1、L/O/G/O基因打靶的里程碑事件基因打靶的里程碑事件ZFN、TALEN、CRISPR-CaS姓名：邢亚迪专业：作物遗传育种导师：何光华 教授 任何对基因进行特异性修饰的工具都是由两个部分组成：1 DNA特异性识别结合域 2 核酸内切酶活性区域ZFN =DNA识别域识别域+核酸内切酶核酸内切酶TALEN=DNA识别域识别域+核酸内切酶核酸内切酶CAS9 =DNA识别域识别域+核酸内切酶核酸内切酶ZFN原理原理ZFN=DNA识别域识别域+核核酸内切酶酸内切酶DNA识别域：识别域：由一系列由一系列 Cys2-His2锌锌指蛋白（指蛋白（zinc-fingers）串）串联组成（一般联组成（一般34个
2、），个），每个锌指蛋白识别并结合每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基。一个特异的三联体碱基。核酸内切酶：核酸内切酶：非特异性核酸内切酶非特异性核酸内切酶FokI，形成二聚体时切割，形成二聚体时切割双链双链DNA。TALEN=DNA识别域识别域+核酸内切酶核酸内切酶DNA识别域：识别域：由一系列由一系列TAL蛋白串联组成（一般蛋白串联组成（一般20个左右），每个个左右），每个TAL蛋白识别并结合一个对应的碱基。蛋白识别并结合一个对应的碱基。核酸内切酶：核酸内切酶：非特异性核酸内切酶非特异性核酸内切酶FokI，形成二聚体时切割双链，形成二聚体时切割双链DNATALENTALEN的定义及原理的
3、定义及原理 TALE（Transcription activator-like effectors）:一种源于植物致病菌的靶向基因操作技术。一种源于植物致病菌的靶向基因操作技术。科学家发现，来自植物细菌科学家发现，来自植物细菌Xanthomonassp.的的TAL蛋白的核酸结蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系,一个模一个模块单元识别一个碱基，简单且特异性极好。块单元识别一个碱基，简单且特异性极好。通过组合各类模块，可对任意核苷酸序列进行靶向特异性敲除或内通过组合各类模块，可对任意核苷酸序列进行靶向特异性敲除或内源
4、基因的表达调控。源基因的表达调控。目前已在人、大鼠、小鼠、猪、羊、斑马鱼、拟南芥及酵母等多类物种中得到成功应用。目前已在人、大鼠、小鼠、猪、羊、斑马鱼、拟南芥及酵母等多类物种中得到成功应用。全长为全长为34aa的的Tal 蛋白的第蛋白的第12、13位氨基残基可以特异性识别核苷酸碱基位氨基残基可以特异性识别核苷酸碱基。NG可以识别THD可以识别CNI可以识别ANN可以识别G或A通过这种特异性识别，将多个Tal蛋白组装在一起，再加上Fok I核酸内切酶，就可以构成可以识别目的片段的Tale蛋白。TALENTALEN的特异性打靶的原理的特异性打靶的原理：一对一对可以特异性识别靶基因的可以特异性识别靶
5、基因的TALETALE，定位，定位到需要编辑的基因组到需要编辑的基因组区域；区域；然后然后非特异性核酸内切酶非特异性核酸内切酶Fok1Fok1切断双链切断双链DNADNA从而造成从而造成DNADNA双链断裂（双链断裂（double-double-strand breakstrand break，DSBDSB）；）；再通过再通过DNADNA的自我修复，引起碱基的缺失或突变，从而引起基因突变。的自我修复，引起碱基的缺失或突变，从而引起基因突变。Fok1Fok1只有在形成二聚体的时候才有内切酶活性。只有在形成二聚体的时候才有内切酶活性。TALENTALEN介导的基因敲除介导的基因敲除TALEN质粒对
6、共转入细胞后，表达两个融合蛋白，分别与靶位点特异质粒对共转入细胞后，表达两个融合蛋白，分别与靶位点特异结合，由于两个结合，由于两个TALEN融合蛋白中的融合蛋白中的FokI临近，形成二聚体，发挥非临近，形成二聚体，发挥非特异性内切酶活性，在两个靶位点之间剪切特异性内切酶活性，在两个靶位点之间剪切DNA。TALENTALEN介导的同源重组介导的同源重组 形成DSB时，同源重组可将需要敲入的序列组合如基因组。TALENTALEN的技术特点的技术特点 任意敲除任意敲除，无基因序列、细胞、物种限制，永久，无基因序列、细胞、物种限制，永久失活失活 成功率高成功率高，在保证转染效率的前提下，有效性可，在保
7、证转染效率的前提下，有效性可达达95%95%以上以上 打靶效率高打靶效率高,可完全替代可完全替代RNAiRNAi技术技术 脱靶率低脱靶率低，尚未发现明显脱靶效应，尚未发现明显脱靶效应 周期短周期短，只需按照常规构建质粒方法构建，只需按照常规构建质粒方法构建TalenTalen质粒质粒CRISPR-Cas系统系统 CRISPR序列：序列：细菌和古细菌中发现的很多成簇的、规律间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences）。Cas：CRISPR相关基因（CRISPR-associated g
8、enes）CRISPR-Cas系统是细菌的免疫系统：CRISPR序列能特异性识别外源核酸序列；Cas蛋白的非特异性核酸内切酶功能将外源核酸切断。两个质粒，一个表达Cas9蛋白，一个表达sgRNACRISPR-Cas9=DNA识别域识别域+核酸内切酶核酸内切酶 DNA识别域识别域：向导向导RNA 核酸核酸内切酶内切酶：Cas9核酸内切酶核酸内切酶引导引导RNA由两部分组成：由两部分组成：CRISPR RNA(crRNA)和反式作用CRISPR RNA（transacting CRISPR RNA,tracrRNA)crRNA一端与双链核苷酸互补结合，另一端与一端与双链核苷酸互补结合，另一端与tr
9、acrRNA互补结合，形成向导互补结合，形成向导RNA。PAM：NGG Cas9蛋白与向导RNA结合、组装的动作是这套位点特异性的基因组修饰过程里的限速步骤。PAM序列为靶序列后面必须为才能被向导识别。CRISPR-Cas系统靶向要求：系统靶向要求：PAM序列序列PAM序列只有个碱基：。序列只有个碱基：。靶序列后面必须为才能被向导识别。靶序列后面必须为才能被向导识别。在人类基因组中平均每个碱基就可以出现一个在人类基因组中平均每个碱基就可以出现一个最近有研究发现，crRNA和tracrRNA可以被“改装”成一个向导RNA（single-guide RNA,sgRNA）。这个sgRNA足以帮助Cas9内切酶对DNA进行定点切割。而且可以将sgRNA和Cas9装在同一个表达质粒中表达。这种RNA介导的Cas9酶切作用能够在多种类型的细胞和生物体内正常地行使功能，在完整基因组上的特定位点完成切割反应。CRISPR-Cas系统优势系统优势 ZNF成本高昂，效率低。Cas9的效率是TALEN的5倍。sgRNA全长不超过100bp，构建更容易
