1、细胞培养细胞培养cell culture1细胞培养技术细胞培养技术n从生物体内取出组织或细胞，从生物体内取出组织或细胞，在体外在体外(in in vitrovitro)模拟体内生理环境，在无菌、适当温度模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，对这些组织或细胞进行孵和一定营养条件下，对这些组织或细胞进行孵育培养育培养，使之保持一定的结构和功能，以便于，使之保持一定的结构和功能，以便于我们观察研究，这种方法就是细胞培养（我们观察研究，这种方法就是细胞培养（cell cell cultureculture）。有时细胞培养也称为组织培养）。有时细胞培养也称为组织培养（tissue cult
2、ure)tissue culture)。2细胞培养目的和用途细胞培养目的和用途n1 1、科学研究、科学研究（1）药物研究开发）药物研究开发，如新药筛选，疫苗、基因工程药物、细胞工程、药物研究与开发、单克隆抗体制备等（2）基础研究）基础研究，如药物作用机理、基因功能、疾病发生机理等研究 n2 2、生物制药、生物制药（1）疫苗生产）疫苗生产：如病毒性疫苗(肝炎病毒疫苗、艾滋病疫苗等)，多肽疫苗（肿瘤疫苗)等（2）基因工程药物生产）基因工程药物生产：如EPO等（3）抗体药物、基因治疗药物生产）抗体药物、基因治疗药物生产（4）细胞工程药物生产）细胞工程药物生产：生物细胞内的一些生物活性多肽，生物活性物
3、质等（5）利用细胞法体外测定生物活性物质的）利用细胞法体外测定生物活性物质的活性活性；并预测其在体内的药效和替代体内法检测其成品的生物活性3主要内容主要内容n基本概念基本概念n准备工作准备工作n培养用液培养用液n基本技术基本技术n污染及防治污染及防治n肿瘤细胞的培养肿瘤细胞的培养n参考资源参考资源4基本概念基本概念5n初初代培养代培养（primary culture）又称原代培养，即直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一又称原代培养，即直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养物，一般持续次的培养物，一般持续1-41-4周。周。一旦已进行传代培养（Subculture）的细胞，便不
4、再称为初代培养，而改称为细胞系。n传代培养（传代培养（subculture/passage）细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中,一般情况下可传代一般情况下可传代10-5010-50次。次。也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。n克隆（克隆（cloneclone）从一个细胞靠有丝分裂获得的一个细胞群体（从一个细胞靠有丝分裂获得的一个细胞群体（populationpopulation）n 从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细
5、胞株细胞株（strainstrain）n 再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，称为亚株亚株（SubstrainSubstrain）6ncell line:cell line:原代培养物经首次原代培养物经首次传代成功后即成为细胞系传代成功后即成为细胞系。n如果不断继续传代或传代数有限，可称为如果不断继续传代或传代数有限，可称为有限细胞系有限细胞系（finite cell line）n如果可以连续传代，则可称为如果可以连续传代，则可称为连续细胞系连续细胞系（continous cell line）或无限细胞系（或无限细胞系（Infinite Cell Line）n有恶性的无限细胞系
6、：有恶性的无限细胞系：“恶性转化细胞系恶性转化细胞系”n只具永生性而无恶性的细胞系：无限细胞系或转化细胞系只具永生性而无恶性的细胞系：无限细胞系或转化细胞系:NIH3T3、Rat-1细胞系细胞系7细胞株细胞株ncell strain:cell strain:由原代培养中，用选择或克隆，选出具由原代培养中，用选择或克隆，选出具有有特征标记的细胞，经传代形成细胞株特征标记的细胞，经传代形成细胞株。n如果不能继续传代或传代数有限，称为有限细胞株如果不能继续传代或传代数有限，称为有限细胞株（finite cell strain）n如果可以连续传代，称为连续细胞株（如果可以连续传代，称为连续细胞株（co
7、ntinuous cell strain）。）。8细胞周期细胞周期n指细胞一个世代所经历的时间指细胞一个世代所经历的时间n从一次细胞分裂结束到下一次分裂结束为一个从一次细胞分裂结束到下一次分裂结束为一个周期周期n反应细胞增殖速度反应细胞增殖速度9体外培养细胞的种类和命名体外培养细胞的种类和命名n肿瘤细胞系多由癌瘤建成，多呈类上皮型细胞，常已传几十代或百肿瘤细胞系多由癌瘤建成，多呈类上皮型细胞，常已传几十代或百代以上，并具有不死性和异体接种致瘤性。代以上，并具有不死性和异体接种致瘤性。n细胞的命名无严格统一规定，多采用有一定意义缩写字或代号表示细胞的命名无严格统一规定，多采用有一定意义缩写字或代
8、号表示n几种代表性的细胞名称：几种代表性的细胞名称：HeLaHeLa：供体患者的姓名（来源于宫颈癌）：供体患者的姓名（来源于宫颈癌）CHOCHO：中国地鼠卵巢细胞（：中国地鼠卵巢细胞（Chinese Hamster OvaryChinese Hamster Ovary）宫宫-743-743：宫颈癌上皮细胞，：宫颈癌上皮细胞，19741974年年3 3月建立月建立NIH3T3NIH3T3：美国国立卫生研究所（美国国立卫生研究所（N National ational I Institute of nstitute of HealthHealth）建立；）建立；每每3 3天传代，每次天传代，每次接种
9、接种3 310105 5细胞细胞mlml10建立细胞系（或株）的要求建立细胞系（或株）的要求n原代原代培养的细胞只要供体均一，取材部位取材部位及组织种类组织种类等条件稳定即可n传代的细胞传代的细胞，需做如下说明：1 1、组织来源：、组织来源：细胞供体所属物种，来自人体或者动物；个体性别、年龄；取材的器官或组织。如系肿瘤组织，应说明临床和病理诊断，以及病历号等。2 2、细胞生物学检测：、细胞生物学检测：了解细胞一般和特殊的生物学性状，如细胞一般形态，特异结构，细胞生长曲线和分裂指数，倍增时间，接种率等。如为肿瘤细胞，为说明来源于原肿瘤组织并保持恶性，须做软琼脂培养，异体接种致瘤和对正常组织侵润力
10、等实验。3 3、培养条件和方法：、培养条件和方法：应说明细胞系（或株）适应的生存环境，即指明使用的培养基、血清种类、用量以及适宜PH值。11国内外相关细胞库国内外相关细胞库 n国内细胞库国内细胞库武汉细胞库武汉细胞库http:/www.cctcc.org/fzlbc/cell.doc 上海细胞库上海细胞库http:/ 昆明细胞库昆明细胞库http:/ 成都基因治疗肿瘤药物工程技术研究中心细胞及载体服务成都基因治疗肿瘤药物工程技术研究中心细胞及载体服务http:/ 南京中医药大学新药及海洋药物研究中心药理毒理研究室细胞库目录南京中医药大学新药及海洋药物研究中心药理毒理研究室细胞库目录http:/
11、202.195.210.5/web/keyanziyuan/haiyangcell1.htm湖南远泰生物技术有限公司生物资源库湖南远泰生物技术有限公司生物资源库http:/ 上海午立生物技术有限公司细胞株上海午立生物技术有限公司细胞株http:/ 中国医学科学院基础医学研究所细胞中心保藏细胞目录中国医学科学院基础医学研究所细胞中心保藏细胞目录http:/ 上海华大天源生物科技有限公司提供高表达上海华大天源生物科技有限公司提供高表达GPCR细胞株和报告基因分细胞株和报告基因分析细胞系：析细胞系：http:/ n中国工业微生物菌种保藏中心中国工业微生物菌种保藏中心http:/www.china-c
12、icc.org/inl%20col/introduction.htm 台湾快兴科技股份有限公司台湾快兴科技股份有限公司 Cambrex 產品產品http:/.tw/Cambrex.htm 台湾国家卫生研究院台湾国家卫生研究院http:/www.nhri.org.tw/index/home2.htm n美国和欧洲细胞库美国和欧洲细胞库ATCC（细胞株及胚胎干细胞库）（细胞株及胚胎干细胞库）1）下载细胞库目录：）下载细胞库目录：http:/www.atcc.org/pdf/tcl.pdfn2）查询细胞株：）查询细胞株：http:/www.atcc.org/SearchCatalogs/CellBi
13、ology.cfmn3）胚胎干细胞库：）胚胎干细胞库：http:/stemcells.atcc.org/products/cells.cfm nCABRI(包括包括ECACC、DSMZ)http:/www.cabri.org/HyperCat/cells/all.htm CAMBREXhttp:/ 意大利意大利I.A.Z.http:/www.i-a-z-zellkultur.de/haupt_en/cell.html 欧洲细胞实验室列表（大全）欧洲细胞实验室列表（大全）http:/www.biotech.ist.unige.it/cldb/labs.html 意大利意大利IZSLER细胞库细胞
14、库http:/www.bs.izs.it/cataloghi/cellule/ABi病毒病毒http:/ 德国德国PromoCell原代细胞原代细胞http:/ 12细胞库细胞库nATCC:American Type Culture Collection(美国标准培养物收集所)nECACC:European Collection of Cell Cultures(欧洲动物细胞库)nJCRB:Japanese Collection of Research Bioresources(日本细胞库)nCCTCC:China Center for Type Culture Collection(中国典型
15、培养物保藏中心)13ATCCnWHOWHO的国际培养细胞文献中的国际培养细胞文献中心心nATCCATCC液氮冻存有液氮冻存有32003200个已经个已经过鉴定的细胞系过鉴定的细胞系n来自正常人和各种疾病患者的皮肤成纤维细胞系n来自不同物种的近75个杂交瘤细胞株ATCCATCC接纳入库细胞时，必须符合其接纳入库细胞时，必须符合其入库标准，检测项目如下：入库标准，检测项目如下：n培养简历培养简历n冻冻 存存 液液n细胞活力细胞活力n培培 养养 液液n细胞形态细胞形态n核核 型型n无污染检测无污染检测n物种检测物种检测n免疫检测免疫检测n细胞建立者细胞建立者14培养细胞的类型及其特点培养细胞的类型及
16、其特点n 培养细胞的生长方式培养细胞的生长方式n贴附生长：贴附生长：必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞。体瘤细胞。n悬浮生长：悬浮生长：于悬浮状态下生长，不需要贴附于支持物表面。于悬浮状态下生长，不需要贴附于支持物表面。包括一些取自血、脾或骨髓的培养细胞，尤其包括一些取自血、脾或骨髓的培养细胞，尤其是血液白细胞，以及一些肿瘤细胞是血液白细胞，以及一些肿瘤细胞，如白血病，如白血病细胞。细胞。151617 每代贴附生长细胞的生长过程每代贴附生长细胞的生长过程n游离期游离期n贴壁期贴壁期n潜伏期潜伏期n对数生长期对数生长期n停止期（平台期）停止期
17、（平台期）18n细胞接种后在培养液中呈悬浮状态细胞接种后在培养液中呈悬浮状态n此时细胞回缩，胞体呈圆球形此时细胞回缩，胞体呈圆球形n1010分钟分钟4 4小时小时游离期游离期（悬浮期）（悬浮期）19n细胞附着于细胞附着于底物底物上，游离期结束。上，游离期结束。n底物底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等等n血清中有促使细胞贴壁的糖蛋白（血清中有促使细胞贴壁的糖蛋白（生长基质生长基质），这），这些些促贴壁因子促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。有促贴壁因子的附着。贴壁期贴壁期202122n此时细胞有生长活动，而无细
18、胞分此时细胞有生长活动，而无细胞分裂裂n潜伏期：潜伏期：6 62424小时小时潜伏期潜伏期23n细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究最适合进行实验研究对数生长期对数生长期24n细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂n机制：接触抑制、密度依赖性机制：接触抑制、密度依赖性n相互接触后，如培养的是正常细胞，由于细胞的相互接触能抑相互接触后，如培养的是正常细胞，由于细胞的相互接触能抑制细胞的运动，这种现象称制细胞的运动，这种现象称接触抑制接触抑制（Contact InhibitionContact Inhibi
19、tion）。）。n当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，则发生多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制密度抑制（Density InhibitionDensity Inhibition），导致细胞分裂停止），导致细胞分裂停止 n肿瘤细胞的接触抑制及密度抑制往往减弱或消失，因此细胞可肿瘤细胞的接触抑制及密度抑制往往减弱或消失，因此细胞可向三维空间发展，导致细胞堆积，并可生长至较高的终末细胞向三维空间发展，导致细胞堆积，并可生长至较高的终末细胞密度。密度。可作为区别正常与癌细胞标
20、志之一。可作为区别正常与癌细胞标志之一。平台期平台期25261、无污染环境：、无污染环境：保证细胞生存的首要条件保证细胞生存的首要条件 2、恒定的温度：、恒定的温度：36.50.5 3、气体环境、气体环境：95%空气，5%二氧化碳混合气体混合气体4、细胞培养基、细胞培养基：基础物质、生存环境(pH7.2-7.4pH7.2-7.4、渗透压渗透压)培养细胞生存条件培养细胞生存条件27培养细胞的生存条件培养细胞的生存条件培养皿培养皿或培养瓶或培养瓶 温度、湿温度、湿度和气体度和气体由由CO2恒温孵恒温孵育箱提供育箱提供 生长生长培养液培养液1020血清血清 维持维持培养液培养液25血清血清 营养物质
21、营养物质糖、氨基酸、糖、氨基酸、维生素、无机维生素、无机离子、微量元离子、微量元素等素等 28实验准备实验准备n实验室实验室n设备器材设备器材n实验器材处理实验器材处理n细胞培养用液的配制细胞培养用液的配制29实验室设计实验室设计n准备室（准备室（包括配液室）包括配液室）n无菌室无菌室：缓冲间、操作间：缓冲间、操作间30设备器材设备器材n大型工具类大型工具类n超净工作台超净工作台nCOCO2 2培养箱培养箱n倒置显微镜倒置显微镜n液氮罐液氮罐n酶标仪、微孔板震荡器酶标仪、微孔板震荡器n消毒灭菌类消毒灭菌类n紫外灯、压力蒸汽消毒紫外灯、压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，器，电热干燥箱，滤器，酸缸
22、酸缸n配液用具配液用具n自动双重纯水蒸馏器，自动双重纯水蒸馏器，纯水仪纯水仪n制备细胞用品制备细胞用品n耗材：培养瓶，吸管，耗材：培养瓶，吸管，培养板，冻存管培养板，冻存管31准备室的设备：n蒸馏器蒸馏器n酸缸酸缸n烤箱烤箱n高压锅高压锅n储品柜（放未消毒物品）储品柜（放未消毒物品）n储品柜（放消毒过的物品）储品柜（放消毒过的物品）n包装台包装台n配液室的设备配液室的设备：n扭力天平和电子天平扭力天平和电子天平nPH计计n磁力搅拌器磁力搅拌器32培养室的设备：n液氮罐液氮罐n低温冰箱（低温冰箱（-80）nCO2孵箱（孵箱（孵育培养物）n二氧化碳缸瓶二氧化碳缸瓶n4冰箱（冰箱（放serum和培养
23、用液）n日光灯和紫外灯日光灯和紫外灯n储品柜（存放杂物）储品柜（存放杂物）n水浴锅水浴锅n边台（书写实验记录）边台（书写实验记录）n空气净化器系统空气净化器系统n三氧消毒杀菌机三氧消毒杀菌机n空调空调n必须放在无菌间的必须放在无菌间的设备：设备：n离心机离心机n超净工作台超净工作台n倒置显微镜倒置显微镜33n压力蒸汽消毒器：压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广n电热干燥箱：电热干燥箱：用干玻璃器皿消毒（160，2h）n滤器：滤器：过滤法除菌：大多数培养用液(人工合成培养基、血清、酶液等)n超净工作台：超净工作台：为细胞操作提供无菌环境n紫外灯：紫外灯：用于培养室空气、操作台、塑料培养皿和培养板等表
24、面消毒 34超净工作台超净工作台n工作原理工作原理 利用鼓风机驱动利用鼓风机驱动空气遁过空气遁过高效滤器高效滤器除除去空气中的尘埃颗粒，去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化使空气得到净化。净。净化空气徐徐通过工作化空气徐徐通过工作台面，台面，使工作台内构使工作台内构成无菌环境成无菌环境。35滤滤 器器36COCO2 2培养箱培养箱n设定条件为设定条件为3737，5 5COCO2 2 n使用时应注意使用时应注意：用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气松，以保证通气保持培养箱内空气干净。定期消毒保持培养箱内空气干净。定期消毒箱内箱内灭菌蒸馏水灭菌蒸馏水3L3L
25、蒸馏水槽中以保持蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避免培养液蒸发箱内湿度，避免培养液蒸发37数码型倒置荧光显微镜数码型倒置荧光显微镜 CFM-550Z 38自动双重纯水蒸馏器自动双重纯水蒸馏器 纯水仪纯水仪39 酶标仪酶标仪 微孔板震荡器微孔板震荡器40培培 养养 板板41培养瓶培养瓶42器械的清洗和消毒器械的清洗和消毒 43实验器材处理实验器材处理n刷洗刷洗包装包装消毒灭菌消毒灭菌消毒消毒和灭菌和灭菌 干烤干烤160，120分钟分钟 过滤除菌过滤除菌微孔薄膜过滤微孔薄膜过滤 高压高压蒸汽灭菌蒸汽灭菌湿热灭菌湿热灭菌 紫外线紫外线消毒消毒电磁辐射电磁辐射 蒸汽消毒蒸汽消毒乳酸、甲醛熏蒸乳酸、甲醛熏蒸
26、化学化学消毒剂消毒剂0.1新洁而灭新洁而灭 44玻璃器械洗消玻璃器械洗消n浸泡、刷洗、浸酸、和清洗浸泡、刷洗、浸酸、和清洗一、一、旧的旧的玻璃器皿的洗消玻璃器皿的洗消1、刷洗、烘干刷洗、烘干2、泡酸、清洗泡酸、清洗3、烘干、包装烘干、包装4、高压消毒高压消毒5、烘干备用烘干备用45玻璃器械洗消玻璃器械洗消n二、二、新的新的玻璃器皿的洗消玻璃器皿的洗消1、自来水刷洗自来水刷洗2、烘干、烘干、泡盐酸泡盐酸3、刷洗、烘干刷洗、烘干4、泡酸、清洗泡酸、清洗5、烘干、包装烘干、包装6、高压消毒高压消毒7、烘干备用烘干备用46金属器械洗消金属器械洗消n不能泡酸不能泡酸n洗涤剂刷洗洗涤剂刷洗n自来水冲净自来
27、水冲净n75酒精擦拭酒精擦拭n自来水、蒸馏水自来水、蒸馏水冲洗冲洗n晾干晾干n高压高压n烘干备用烘干备用47橡胶和塑料制品洗消橡胶和塑料制品洗消洗涤剂洗刷洗涤剂洗刷 用自来水和蒸馏水冲净用自来水和蒸馏水冲净 烤箱烘干烤箱烘干n新的橡胶制品新的橡胶制品洗涤方法：洗涤方法：0.5mol/L NaOH煮沸30分钟，流水冲洗，0.5mol/L HCl煮沸15分钟，流水冲洗，自来水煮沸2次，蒸馏水煮沸20分钟，50烤干备用。n塑料制品特点：质软、易出现划痕；耐腐蚀能力强、但不耐热。塑料制品特点：质软、易出现划痕；耐腐蚀能力强、但不耐热。n 1、针式滤器帽针式滤器帽不能泡酸液不能泡酸液,用2氢氧化钠泡6-
28、12小时,或者煮沸20分钟,在包装之前要装好滤膜两张，安装滤膜时注意光面朝上(凹向上)，然后将螺旋稍微拧松一些，放入铝盒中在高压锅内15磅30分钟消毒，再烘干备用。2、胶塞胶塞烘干后用2氢氧化钠溶液煮沸30分钟（用过的胶塞只要用沸水处理30分钟），自来水洗净，烘干。然后再泡入稀盐酸液30分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。3、胶帽胶帽，离心管帽离心管帽烘干后只能在2氢氧化钠溶液中浸泡6-12小时（切记时间不能过长），自来水洗净，烘干。然后再泡入稀盐酸液30分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用4、胶头胶头可用75酒
29、精浸泡5分钟，然后紫外照射后使用即可。5、其他其他消毒方法：可用70酒精浸泡消毒。塑料培养皿打开盖子，放在超净台台面上，直接暴露在紫外线下消毒。48注意事项：注意事项：1、严格执行高压锅的操作规程：、严格执行高压锅的操作规程：n水水：防高压时烧干，水不能过多因为其将使空气流畅受阻，会降：防高压时烧干，水不能过多因为其将使空气流畅受阻，会降低高压消毒效果低高压消毒效果n检查检查安全阀安全阀是否通畅，以是否通畅，以防防高压时高压时爆炸爆炸2、安装滤膜时注意光面朝上：、安装滤膜时注意光面朝上：否则起不到过滤的作用否则起不到过滤的作用3、注意人体的防护和器皿的完全浸泡：、注意人体的防护和器皿的完全浸泡
30、：A.泡酸时要戴泡酸时要戴耐酸手套耐酸手套，防止酸液溅起伤害人体，防止酸液溅起伤害人体B.从酸缸内捞取器皿时防止酸液溅到地面，会腐蚀地面从酸缸内捞取器皿时防止酸液溅到地面，会腐蚀地面C.器皿浸入酸液中要完全，不能留有气泡，以防止泡酸不彻底器皿浸入酸液中要完全，不能留有气泡，以防止泡酸不彻底49甲醛薰蒸：n40甲醛溶液，甲醛溶液，15-30 mlm3，室温，室温2124，相对湿度，相对湿度7585n每个房间是7个平方，约20个立方。要甲醛300-600ml，高锰酸钾100-200g n高锰酸钾放入甲醛液体中后，在开始的3秒钟内没有反映，3秒钟以后，会产生大量烟气。所以一旦在甲醛中加了高锰酸钾请马
31、上离开灭菌室，并关上门。n高锰酸钾放入甲醛液体中会使液体沸腾，所以反应要在比较大的大口径容器进行。n甲醛气体毒性非常强，所以操作时一定要带上防毒面具。50细胞培养用液细胞培养用液51细胞培养用液细胞培养用液n水水：新鲜配置的三蒸水或去离子水新鲜配置的三蒸水或去离子水n平衡盐溶液平衡盐溶液：无无CaCa2+2+、MgMg2+2+的缓冲液的缓冲液n消化液消化液：胰蛋白酶胰蛋白酶npHpH调整液调整液n抗生素抗生素n培养液培养液52平衡盐溶液（平衡盐溶液（BSS）535455n作用作用-使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散n不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样不同
32、的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样n胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH为为8.0、温度为、温度为37时，胰酶溶液的作用能力最强时，胰酶溶液的作用能力最强n使用胰酶时使用胰酶时，应把，应把握好浓度、温度和时间握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细，以免消化过度造成细胞损伤。因胞损伤。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性，所以和血清、蛋白质克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选配制胰酶溶液时应选用不含用不含Ca2+、Mg2+的的BSS，如：，如：D-Hanks液液n终止消化时终止消化时，可用含有血清培养液
33、或者胰酶抑制剂终止胰酶对细，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用（胞的作用（血清中含有抗蛋白酶成分）血清中含有抗蛋白酶成分）消化液：胰蛋白酶消化液：胰蛋白酶56pH调整液n1 1、NaHCONaHCO3 3溶液溶液n2 2、HEPESHEPES液液 是一种弱酸是一种弱酸羟乙基哌嗪乙硫磺酸。羟乙基哌嗪乙硫磺酸。HEPESHEPES对细胞无毒性，可防止对细胞无毒性，可防止pHpH值迅速变值迅速变动动57培养基培养基（1）合成培养基）合成培养基：是根据细胞所需物质的种类和数量严格：是根据细胞所需物质的种类和数量严格配制而成的。配制而成的。n内含碳水化合物、氨基酸、脂类、无机盐、维生素
34、、微量无素和细胞内含碳水化合物、氨基酸、脂类、无机盐、维生素、微量无素和细胞生长因子等生长因子等n单独使用细胞虽有生存但不能很好的生长增殖单独使用细胞虽有生存但不能很好的生长增殖（2）天然培养基）天然培养基：使用最普遍的天然培养基是血清，基本：使用最普遍的天然培养基是血清，基本以小牛血清最普遍以小牛血清最普遍n血清由于含有多种细胞生长因子、促贴附因子及其多活性物质血清由于含有多种细胞生长因子、促贴附因子及其多活性物质n与合成培养基合用，能使细胞顺利增殖生长与合成培养基合用，能使细胞顺利增殖生长n常见使用最为常见使用最为5-20%58天然培养基天然培养基：n指来自动物体液或利用组织分离提取的一类
35、培指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基，如血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等。养基，如血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等。n优点：营养成分丰富，培养效果好优点：营养成分丰富，培养效果好n缺点：来源受限、成分复杂，缺点：来源受限、成分复杂，影响对某些实验产物的影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析提取和实验结果的分析、易发生支原体污染、易发生支原体污染 59合成培养基合成培养基:n是根据天然培养基的成分，用化学物质模拟合成、人工是根据天然培养基的成分，用化学物质模拟合成、人工设计、配制的培养基。设计、配制的培养基。n有一定的配方，是一种理想的培养基。有一定的配方，是一种理想的培养基。n主要
36、成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐等主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐等n在目前常用的培养基中，葡萄糖和谷胺酰胺是体外培养动物细胞在目前常用的培养基中，葡萄糖和谷胺酰胺是体外培养动物细胞的主要能源的主要能源 n优点：标准化生产，组分和含量相对固定、成本低优点：标准化生产，组分和含量相对固定、成本低 n缺点：缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要n人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）需补充一定量的天然培养基（如血清）60
37、n血清中含有血清中含有：多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）多种金属离子多种金属离子 激素激素促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等各种生长因子各种生长因子转移蛋白转移蛋白不明成分不明成分n支持细胞生长需加支持细胞生长需加 1010血清血清61血清质量好坏是实验成败的关键血清质量好坏是实验成败的关键n常用血清有常用血清有胎牛胎牛、新生牛、小牛、新生牛、小牛、兔、马血清等、兔、马血清等n优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染支原体、病毒污
38、染n血清的灭活（消除补体活性）：血清的灭活（消除补体活性）：5656，3030分钟分钟n血清的消毒：过滤除菌血清的消毒：过滤除菌62无血清培养基无血清培养基n由由基础培养基基础培养基和和替代血清的补充成分替代血清的补充成分组成。组成。n19751975年，年，SatoSato首次成功地用无血清培养基培养了垂首次成功地用无血清培养基培养了垂体细胞株体细胞株n近近2020多年来已报道了几十种细胞系在无血清培养基多年来已报道了几十种细胞系在无血清培养基中成功地生长和增殖中成功地生长和增殖n无血清培养基尚处于研究阶段，难以推广。无血清培养基尚处于研究阶段，难以推广。目前，绝大多数人工合成培养基使用时还
39、需添加血目前，绝大多数人工合成培养基使用时还需添加血清清63常用细胞培养基常用细胞培养基 1.MEM(minimum essential media)2.DMEM（Dulbeccos modified Eagle medium)3.IMDM（Iscoves modified Dulbeccos medium）4.RPMI-16405.199细胞培养基系列6.欧氏平衡盐7.F-10,F-12细胞培养基系列8.水解乳蛋白细胞培养基9.其它类型细胞培养基64抗生素的使用抗生素的使用n在培养液配制后，培养液内常加适量抗在培养液配制后，培养液内常加适量抗生素，以抑制可能存在的细菌的生长生素，以抑制可能存
40、在的细菌的生长n青霉素和链霉素联用青霉素和链霉素联用n庆大霉素：方便、广谱、稳定庆大霉素：方便、广谱、稳定n工作浓度工作浓度npenicillin 100 units/ml nstreptomycin 100 ug/ml ngentamicin 50 ug/ml 65完全培养基的组成完全培养基的组成n基础培养基基础培养基 8080-95-95n血清血清 5 5-20-20n碳酸氢钠碳酸氢钠 2.0 g/L2.0 g/Ln青、链霉素青、链霉素 各各100u/ml100u/ml66细胞培养用液的配制与消毒细胞培养用液的配制与消毒一、水的制备：一、水的制备：二、二、PBS的制备与消毒的制备与消毒三、
41、胰蛋白酶溶液的配制三、胰蛋白酶溶液的配制 因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制。常用的浓度是0.25,用滤器过滤除菌四、青、链霉素溶液的配制四、青、链霉素溶液的配制1、所用纯净水（双蒸水）需要15磅高压20分钟灭菌。2、具体操作均在超净台内完成。青霉素是80万单位/瓶，用注射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万单位/瓶，加5ml灭菌双蒸水，即每毫升各为20万单位。3、使用时溶入培养液中，使青链霉素的浓度最终为100单位/ml。67RPMI1640RPMI1640培养基的制备培养基的制备 RPMI-1640培养粉培养粉 1袋袋 碳酸氢钠碳酸氢钠 2.0 g 青、链霉素青、链霉素 各各100单位毫升单位毫升 加三蒸水加三蒸水 至至 1000ml,过滤除菌过滤除菌 调节调节pH值至值至7.2-7.4 加血清（终浓度加血清（终浓度 10）68
