1、 流式细胞仪分析技术及流式细胞仪分析技术及应用应用1精品流式细胞术流式细胞术(flow cytometry,FCM)是以流式细胞仪为检测手段的是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。和分选的新技术。流式细胞术流式细胞术2精品 流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化
2、分选。信号对细胞进行定量分析或纯化分选。特点：检测速度快、检测通量高、单细胞多参数的检测特点：检测速度快、检测通量高、单细胞多参数的检测流式细胞术的特点流式细胞术的特点3精品 流式细胞仪流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质（如大小、内部结构、的对细胞的物理或化学性质（如大小、内部结构、DNADNA、RNARNA、蛋白质、抗原等）进行快速测量并可分、蛋白质、抗原等）进行快速测量并可分类收集的高技术。类收集的高技术。流式流式细胞仪流式细胞仪仪流式
3、细胞仪流式细胞仪流式细胞仪4精品样本来源：样本来源：各种细胞（如外周血，骨髓，实体组织、悬浮或贴壁培养的细胞），微生物，人工合成微球等。检测大小：检测大小：一般是0.5um40um流式细胞仪可以做什么？流式细胞仪可以做什么？5精品液流系统液流系统光学系统光学系统数据处理系统数据处理系统 分析型流式细胞分析型流式细胞仪仪分选系统分选系统分选型流式细胞仪分选型流式细胞仪流式细胞仪的组成流式细胞仪的组成6精品（1）液流 液流系统液流系统流动室流动室流动室（流动室（Flow cellFlow cell）是液流系统的核心部件，流动室是由石英玻璃制成，单细胞悬液在流动室里被鞘液流包绕通过流动室内一定孔径的
4、孔，检测区在该孔的中心，细胞在此与激光垂直相交。7精品层流水力聚焦技术层流水力聚焦技术8精品光学系统光学系统Light scattering at Light scattering at FSCFSC represents the particle size and represents the particle size and areaareaLight scattering at SSC Light scattering at SSC depends on granularity and depends on granularity and complexity of the parti
5、clecomplexity of the particle9精品 激光光源：气冷式氩离子激光器激光光源：气冷式氩离子激光器 分色反光镜：反射长分色反光镜：反射长/短波长，通过短短波长，通过短/长波长长波长 光束成形器：两十字交叉放置的透镜光束成形器：两十字交叉放置的透镜 透镜组：形成平行光，除去室内光透镜组：形成平行光，除去室内光 滤片：长通、短通、带通滤片：长通、短通、带通 光电倍增管：光电倍增管：FS,SSFS,SS（散射光），（散射光），FL1,FL2,FL3,FL4FL1,FL2,FL3,FL4（荧光）（荧光）光学系统光学系统10精品FlowFlowTipTipLaserLaserSS
6、 and FLSS and FLDetectorDetectorFS DetectorFS Detector光学系统示意图光学系统示意图11精品主要由计算机及其软件组成主要由计算机及其软件组成（3）数据处理系统12精品基本工作原理基本工作原理13精品单细胞液柱已标记的单细胞悬液和鞘液硅化管流动室喷嘴荧光检测系统和散射光感受系统收集光信号荧光染料被激发发光光电倍增管脉冲信号计算机系统分析结果放大垂直相交形成稳态水平激光与之基本过程基本过程14精品 细胞在液柱中与激光束相交时细胞在液柱中与激光束相交时向周围向周围360立体角方向散射的光线立体角方向散射的光线信号，它的强弱与细胞的大小、形信号，它的
7、强弱与细胞的大小、形状、胞内颗粒折射等有关，主要分状、胞内颗粒折射等有关，主要分为为前向散射光前向散射光和侧向散射光侧向散射光。二、散射光的测定二、散射光的测定15精品16精品前向散射光前向散射光（forward scatter,forward scatter,FSFS）：激光束照射细胞时，光激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度以相对轴较小角度(0.5(0.51010)向前方散射的讯号用于检测细向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。17精品FALS SensorLaser前向散射光示意图前向散射光示意图18精
8、品侧向散射光（side scatter,SS）：激光束照射细胞时，光以90角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。19精品FALS Sensor90LS SensorLaser侧向散射光侧向散射光示意图示意图20精品 测得的测得的FSFS与与SSSS信信号通过计算机处理，号通过计算机处理，可得到可得到FS-SSFS-SS图，由此图，由此可仅用散射光信号对可仅用散射光信号对未染色的活细胞进行未染色的活细胞进行分析或分选。分析或分选。此为血细胞分类此为血细胞分类的基本原理，但不能的基本原理，但不能分析表面分子。分析表面分子。淋巴细胞淋巴细胞单核细胞单核细胞中性粒细胞中性粒细胞光散射测量最有效用途：
9、光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群从非均一群体中鉴别出某些亚群 21精品荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光电倍增管。号区分开，送入不同的光电倍增管。选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多
10、个不同特征。个不同特征。线性放大器和对数放大器线性放大器和对数放大器三、荧光测量三、荧光测量22精品荧光染料的特性荧光染料的特性激发波长激发波长(EXCITING)(EXCITING)发射波长发射波长(EMISSION)(EMISSION)23精品24精品荧光补偿荧光补偿25精品 通过流式细胞仪进行细胞分选通过流式细胞仪进行细胞分选主要是在对具有某种特征的细胞需主要是在对具有某种特征的细胞需进一步培养和研究时进行的。进一步培养和研究时进行的。四、细胞分选原理四、细胞分选原理26精品细胞悬液形成液流柱细胞悬液形成液流柱流动室振动流动室振动液流断裂成液滴液流断裂成液滴空白液滴空白液滴含细胞的液滴含
11、细胞的液滴弃去弃去偏转落入收集器偏转落入收集器压电晶体压电晶体产生产生机械振动机械振动不充电不充电充电充电（一）分选基本原理（一）分选基本原理27精品 分选速度：分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬液中单位时间内分选的细胞数量。与悬液中细胞的含量成正比。细胞的含量成正比。分选纯度：分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞的百分选出的目的细胞占所有收获细胞的百分率。分率。分选收获率：分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过测量点实际收获的分选细胞与设定通过测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。分选得率：分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的从一群
12、体细胞悬液中分辨出目的细胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。与总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。与分选速度成反比。分选速度成反比。（二）分选的技术要求（二）分选的技术要求28精品 参数：参数：FS,SS,FLFS,SS,FL 数据显示方式数据显示方式 （单参数直方图（单参数直方图 、双参数散点图、双参数散点图 、二维、二维等高图等高图 、假三维等高图、假三维等高图 、三参数散点图、三参数散点图 ）设门分析技术设门分析技术 第二节第二节 数据的显示与分析数据的显示与分析29精品FSFS：反映颗粒的大小：反映颗粒的大小SSSS：反映颗粒的内部结构复杂程度：反映颗粒的内部结构复杂程度F
13、LFL：反映颗粒被染上的荧光数量多少：反映颗粒被染上的荧光数量多少一、一、参数参数30精品 单参数直方图单参数直方图 双参数直方图双参数直方图:点图点图 二维等高图二维等高图 假三维等高图假三维等高图 三参数直方图三参数直方图 多参数分析多参数分析直分析方图直分析方图设门分析设门分析:REGION和和GATE设置设置二、数据显示方式二、数据显示方式31精品 由一维参数由一维参数(散射光或荧光散射光或荧光)与颗粒计数与颗粒计数(COUNT)构成，反映同构成，反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。（一）单参数直方图（一）单参数直方图32精品单参数直方图单参数
14、直方图细胞相对数量细胞相对数量信道信道(channel(channel)33精品 双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数，双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数，根据这两个参数就可以确定细胞在图上的表达位置。根据这两个参数就可以确定细胞在图上的表达位置。双参数信号双参数信号通常采用对数信号，最常用的是点密图，在图中，每通常采用对数信号，最常用的是点密图，在图中，每个点代表一个细胞，点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强个点代表一个细胞，点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。度的颗粒数量的多少。（二）双参数直方图（二）双参数直方图34精品1
15、.双参数直方图点图双参数直方图点图绿色荧光强度绿色荧光强度红色荧光强度红色荧光强度35精品双参数直方图点图双参数直方图点图36精品2.二维等高图二维等高图 由类似地图上的等高线组成，其本质也是双参数直方图。由类似地图上的等高线组成，其本质也是双参数直方图。等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数，即等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数，即“等等高高”。曲线层次越高曲线层次越高(越里面的线越里面的线)所代表的细胞数愈多。所代表的细胞数愈多。等高线越密集则表示细胞数变化率越大。等高线越密集则表示细胞数变化率越大。37精品二维等高图二维等高图38精品3.假三维等高图假三维等高
16、图39精品（三）三参数直方图（三）三参数直方图40精品 多参数分析：当细胞标记了多色荧光，被激发光激发后，得到的荧多参数分析：当细胞标记了多色荧光，被激发光激发后，得到的荧光信号和散射光信号可根据需要进行组合分析。光信号和散射光信号可根据需要进行组合分析。（四）流式细胞仪的多参数分析（四）流式细胞仪的多参数分析41精品 Gate Gate设置：指在某一张选定参数的直方图上，根据该图的设置：指在某一张选定参数的直方图上，根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群，并要求该样细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群，并要求该样本所有其他参数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。本所有其他参数组
17、合的直方图只体现这群细胞的分布情况。根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任意形状门和十字门。形门、多边形门、任意形状门和十字门。三、设门分析技术三、设门分析技术42精品A A 淋巴细胞淋巴细胞B B 单核细胞单核细胞C C 中性粒细胞中性粒细胞A A、B B、C C均均为任意门为任意门43精品线性门线性门44精品Region设置设置:区阈（区阈（region,R）与门）与门(gate,G)是两个相关的概念，区阈可与是两个相关的概念，区阈可与门对应，但是也可以包含于门。门对应，但是也可以包含于门。45精品D1 CD4+/CD3-D2 CD4
18、+/CD3+D3 CD4-/CD3-D4 CD4-/CD3+如十字门分析时，起如十字门分析时，起就可以由四个区域构就可以由四个区域构成，即成，即G=D1+D2+D3+D4。46精品第四节第四节 流式细胞仪免疫分析的技术要求流式细胞仪免疫分析的技术要求 样本制备样本制备 标记染色标记染色 液相芯片技术液相芯片技术 质量控制质量控制 47精品外周血淋巴细胞样品的制备外周血淋巴细胞样品的制备分离单个核细胞分离单个核细胞培养细胞的样品制备培养细胞的样品制备 蛋白酶消化蛋白酶消化 机械吹打机械吹打 使贴壁细胞脱落使贴壁细胞脱落 洗涤洗涤 尼龙网过滤尼龙网过滤单细胞悬液单细胞悬液一、免疫检测样品制备一、免
19、疫检测样品制备48精品新鲜实体组织单细胞悬液的制备新鲜实体组织单细胞悬液的制备 机械法机械法 酶处理法酶处理法 化学试剂处理法化学试剂处理法 表面活性剂处理法表面活性剂处理法单细胞悬液的保存单细胞悬液的保存 深低温保存法（一年）深低温保存法（一年）乙醇或甲醇保存法（乙醇或甲醇保存法（2 2周）周）甲醛或多聚甲醛保存法（甲醛或多聚甲醛保存法（2 2月）月）49精品适用条件适用条件:有较高的量子产额和消光系数有较高的量子产额和消光系数 对对488nm488nm的激发光波长有较强的吸收的激发光波长有较强的吸收 发射光波长与激发光波长间有较大的波长差发射光波长与激发光波长间有较大的波长差 易与标记单抗
20、结合而不影响抗体的特异性易与标记单抗结合而不影响抗体的特异性二、常用的荧光染料与标记染色二、常用的荧光染料与标记染色50精品FITCFITCTexas redTexas redPE.PC.APCPE.PC.APCPEcy5PEcy5FL1FL2FL3FL4激光激光细细胞胞悬悬液液异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素得州红得州红能量传递复合染料能量传递复合染料藻胆蛋白类藻胆蛋白类（一）几种常见的荧光染料（一）几种常见的荧光染料51精品名称名称染料染料激发激发波长波长荧光颜荧光颜色色溶解性溶解性对对PHPH敏感敏感性性特点特点异硫氰酸荧异硫氰酸荧光素光素FITCFITC488488绿绿 525525易易敏
21、感敏感易溶于水，与抗体结易溶于水，与抗体结合不影响特异性合不影响特异性得州红得州红Texas Texas redred568568红红 615615不易不易不敏感不敏感稳定，偶联后量子产稳定，偶联后量子产额低额低藻红蛋白藻红蛋白PEPE488488橙橙575575易易不敏感不敏感具较多发光基团，消具较多发光基团，消光系数和量子产额高光系数和量子产额高藻青蛋白藻青蛋白PCPC488488别藻青蛋白别藻青蛋白APCAPC633633红红670670能量传递复能量传递复合染料合染料PEcy5PEcy5488488红红670670易易不敏感不敏感减少交叉，成本高减少交叉，成本高常用的几类荧光染料常用的
22、几类荧光染料52精品 用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一起，在用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一起，在488nm488nm激激发光照射下，通过一个荧光染料被激发后产生的发射波长再激发另发光照射下，通过一个荧光染料被激发后产生的发射波长再激发另一荧光染料产生荧光信号，从而检测到该特定荧光信号。一荧光染料产生荧光信号，从而检测到该特定荧光信号。能量传递复合染料能量传递复合染料53精品PECY5CY5CY5488nm575nm670nm红色荧光花青苷花青苷5 5藻红蛋白藻红蛋白能量传递复合染料机制能量传递复合染料机制54精品荧光染料与细胞成分的四种结合方式荧光染料与细胞成分的四种结合方式
23、结构亲和式结构亲和式嵌入结合嵌入结合共价键结合共价键结合荧光标记抗体特异性结合荧光标记抗体特异性结合免疫荧光标记方法免疫荧光标记方法直标直标:干扰少干扰少,但需购买多种单抗但需购买多种单抗间标间标:步骤多步骤多,干扰多干扰多,不需标记多种抗体不需标记多种抗体组合标记组合标记（二）免疫荧光标记（二）免疫荧光标记55精品免疫胶乳颗粒的应用即液相芯片技术免疫胶乳颗粒的应用即液相芯片技术是把微小的是把微小的乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色，把针对乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色，把针对不同检测物的乳胶微球混合后再加入待标本，在不同检测物的乳胶微球混合后再加入待标本，在悬液中与微粒进行特异性地结合，
24、经激光照射后悬液中与微粒进行特异性地结合，经激光照射后不同待测特产生不同颜色，并可进行定量分析。不同待测特产生不同颜色，并可进行定量分析。因检测速度极快，所以又有因检测速度极快，所以又有“液相芯片液相芯片”之称之称 。三、免疫胶乳颗粒技术的应用三、免疫胶乳颗粒技术的应用56精品微小的乳胶微球分别染成上百微小的乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色（固相芯片是种不同的荧光色（固相芯片是用探针在芯片上的坐标位置给用探针在芯片上的坐标位置给基因的特异性编码；而液相芯基因的特异性编码；而液相芯片则是用颜色来编码）片则是用颜色来编码）57精品58精品通过对标记不同荧光素分子的检测，实通过对标记不同荧光素分子
25、的检测，实现现FCMFCM对可溶性物质的定量分析对可溶性物质的定量分析59精品四、流式细胞免疫学技术的质量控制四、流式细胞免疫学技术的质量控制 适当的制备方式适当的制备方式 处理红细胞处理红细胞 实体组织来源标本用机械法实体组织来源标本用机械法 温度温度25253737，pH7.0pH7.07.27.2（一）单细胞悬液制备的质控（一）单细胞悬液制备的质控60精品 温度温度 pHpH 染料浓度染料浓度 固定剂固定剂（二）免疫荧光染色的质控（二）免疫荧光染色的质控61精品 光路与流路校正光路与流路校正:确保激光光路与样品流处于正交状态，减少确保激光光路与样品流处于正交状态，减少变异（变异（CVCV
26、）。）。PMTPMT（光电倍增管）校准（光电倍增管）校准:保证样品检测时仪器处于最佳灵敏保证样品检测时仪器处于最佳灵敏度工作状态。度工作状态。绝对计数校准绝对计数校准:保证计数的准确性。保证计数的准确性。（三）仪器操作的质控（三）仪器操作的质控62精品 同型对照：即免疫荧光标记中的阴性对照，选用相同源性的同型对照：即免疫荧光标记中的阴性对照，选用相同源性的未标记单未标记单抗抗作为对照调整和设置电压，以保证特异性。作为对照调整和设置电压，以保证特异性。全程质量控制：与待测标本一起标记和检测，结果达靶值，提示本次全程质量控制：与待测标本一起标记和检测，结果达靶值，提示本次实验结果可靠。实验结果可靠
27、。（四）免疫检测的质控（四）免疫检测的质控63精品第四节第四节 在免疫学检验中的应用在免疫学检验中的应用 流式细胞术目前已广泛地被应用于免疫学流式细胞术目前已广泛地被应用于免疫学基础研究和逐步进入临床应用各方面，用流式基础研究和逐步进入临床应用各方面，用流式细胞仪对细胞表面的抗原成分进行标记分析，细胞仪对细胞表面的抗原成分进行标记分析，可区别多种细胞的特性，为细胞免疫的研究增可区别多种细胞的特性，为细胞免疫的研究增加了有效的手段和帮助。加了有效的手段和帮助。64精品T T淋巴细胞及其亚群分析淋巴细胞及其亚群分析Th(CD3+CD4+CD8-T);Tc(CD3+CD4-CD8+T)B淋巴细胞及其
28、亚群分析淋巴细胞及其亚群分析B1(CD19+CD5+):产生产生IgM型自身抗体型自身抗体,参与免疫调节、与自身参与免疫调节、与自身免疫病的发生有关免疫病的发生有关B2(CD19+CD5-):受外来抗原刺激受外来抗原刺激,产生高亲和性特异性抗体产生高亲和性特异性抗体NK细胞分析细胞分析NK(CD3-CD16+CD56+)一、淋巴细胞及其亚群的分析一、淋巴细胞及其亚群的分析65精品二、淋巴细胞功能分析二、淋巴细胞功能分析 细胞介导细胞毒性试验细胞介导细胞毒性试验(死细胞与活细胞比例死细胞与活细胞比例)细胞内细胞因子测定细胞内细胞因子测定三、淋巴造血系统及白血病免疫分型三、淋巴造血系统及白血病免疫
29、分型对淋巴瘤和白血病进行多色免疫分型对淋巴瘤和白血病进行多色免疫分型用于选择化疗方案、判断预后及检出微小用于选择化疗方案、判断预后及检出微小残留病变残留病变66精品CD4+Th细胞、细胞、CD4+/CD8+比例比例MDR(+)表示对化疗药物耐药表示对化疗药物耐药四、肿瘤耐药基因分析四、肿瘤耐药基因分析五、五、AIDS病检测中的应用病检测中的应用67精品HLA-B27可出现在可出现在58%97%的强直的强直性脊椎炎性脊椎炎(As)患者患者六、自身免疫病相关六、自身免疫病相关HLA抗原分析抗原分析68精品七、移植免疫中的应用七、移植免疫中的应用 FCM作为一个强大的技术平台，已应用于多作为一个强大
30、的技术平台，已应用于多个领域，其在移植免疫分析中的应用也越来越个领域，其在移植免疫分析中的应用也越来越广泛。目前移植免疫中的广泛。目前移植免疫中的FCM应用主要包括流应用主要包括流式细胞术的交叉配型（式细胞术的交叉配型（Flow cytometry cross-matching,FCXM）和群体反应性抗体（）和群体反应性抗体（Panel reactive antibody,PRA）检测。）检测。69精品思考题1.流式细胞仪的分析检测原理是什么？2.流式细胞仪分析中前向散射光、侧向散射光和荧光的检测意义。3.何谓荧光补偿？何谓“液相芯片”技术？4.细胞分选的基本原理。5.FCM分析中有哪些数据显
31、示方式，如何解读结果及其设门分析的意义？6.如何进行FCM分析检测样品的制备？7.流式细胞分析前如何验证仪器工作状态，采用何种校正物？8.流式细胞免疫分析的质量控制包括哪些方面？9.流式细胞术有哪些临床应用价值？10.流式细胞仪分析中常见的荧光素有那些？他们的特性如何？70精品小 结流式细胞术（流式细胞术（FCM）是在保持细胞及细胞器或微粒的结构）是在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，从分子水平上获取多种信号实现及功能不被破坏的状态下，从分子水平上获取多种信号实现对单个细胞进行定量分析或纯化分选。对单个细胞进行定量分析或纯化分选。FCM分析中前向散射光反映颗粒的大小；侧向散射
32、光反映分析中前向散射光反映颗粒的大小；侧向散射光反映颗粒内部结构复杂程度、表面的光滑程度；荧光反映颗粒被颗粒内部结构复杂程度、表面的光滑程度；荧光反映颗粒被染上荧光部分数量的多少，根据其标记的抗原分子不同，即染上荧光部分数量的多少，根据其标记的抗原分子不同，即反映了不同抗原分子的表达情况。反映了不同抗原分子的表达情况。同型对照为免疫荧光标记中的阴性对照，可使荧光标记单同型对照为免疫荧光标记中的阴性对照，可使荧光标记单抗的信号保持其特异性。抗的信号保持其特异性。对各项工作环节和仪器性能进行严格的质量控制和规范化对各项工作环节和仪器性能进行严格的质量控制和规范化操作，是保证操作，是保证FCM分析中各项检测数据和指标可靠性的关键。分析中各项检测数据和指标可靠性的关键。71精品72精品
