因操作。而且易于进行基因操作。2.2.生产菌种的来源生产菌种的来源 自然环境自然环境 购置生产菌种购置生产菌种 中国微生物菌种保藏管理委员会（中国微生物菌种保藏管理委员会（CCCCMCCCCM）美国典型菌种保藏中心（美国典型菌种保藏中心（ATCCATCC）英国国家典型菌种保藏所（英国国家典型菌种保藏所（NCTCNCTC）人工育种人工育种太空育种太空育种紫外照射紫外照射杂交杂交原生质体融合原生质体融合二、菌株选育的方法n自然选育n诱变育种(物理诱变剂、化学诱变剂、生物诱变剂)n杂交育种n原生质体融合n基因工程基因工程育种：基因工程育种：目的基因目的基因载体（噬菌体、质粒）载体
10、（噬菌体、质粒）重组载体重组载体引入细胞引入细胞基因表达基因表达重组体的筛选及鉴定重组体的筛选及鉴定微生物的自然选育微生物的自然选育例：葡萄中酿酒酵母的分离、筛选与鉴定微生物的自然选育微生物的自然选育例：葡萄中酿酒酵母的分离、筛选与鉴定微生物的自然选育微生物的自然选育例：葡萄中酿酒酵母的分离、筛选与鉴定微生物的自然选育微生物的自然选育例：葡萄中酿酒酵母的分离、筛选与鉴定不同糖类的发酵不同糖类的发酵生长能力生长能力抗逆性能抗逆性能原料中的适应性原料中的适应性生产能力生产能力微生物的自然选育微生物的自然选育例：葡萄中酿酒酵母的分离、筛选与鉴定第第3 3节节 发酵类型发酵类型 单一单一混合混合工工业
11、业发发酵酵方方式式需氧否需氧否培养基培养基位置位置间歇或连续间歇或连续菌种固定与否菌种固定与否菌种单一或混合菌种单一或混合好氧好氧厌氧厌氧液态液态固态固态深层深层表面表面分批分批连续连续游离游离固定化固定化半固态半固态补料分批补料分批一、固态发酵与液态发酵一、固态发酵与液态发酵 固态发酵固态发酵:是指微生物在没有或几乎没有游离水的是指微生物在没有或几乎没有游离水的固态的湿培养基上的发酵过程。固态的湿培养基上的发酵过程。u厌氧菌：厌氧菌：窖池堆积，压紧密封窖池堆积，压紧密封u好氧菌：好氧菌：容器表面静置发酵，通气和容器表面静置发酵，通气和/或翻动。浅盘培养或翻动。浅盘培养法、转桶法、厚层通气法。
12、法、转桶法、厚层通气法。一、固态发酵与液态发酵一、固态发酵与液态发酵 液态发酵：液态发酵：指培养基呈液态的微生物发酵过程。指培养基呈液态的微生物发酵过程。液态发酵：发酵罐。液态发酵：发酵罐。因素：温度、因素：温度、pHpH、通风、搅拌、罐压力等，必须控制。、通风、搅拌、罐压力等，必须控制。固态发酵固态发酵与液态发酵相比的优、缺点与液态发酵相比的优、缺点优优 点点缺缺 点点1.1.培养基培养基含水量少含水量少，废水、废，废水、废渣少，环境污染少，容易处理渣少，环境污染少，容易处理1.1.菌种限于耐低水活性菌种限于耐低水活性(aw)(aw)的的微生物，微生物，菌种选择性少菌种选择性少2.2.能源消
13、耗量低能源消耗量低,供能设备简易供能设备简易2.2.发酵速度慢，周期较长发酵速度慢，周期较长3.3.培养基原料培养基原料多为天然基质或多为天然基质或废渣，废渣，广泛易得，价格低廉广泛易得，价格低廉3.3.天然天然原料成分复杂原料成分复杂，有时变，有时变化，影响发酵产物的质和量化，影响发酵产物的质和量4.4.设备和技术较简易，设备和技术较简易，较低的较低的投资投资4.4.工艺参数难以测准和控制工艺参数难以测准和控制5.5.产物浓度较高产物浓度较高,后处理较方便后处理较方便5.5.产品少产品少,工艺操作消耗工艺操作消耗劳力多，劳力多，强度大强度大二、分批发酵、连续发酵、补料分批发酵二、分批发酵、连
14、续发酵、补料分批发酵分批发酵的概念分批发酵的概念封闭系统培养，指一次性投料、接种直到发酵结束，产封闭系统培养，指一次性投料、接种直到发酵结束，产品一次性收获。在发酵过程中，除了不断通气（如好氧品一次性收获。在发酵过程中，除了不断通气（如好氧发酵），调节发酵），调节pH外，与外界没有其它物料交换的一种外，与外界没有其它物料交换的一种发酵方式。发酵方式。特点：特点：u典型的非稳态过程。典型的非稳态过程。u微生物生长微生物生长延滞期、对数生长期、稳定期和衰亡期。延滞期、对数生长期、稳定期和衰亡期。u操作简单、周期短，染菌机会少，原料利用率高，但生操作简单、周期短，染菌机会少，原料利用率高，但生产效率
15、低。产效率低。连续发酵的概念连续发酵的概念在开放系统中进行的。连续不断的向发酵罐中流加新鲜发酵在开放系统中进行的。连续不断的向发酵罐中流加新鲜发酵液，同时又连续不断的排出等量的发酵液，从而使液，同时又连续不断的排出等量的发酵液，从而使pH、养分、养分、溶解氧保持恒定，使微生物生长和代谢活动保持旺盛稳定状溶解氧保持恒定，使微生物生长和代谢活动保持旺盛稳定状态的一种发酵方式。态的一种发酵方式。特点：恒态。特点：恒态。优点：提高生产效率；质量稳定；自动控制。优点：提高生产效率；质量稳定；自动控制。缺点：营养物质利用率较低；菌种易变异；易染菌；缺点：营养物质利用率较低；菌种易变异；易染菌；罐式连续发酵
16、实现方法罐式连续发酵实现方法n恒浊法：通过调节营养物的流加速度，利用浊度计检恒浊法：通过调节营养物的流加速度，利用浊度计检测细胞浓度，使之恒定。测细胞浓度，使之恒定。n恒化法：保持某一限制性基质在一恒定浓度水平，使恒化法：保持某一限制性基质在一恒定浓度水平，使菌的比生长速率保持一定。菌的比生长速率保持一定。连续发酵的优缺点（与分批发酵比较）连续发酵的优缺点（与分批发酵比较）优优 点点缺缺 点点1.1.维持稳定的操作条件，有利于维持稳定的操作条件，有利于微生物的生长，产率和产品质量微生物的生长，产率和产品质量稳定稳定1.1.由于是开放系统，加上发酵由于是开放系统，加上发酵周期长，容易造成杂菌污染
17、周期长，容易造成杂菌污染2.2.机械化和自动化强度高，减少机械化和自动化强度高，减少操作人员与有毒有害物质接触操作人员与有毒有害物质接触2.2.在长周期连续发酵中，微生在长周期连续发酵中，微生物容易发生变异物容易发生变异3.3.设备利用率高，节省劳动力设备利用率高，节省劳动力3.3.对设备、仪器及控制元器件对设备、仪器及控制元器件的技术要求较高的技术要求较高4.4.由于灭菌次数减少，使测量仪由于灭菌次数减少，使测量仪器探头的寿命得以延长器探头的寿命得以延长4.4.黏性丝状菌菌体容易附着在黏性丝状菌菌体容易附着在器壁上生长和在发酵液内结团，器壁上生长和在发酵液内结团，给连续发酵操作带来困难给连续
18、发酵操作带来困难5.5.容易对过程进行优化，有效地容易对过程进行优化，有效地提高发酵产率提高发酵产率补料分批发酵补料分批发酵概念：概念：是指在开始时投入一定量的基础培养基，是指在开始时投入一定量的基础培养基，到发酵过程中的适当时期，开始连续补加碳到发酵过程中的适当时期，开始连续补加碳-能源能源或（和）氮源或（和）其它必需基质，直至发酵或（和）氮源或（和）其它必需基质，直至发酵液体积达到发酵罐最大操作容积后，将发酵液一液体积达到发酵罐最大操作容积后，将发酵液一次全部放出。次全部放出。单细胞蛋白、氨基酸、抗生素、维生素、酶制剂、有机酸单细胞蛋白、氨基酸、抗生素、维生素、酶制剂、有机酸 发酵工业应用
19、n与分批培养方式比较与分批培养方式比较1、可以解除底物抑制；、可以解除底物抑制；2、对于好氧发酵，可以、对于好氧发酵，可以避免避免在分批培养过程中因一在分批培养过程中因一次性次性投糖过多造成的细胞大量生长、耗氧过多以投糖过多造成的细胞大量生长、耗氧过多以至通风搅拌设备不能匹配的状况至通风搅拌设备不能匹配的状况；3、微生物细胞可以被控制在一系列连续的过渡态阶、微生物细胞可以被控制在一系列连续的过渡态阶段，可用于控制细胞的质量。段，可用于控制细胞的质量。n与连续培养方式比较与连续培养方式比较1、无菌要求低、无菌要求低2、菌种变异和退化少、菌种变异和退化少3、使用范围更广。、使用范围更广。补料分批发
20、酵优点补料分批发酵优点图图10-3 好氧菌大型发酵罐示意图好氧菌大型发酵罐示意图好氧菌大型发酵罐示意图好氧菌大型发酵罐示意图 单罐连续发酵示意图单罐连续发酵示意图 多罐连续发酵示意图多罐连续发酵示意图三、固定化酶和固定化细胞发酵三、固定化酶和固定化细胞发酵 固定化酶或细胞：固定化酶或细胞：固定于水不溶载体固定于水不溶载体可可重复和连续使用；重复和连续使用；游离酶或细胞：游离酶或细胞：未固定未固定固定化发酵：固定化发酵：固定化酶(细胞)用于发酵可称为固定化酶(细胞)发酵，或简称固定化发酵。三、固定化酶和固定化细胞发酵三、固定化酶和固定化细胞发酵 固定化类型：固定化类型：定义：定义：主要是按照正、
21、负电荷相吸的原理，酶或细胞吸附在载体的表面而被固定。物理吸附法物理吸附法：主要利用瓷碎片、玻璃球、尼龙网、棉花、木屑、毛发等作载体。离子吸附法：离子吸附法：则主要利用DEAE-纤维素、DEAE-葡萄糖凝胶等作为载体。三、固定化酶和固定化细胞发酵三、固定化酶和固定化细胞发酵 固定化类型：固定化类型：l包埋法：包埋法：是将酶（细胞）包在凝胶微小格子内，或是将酶（细胞）包裹在半透性聚合物膜内的固定化方法。凝胶包埋法：凝胶包埋法：所用的聚合物主要为合成高分子物质和天然大分子物质，如琼脂、明胶。微胶囊法：微胶囊法：则是一种用半透性的高聚物薄膜包裹酶（细胞）的技术，常为球状体，直径由几微米到几百微米。三、
22、固定化酶和固定化细胞发酵三、固定化酶和固定化细胞发酵 固定化类型：固定化类型：定义：酶或细胞与载体通过共价键作用而被固定。酶或细胞溶液与含羧酸载体(R-COOH)或氨基载体(R-NH2)，在缩合剂碳化二亚胺作用下，经搅拌等处理，而制成固定化酶或细胞。三、固定化酶和固定化细胞发酵三、固定化酶和固定化细胞发酵 固定化类型：固定化类型：交联法的基本原则是酶分子与多功能试剂之间形成共价键得到三向的交联网架结构。常用的交联试剂有戊二醛、联苯胺-2,2-双磺酸。三、固定化酶和固定化细胞发酵三、固定化酶和固定化细胞发酵 固定化酶和固定化细胞发酵的优点：固定化酶和固定化细胞发酵的优点：重复使用重复使用利于产品
23、的分离和提纯利于产品的分离和提纯易于机械化操作易于机械化操作缩短生产周期缩短生产周期使用时间较长等。使用时间较长等。活性炭海藻酸钠聚乙烯醇混合混合溶解溶解菌体灭菌灭菌氯化钙-硼酸溶液注射器缓慢滴入固定化小球-4低温固定12 h四、混合培养物发酵四、混合培养物发酵 n混合培养物发酵产品:混合培养物发酵的优点混合培养物发酵的优点n可以充分利用培养基、设备、人员和时间，可以在共同的发酵容器中经过同一工艺过程，提高或获得二种或多种产品；n可以获得一些独特的产品。n混合的多种菌种，增加了发酵中许多基因的功能。通过不同代谢能力的组合，完成单个菌种难以完成的复杂代谢作用，可以代替某些基因重组工程菌株，进行复
24、杂的多种代谢反应，或促进生长代谢，提高生产效率。u主要的控制参数1、pH值（酸碱度）2、温度3、溶解氧浓度4、泡沫5、补料第第4 4节节 发酵工艺过程控制发酵工艺过程控制(液态发酵液态发酵)一、温度的影响及其控制一、温度的影响及其控制 （一）温度对微生物生长的影响（一）温度对微生物生长的影响（二）温度对发酵的影响（二）温度对发酵的影响（三）影响发酵温度变化的因素（三）影响发酵温度变化的因素（四）最适温度的控制（四）最适温度的控制(一一)温度对微生物生长的影响温度对微生物生长的影响影响酶的活性、影响细胞内各种反应速度影响酶的活性、影响细胞内各种反应速度最低、最高、最适生长温度最低、最高、最适生长
25、温度在最适范围内生长速度随温度升高而增加，在最适范围内生长速度随温度升高而增加，生长周期缩短生长周期缩短不同生长阶段的微生物对温度的反应不同不同生长阶段的微生物对温度的反应不同l延滞期延滞期：细菌对温度的影响十分敏感，温度的较大变化会使延滞期变长。l对数生长期：对数生长期：最适生长温度的范围内，对温度变化不敏感，因此在最适温度范围内提高对数生长期的培养温度，既有利于菌体的生长，又避免热作用的破坏。l生长后期：生长后期：生长速度主要取决于氧的含量，温度影响较小，因此在培养的后期最好提高一些通气量。（二）温度对发酵的影响（二）温度对发酵的影响u反应速度反应速度u酶系的组成及酶的特性酶系的组成及酶的
26、特性u发酵的方向发酵的方向 如金色链霉菌如金色链霉菌35，合成四环素；，合成四环素；30，合成金霉素；，合成金霉素；u基质溶解度基质溶解度 在发酵液中的物质溶解度也影响菌对某些基质的分解吸收。在发酵液中的物质溶解度也影响菌对某些基质的分解吸收。因此对发酵过程中的温度要严格控制。因此对发酵过程中的温度要严格控制。u凝结芽孢杆菌的凝结芽孢杆菌的-淀粉酶热稳定性淀粉酶热稳定性受培养温度的影响是极为明显的：受培养温度的影响是极为明显的：l55培养所产生的酶在90保持60min，其剩留活性为8899；l在35培养所产生的酶，经相同条件处理，剩余活性仅有610。（三）（三）影响发酵温度变化的因素影响发酵温
27、度变化的因素u发酵过程中，随着微生物细胞对培养基中的营养发酵过程中，随着微生物细胞对培养基中的营养物质的利用、机械搅拌的作用，将会产生一定的热物质的利用、机械搅拌的作用，将会产生一定的热量；同时由于发酵罐壁的散热、水分的蒸发等将会量；同时由于发酵罐壁的散热、水分的蒸发等将会带走部分热量。带走部分热量。u发酵过程中释放出来的引起温度变化的净热量称发酵过程中释放出来的引起温度变化的净热量称为发酵热。为发酵热。Q发酵发酵=Q生物生物+Q搅拌搅拌-Q蒸发蒸发 Q辐射辐射生物热（生物热（Q生物生物）微生物细胞在生长繁殖过程中本微生物细胞在生长繁殖过程中本 身产生的大量热成为生物热。身产生的大量热成为生物
28、热。问题问题1 1生物热来源于培养基中的什么物质？生物热来源于培养基中的什么物质？微生物产生的生物热有何作用？微生物产生的生物热有何作用？问题问题2 2在发酵的哪一阶段，微生物产生的生物热最大？在发酵的哪一阶段，微生物产生的生物热最大？问题问题3 3生物热n生物热主要是培养基中的碳水化合物、脂肪和蛋白质被微生物分解成、水以及其他物质时释放出来的。n释放出来的能量部分用来合成高能化合物，供微生物合成和代谢活动的需要，部分用来合成产物，其余部分则以热的形式散发出来。n生物热大量产生于菌体的对数生长期，这一阶段所产生的大量热成为发酵过程热平衡的主要因素。l在好氧发酵中，搅拌带动发酵液作机械运动，在好
29、氧发酵中，搅拌带动发酵液作机械运动，造成液体之间、液体和设备之间的摩擦，产造成液体之间、液体和设备之间的摩擦，产生数量可观的热。生数量可观的热。搅拌热（搅拌热（Q搅拌搅拌）Q搅拌=P3601（kJ/h）式中：Q搅拌搅拌热（kJ/h）P搅拌功率（kW）；3601机械能转变为热能的热功当量kJ(kW.h)。l空气进入发酵罐后，就和发酵液广泛接空气进入发酵罐后，就和发酵液广泛接触进行热交换，必然会引起水分的蒸发，触进行热交换，必然会引起水分的蒸发，被空气和蒸发水分带走的热量。被空气和蒸发水分带走的热量。蒸发热（蒸发热（Q蒸发蒸发）辐射热（辐射热（Q辐射辐射）辐射热是指因发酵罐温度与环境温度辐射热是指
30、因发酵罐温度与环境温度不同，而使发酵液通过罐体向外辐射的热不同，而使发酵液通过罐体向外辐射的热量量。辐射热的大小取决于发酵罐内外的温辐射热的大小取决于发酵罐内外的温度差的大小，受环境温度变化的影响。度差的大小，受环境温度变化的影响。1 1）菌种特性）菌种特性2 2）培养基）培养基 （成分及配比）（成分及配比）3 3）发酵阶段）发酵阶段4 4）搅拌类型及搅拌速度）搅拌类型及搅拌速度5 5）通气速度）通气速度 （影响（影响Q Q蒸发蒸发）6 6）罐内外的温差）罐内外的温差 影响发酵温度的因素影响发酵温度的因素 由于Q生物、Q蒸发在发酵过程中随时间而变化，因此发酵热在整个发酵过程中也随时间变化。为了
31、使发酵在一定温度下进行，必须采取措施加以控制。(四四)最适温度的选择和控制最适温度的选择和控制根据菌种及生长阶段来选择根据菌种及生长阶段来选择 微生物种类不同，所具有的酶系及其性质不微生物种类不同，所具有的酶系及其性质不同，所要求的温度范围也不同。同，所要求的温度范围也不同。如：黑曲霉生长温度为如：黑曲霉生长温度为3737；青霉菌生长温度为；青霉菌生长温度为3030。谷氨酸产生菌棒状杆菌的生长温度为谷氨酸产生菌棒状杆菌的生长温度为30303232，合成温度为合成温度为34-37 ；根据培养条件选择根据培养条件选择 温度选择还根据培养条件综合考虑，灵活选择。温度选择还根据培养条件综合考虑，灵活选
32、择。通气条件差通气条件差时可适当时可适当降低温度降低温度，使菌呼吸速率，使菌呼吸速率降低些，溶氧浓度也可髙些。降低些，溶氧浓度也可髙些。培养基稀薄时，温度也该低些培养基稀薄时，温度也该低些。因为温度高营。因为温度高营养利用快，会使菌过早自溶。养利用快，会使菌过早自溶。根据菌生长情况根据菌生长情况 菌生长快菌生长快，维持在较高温度时间要短些；，维持在较高温度时间要短些；菌生长慢菌生长慢，维持较高温度时间可长些。，维持较高温度时间可长些。培养条件适宜培养条件适宜，如营养丰富，通气能满足，如营养丰富，通气能满足，那么前期温度可髙些，以利于菌的生长。那么前期温度可髙些，以利于菌的生长。总的来说，温度的
33、选择根据菌种生长阶段及总的来说，温度的选择根据菌种生长阶段及培养条件综合考虑。要通过反复实践来确定最适培养条件综合考虑。要通过反复实践来确定最适温度。温度。控制方法n最适生长温度往往与最适生产温度不一致。一般把满足生物合成的最适温度放在首位。n温度传感器+控制器 升温：发酵热升温：发酵热 夹层夹层热水热水/蒸汽蒸汽 降温：夹层降温：夹层冷却水冷却水/冷盐水冷盐水 二、二、pHpH值的影响及其控制值的影响及其控制 （一）（一）pHpH值对菌生长和代谢产物形成的影响值对菌生长和代谢产物形成的影响 菌种不同，对菌种不同，对pH要求不同要求不同微生物微生物最适最适PH细菌细菌6.5-7.5放线菌放线菌
34、6.5-8.0酵母菌酵母菌3.8-6.0霉菌霉菌4.0-5.8lpHpH值对菌生长和代谢产物形成的影响值对菌生长和代谢产物形成的影响 菌种相同，菌种相同，pHpH不同，形成的产物不同不同，形成的产物不同微生物微生物pH发酵产物发酵产物黑曲霉2-3柠檬酸近中性草酸酵母菌4.5-5.0乙醇8.0乙醇、乙酸、甘油pHpH对微生物生长和代谢产物形成影响的对微生物生长和代谢产物形成影响的主要原因主要原因：n影响了微生物细胞原生质膜所带电荷，改变细胞膜的通透性。n影响微生物体内酶的活性。n影响培养基中营养物质和中间代谢产物的离解，从而影响微生物对这些物质的利用。n造成微生物代谢过程的改变，从而使代谢产物的
35、质量和比例发生改变。n微生物代谢产物的影响；n培养基组成对pH值的影响：C/N高，特别是葡萄糖过量，往往导致有机酸大量积累，使pH值下降。如果C/N低，则过多的氮源容易导致氨基氮的形成，使pH值上升。n菌体自溶对pH值的影响。(二二)、影响、影响pH值变化的因素值变化的因素1 1、调整培养基的组分、调整培养基的组分2 2、在发酵过程中进行控制、在发酵过程中进行控制 添加CaCO3 氨水流加法 尿素流加法 3 3、加、加酸酸/碱碱调调pH pH 4 4、通过补料调、通过补料调pHpH(三三)、发酵过程、发酵过程pH值的调节及控制值的调节及控制u补料调节的优点补料调节的优点:1.调节培养液的调节培
36、养液的pH值值2.补充基质养分，增加培补充基质养分，增加培养基的浓度养基的浓度3.减少产物的反馈抑制减少产物的反馈抑制谷氨酸发酵中酸度的调节谷氨酸发酵中酸度的调节尿素尿素产氨产氨糖糖pH氨被菌利用氨被菌利用酸酸pH谷氨酸形成谷氨酸形成不断流加尿素和调节不断流加尿素和调节pH首先首先三、溶氧的影响及其控制三、溶氧的影响及其控制 （一）（一）溶解氧对发酵过程的影响溶解氧对发酵过程的影响1、不同微生物对氧需求不同、不同微生物对氧需求不同 好氧微生物好氧微生物厌氧微生物厌氧微生物兼性厌氧微生物兼性厌氧微生物耐氧微生物耐氧微生物工业发酵菌种多数为好氧菌工业发酵菌种多数为好氧菌2.2.溶氧对发酵过程的影响
37、溶氧对发酵过程的影响氧气在水中的溶解度：约氧气在水中的溶解度：约0.25mmol/L0.25mmol/L；在发酵液中的溶解度：在发酵液中的溶解度：0.22mmol/L0.22mmol/L；发酵液中大量的微生物生长其耗氧量发酵液中大量的微生物生长其耗氧量2525-100mmol/(100mmol/(L L.h h)。当溶氧不足时，代谢作用会受到阻碍，当溶氧不足时，代谢作用会受到阻碍，但是如果溶氧量过大，又会影响菌体次级但是如果溶氧量过大，又会影响菌体次级代谢产物的合成。在供氧不足的情况下通代谢产物的合成。在供氧不足的情况下通常需要强制供氧。常需要强制供氧。（二）发酵过程的溶氧变化（二）发酵过程的
38、溶氧变化谷氨酸发酵时正常和异常的溶氧曲线谷氨酸发酵时正常和异常的溶氧曲线正常发酵正常发酵溶氧曲线溶氧曲线异常发酵异常发酵溶氧曲线溶氧曲线l前期：菌体生长，溶氧出前期：菌体生长，溶氧出现低峰；现低峰；l产物合成期：溶氧水平相产物合成期：溶氧水平相对较低；对较低；l后期：菌体衰老，溶氧逐后期：菌体衰老，溶氧逐步上升。步上升。溶氧异常下降的原因溶氧异常下降的原因：污染好气性杂菌；污染好气性杂菌；代谢异常；代谢异常；设备或工艺变化设备或工艺变化溶氧异常升高的原因：溶氧异常升高的原因：呼吸受到抑制呼吸受到抑制溶氧明显上升；溶氧明显上升；污染烈性噬菌体；污染烈性噬菌体；菌体破裂会完全失去呼吸能力菌体破裂会
39、完全失去呼吸能力溶氧直线上升。溶氧直线上升。1 1、供氧方面、供氧方面1 1）增加空气中氧的含量，使氧分压增加，进行富氧通气）增加空气中氧的含量，使氧分压增加，进行富氧通气 富氧空气制备：深冷分离法深冷分离法 （可得（可得99.9%)99.9%)吸附分离法吸附分离法 （吸去（吸去N N2 2和和COCO2 2)膜分离法膜分离法 （有机物高分子膜；（有机物高分子膜；30%30%）成本高，易爆炸成本高，易爆炸 ；但关键时期使用也是明智的；但关键时期使用也是明智的2 2）提高罐压）提高罐压 但同时会增加但同时会增加COCO2 2的溶解度（比氧气高的溶解度（比氧气高3030倍），倍），影响影响pHpH
40、、可能会影响菌的代谢。、可能会影响菌的代谢。一般一般0.30.31kg/cm1kg/cm2 23 3）改变通气速率）改变通气速率4 4）增加搅拌速度）增加搅拌速度（三）溶氧浓度的控制（三）溶氧浓度的控制 2 2、需氧方面、需氧方面1 1）调整基质浓度）调整基质浓度 溶质浓度溶质浓度越大，溶氧越大，溶氧浓度越小，氧的传递速率随菌浓度的对数浓度越小，氧的传递速率随菌浓度的对数增加而减少。增加而减少。2 2）调节温度）调节温度 温度越高，溶氧浓度越低。温度越高，溶氧浓度越低。（一）、泡沫的形成及其对发酵的影响（一）、泡沫的形成及其对发酵的影响1 1、泡沫产生、泡沫产生u外界引进的气流被机械地分散形成
41、（搅拌）；u发酵过程微生物代谢产生的气体凝结生成。四、四、泡沫的影响及其控制泡沫的影响及其控制 发酵液面的泡沫发酵液中的泡沫2.2.泡沫带来的危害泡沫带来的危害n在装填量较大的情况下，泡沫过多会引起发酵液外溢，从而容易造成污染和浪费。n泡沫过多，必须减少发酵罐的装填量，从而降低了设备利用率。n当泡沫不易消除时，影响菌体代谢产生的气体的排出，从而影响菌体的生长和代谢，甚至引发死亡。（二）发酵过程泡沫变化（二）发酵过程泡沫变化 1 1、通气和搅拌的影响、通气和搅拌的影响 通气量越大，搅拌越剧烈，产生的泡沫越多。2 2、培养基组成的影响、培养基组成的影响 培养基中蛋白胨、玉米浆、黄豆粉等蛋白质具有较
42、高的表面张力，容易形成泡沫，随着含量增加，泡沫越多。虽然糖类起泡能力很差，但高浓度糖液增加了培养基的粘度，增加了泡沫的稳定性。3 3、灭菌的影响、灭菌的影响 培养基灭菌时间越长，培养基的泡沫寿命越长。（二）发酵过程泡沫变化（二）发酵过程泡沫变化 4.发酵过程的不同阶段对泡沫变化的影响：u一般发酵初期，培养基浓度大，粘度高，营养丰富，在高的表面粘度和低的表面张力作用下，泡沫较稳定；u发酵旺盛时期，泡沫形成最多；u随着发酵进行，蛋白质等物质被不断降解，培养基表面粘度逐渐下降，表面张力不断上升，泡沫寿命逐渐缩短；u在发酵后期菌体自溶导致发酵液中可溶性蛋白质增加，又利于泡沫的产生。（三）泡沫的控制及消
43、除（三）泡沫的控制及消除n控制措施：控制措施：减小通气量减小通气量 降低搅拌速度降低搅拌速度 降低蛋白质含量降低蛋白质含量 较高的物料的比例等较高的物料的比例等n泡沫的消除方法泡沫的消除方法 物理物理/化学化学u物理消泡概念：改变温度和压力，以及通过机械外力打碎泡沫等方法使泡沫减少。机械消泡的特点：优点：在于不需要加入其他物质，从而减少了染菌机会和对下游工艺的影响。缺点：是消泡效果不理想，不能从根本上消除引起泡沫稳定的原因，因此仅作为辅助方法使用。l装在发酵罐的搅拌轴上，安装时桨上的齿面装在发酵罐的搅拌轴上，安装时桨上的齿面略高于液面，靠轴的旋转带动来打碎泡沫，起略高于液面，靠轴的旋转带动来打
44、碎泡沫，起到消泡的作用到消泡的作用耙式消泡桨化学消泡n优点：n作用机理n消泡剂具备的条件n常用的消泡剂l消泡效果好消泡效果好l作用迅速可靠作用迅速可靠l用量少用量少l不需要改造现有设备不需要改造现有设备l不仅适用于大规模发酵生产，也适用于小规模发酵试验。不仅适用于大规模发酵生产，也适用于小规模发酵试验。破坏膜弹性降低泡沫局部表面张力。促使液膜排液使表面活性剂增溶，降低有效浓度电解质瓦解表面活性剂双电层而导致气泡破灭一定的亲水性；高效性，用量少；持久性；无毒；无副作用。l天然油脂:如豆油、玉米油l聚醚类消泡剂：GP型消泡剂亲水性差，抑泡能力比消泡能力优越，适宜在基础培养基中加入，以抑制整个发酵过
45、程的泡沫产生。GPE型消泡剂即泡敌，亲水性较好，消泡活性维持时间短，因此用在粘稠发酵液中效果较好。GPES型消泡剂表面活性强，消泡效率高。l高碳醇：在水体系里是有效的消泡剂。C7-C9的醇是最有效的消泡剂。五、补料的控制五、补料的控制 l概念：补料发酵就是指在分批发酵过程中,间歇或连续地补加含有限制性营养成分的新鲜培养基。l补料的内容：补充碳源和能源 补充氮源 加入某些微生物生长或合成需要的微量元素或无机盐 对于产酶的微生物，在补料中适当加入该酶的作用底物，是提高酶产量的重要措施。补料对发酵的影响补料对发酵的影响n有利于菌体的高密度培养。过高浓度的营养物势必造成菌体代谢的紊乱，表现为迟滞期延长
46、，比生长速率降低，得率下降。n解除高浓度营养物引起的阻遏作用。n维持有利的发酵条件。调整酸度、改善好氧菌的有氧发酵条件补料的控制补料的控制n无反馈控制的补料 所加入营养物的流量是预先设定的n反馈控制补料 根据反应器内的营养物浓度、产物浓度以及细胞浓度等参数进行实时或在线检测，根据检测数据进行补料的方式。第五节第五节 发酵产物提取与精制发酵产物提取与精制 菌体 乳酸菌 酵母菌酶 凝乳酶 蛋白酶代谢产物 有机酸 氨基酸发酵产物l产物特点：产物特点：成分复杂；成分复杂；产品浓度低；产品浓度低；收率低；收率低；失活问题；失活问题；不稳定性。不稳定性。发酵产物及其特点发酵液发酵液预处理预处理细胞细胞胞外
47、产物胞外产物胞内产物胞内产物干燥干燥细胞破碎细胞破碎离心或过滤离心或过滤提取提取精制精制成品加工成品加工细胞产品细胞产品副产物副产物发酵产品后处理过程流程图发酵产品后处理过程流程图加热、凝集、絮凝、调加热、凝集、絮凝、调pHpH目标产品目标产品机械法、珠磨破碎、超声波破碎、机械法、珠磨破碎、超声波破碎、有机溶剂、生物酶法有机溶剂、生物酶法沉淀、吸附、萃取、蒸馏沉淀、吸附、萃取、蒸馏层析、离子交换、色谱分离、层析、离子交换、色谱分离、膜分离、电泳膜分离、电泳浓缩、结晶、无菌过滤、冻干、浓缩、结晶、无菌过滤、冻干、喷雾干燥喷雾干燥离心或过滤离心或过滤离心或过滤离心或过滤胞内酶分离纯化过程胞内酶分离
48、纯化过程发酵液发酵液细胞分离、破碎细胞分离、破碎胞内粗酶胞内粗酶硫酸铵盐析硫酸铵盐析葡聚糖凝胶层析葡聚糖凝胶层析离子交换层析离子交换层析电泳电泳表表 枯草芽孢杆菌弹性蛋白酶纯化步骤及其结果枯草芽孢杆菌弹性蛋白酶纯化步骤及其结果第六节 污染防止与挽救发酵产品的污染来源可能会有哪些呢？（一）（一）工业发酵染菌的危害n染菌对不同产品发酵过程的影响染菌对不同产品发酵过程的影响柠檬酸和乳酸等有机酸的发酵：发酵前期啤酒发酵：发酵后期核苷和核苷酸的发酵：整个发酵期（一）（一）工业发酵染菌的危害n不同污染时期对发酵的影响不同污染时期对发酵的影响种子培养期染菌：灭菌后弃去发酵前期染菌：通过调节酸度，缩短培养周期
49、等补救；重新灭菌，补充营养成分，重新接种发酵发酵中期染菌：可提前放罐或通过降温，较少补料的方法给予挽救发酵后期染菌：柠檬酸发酵后期染菌影响不大，肌苷、肌苷酸和谷氨酸、赖氨酸等发酵后期染菌会影响产物的品质。啤酒染菌会对风味形成影响。n感染不同种类和性质的杂菌对发酵的影响感染不同种类和性质的杂菌对发酵的影响（一）（一）工业发酵染菌的危害u柠檬酸发酵柠檬酸发酵最怕污染皱褶青霉菌；最怕污染皱褶青霉菌；u肌苷、肌苷酸发酵肌苷、肌苷酸发酵最怕污染芽孢杆菌；最怕污染芽孢杆菌；u谷氨酸、酶制剂发酵谷氨酸、酶制剂发酵最怕污染噬菌体，容易造成最怕污染噬菌体，容易造成连续污染。连续污染。u酒类生产过程酒类生产过程中
50、最怕污染野生酵母、醋酸菌、乳中最怕污染野生酵母、醋酸菌、乳酸菌等。酸菌等。（一）（一）工业发酵染菌的危害n染菌程度对发酵的影响染菌程度对发酵的影响染菌的程度越严重对发酵影响越大。当染菌程度较小时，在种子发酵培养前期影响较大。n染菌对产物提取和产品质量的影响染菌对产物提取和产品质量的影响丝状菌被污染：菌丝自溶，发酵液发粘、过滤时间长，降低产物收率等问题。染菌后，发酵液中会产生其他的不期望的代谢产物，对产物的纯度、提取等都会产生影响。（二）、染菌的检查、原因分析和防治措施n染菌的检查 固形物较多的发酵液检查较困难；而且当杂菌含量少时不易得出正确结论。培养时间长；相似菌无法区别；无菌操作。l现象观察
