1、口腔细胞培养及其应用提要：提要：本章介绍细胞培养的基本原理及基本方法；牙齿相关细胞、唾液腺细胞、口腔黏膜细胞、颌骨相关硬组织细胞、口腔肿瘤细胞的培养及特点；组织工程的基本原理、口腔组织特有的干细胞、再生医学技术在口腔医学中的应用；基因芯片、蛋白芯片、组织芯片，蛋白质组学、生物信息学、模式生物学、系统生物学等。重点掌握细胞培养基本原理及方法，口腔医学中相关细胞培养及其特点，了解口腔干细胞培养在口腔再生医学中的应用及口腔生物学其他研究方法。第一节 细胞培养一、细胞培养的基本原理第一节 细胞培养的基本原理细胞培养的基本概念n细胞培养：细胞培养：模拟体内的生理环境，在适当的条件下，使活体组织细胞在体外
2、环境存活、生长增殖，并维持其结构功能n原代培养原代培养：取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养n传代培养：传代培养：n细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中第一节 细胞培养的基本原理体外细胞生物学体外细胞生物学v形态特点形态特点贴壁型细胞悬浮型细胞v生长增殖过程生长增殖过程培养细胞生命期培养细胞一代生存期第一节 细胞培养的基本原理贴壁型细胞n必须贴附于支持物表面才能生长。大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞按照培养细胞的主要形态，可分为几大类型按照培养细胞的主要形态，可分为几大类型：n上皮型n成纤维型n游走型n多形型第一节 细胞培养的基本原理
3、悬浮型细胞n于悬浮状态下即可生长n不需要贴附于支持物表面n多见于血液淋巴细胞第一节 细胞培养的基本原理几种常见细胞的形态几种常见细胞的形态原代培养神经元细胞（10）原代培养星形细胞（10）神经细胞瘤细胞系（10）N20Y结肠癌细胞系（10）Caco-2第一节 细胞培养的基本原理培养细胞生命期n所谓培养细胞生命期，指细胞在培养中持续增殖和生长的时间 细胞全部生存过程大致分为以下三个阶段细胞全部生存过程大致分为以下三个阶段：n原代培养期n传代期 n衰退期第一节 细胞培养的基本原理n原代培养期：原代培养期：也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续14周 n传代期：传代期：初代
4、培养细胞一经传代后便改称为细胞系。在全生命期中此期的持续时间最长n衰退期：衰退期：此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡第一节 细胞培养的基本原理细胞永生性细胞永生性n也称不死性，即细胞获持久性增殖能力，成为无限细胞系n无限细胞系的形成主要发生在第二期末，或第三期初阶段n细胞获不死性后，核型大多变成异倍体。可能恶性变n细胞永生性和恶性性非同一性状第一节 细胞培养的基本原理第一节 细胞培养的基本原理培养细胞一代生存期所谓细胞所谓细胞“一代一代”，系仅指从细胞接种到分离再，系仅指从细胞接种到分离再培养时的一段时间，细胞传代后，一般要经过以培养时的一段时间，细胞传代后，
5、一般要经过以下三个阶段下三个阶段:n 潜伏期（游离期，贴壁期）n 对数生长期n 停滞期（平台期）第一节 细胞培养的基本原理培养细胞一代生存期第一节 细胞培养的基本原理细胞生长过程中的重要现象n接触抑制：接触抑制：由于细胞的相互接触而抑制细胞运动n密度抑制：密度抑制：细胞因营养的枯竭和代谢物的影响而停止生长第一节 细胞培养的基本原理培养细胞的体外生长环境n无污染环境n基质n气体环境和氢离子浓度n液相环境n温度n渗透压第一节 细胞培养的基本原理 无污染环境：无污染环境：n高压蒸汽消毒器n电热干燥箱n滤器n超净工作台n紫外灯 第一节 细胞培养的基本原理基质：基质：n玻璃基质n塑料n饲养细胞，又称滋养
6、细胞n生物性基质处理培养表面n金属 第一节 细胞培养的基本原理气体环境和氢离子浓度气体环境和氢离子浓度：n5%二氧化碳 n95%空气 npH为7.27.4 第一节 细胞培养的基本原理液相环境：液相环境：n水：新鲜配置的三蒸水或去离子水n平衡盐液：Hanks液、PBS、Earle液等n天然培养基 n合成培养基 n无血清培养基 第一节 细胞培养的基本原理n温度维持温度维持：（：（36.50.5）n渗透压渗透压：290320 mOsm/kg 第一节 细胞培养的基本原理细胞培养常见仪器超净工作台细胞培养箱倒置相差显微镜第一节 细胞培养的基本原理二、细胞培养的基本方法二、细胞培养的基本方法第一节 细胞培
7、养的基本原理无菌操作中的注意事项n对实验中可能用到的器具及培养用液进行严格消毒灭菌 n培养室的消毒：培养室和超净台要用紫外灯和酒精严格消毒n进入无菌室前要按照外科手术无菌要求进行洗手与着装 n培养过程中要注意无菌操作：时刻铭记无菌物品与有菌物品要分开处理第一节 细胞培养的基本原理ABA 超净工作台中的实验用品要摆放整齐B 实验前75%酒精喷洗双手无菌操作技术第一节 细胞培养的基本原理C D 开启封闭瓶口等操作应在火焰就近的地方，并轻轻灼烧CD第一节 细胞培养的基本原理EFE F移液操作第一节 细胞培养的基本原理基本培养操作技术n培养细胞的取材与分离 n体外培养细胞的纯化 n细胞的冻存与复苏 第
8、一节 细胞培养的基本原理培养细胞的取材与分离培养细胞的取材与分离n 取材部位准确n 严格无菌操作n 尽快培养n 减小损伤n 制备标本第一节 细胞培养的基本原理体外细胞的纯化体外细胞的纯化n人工纯化：酶消化法、机械刮除法、反复贴壁法、克隆法、培养基限定法、流式细胞仪分离法 等n自然纯化 第一节 细胞培养的基本原理细胞冻存要点：细胞冻存要点：n冷冻过程要缓慢n冻存细胞必须处在对数生长期细胞复苏要点：细胞复苏要点：n快速解冻n解冻后的细胞应离心去除冷冻保护剂后再接种到培养基中第一节 细胞培养的基本原理细胞培养的污染、检测与控制 n微生物污染：微生物污染：细菌，真菌，支原体等污染n化学污染：化学污染：
9、指影响细胞生存的非细胞所需物质混入培养物中，应在操作中防止 n细胞交叉污染：细胞交叉污染：指目的细胞中混入其他种细胞，预防方法主要是严格按照规定操作，做好标记，避免发生混乱 第一节 细胞培养的基本原理微生物污染：微生物污染：n污染的途径：空气、器材、操作、试剂、组织标本 n微生物污染的检测 n微生物污染的控制：抗生素除菌法；加温处理 第一节 细胞培养的基本原理FL cell polluted by Staphylococcus FL cell polluted by G+Bacteria 首都医科大学 细胞生物学系 张海燕提供第一节 细胞培养的基本原理FL cell polluted by e
10、scherichia coli FL cell polluted by mold fungus 首都医科大学 细胞生物学系 张海燕提供第一节 细胞培养的基本原理细胞培养常用方法：细胞培养常用方法：n组织块培养法n酶消化法第一节 细胞培养的基本原理第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点一、牙齿相关细胞第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点牙周膜细胞n培养方法：组织块法；酶消化法n细胞形态特点n免疫组织化学染色n体外培养细胞的生长增殖特点n功能特点n牙周膜细胞增殖分化的影响因素第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点 细胞形态特点细胞形态特点 原代 人牙周膜成纤维细胞（10）第3代人牙周膜成纤维细胞
11、（10）第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点 免疫组织化学染色免疫组织化学染色波形丝蛋白染色阳性（10）角蛋白染色阴性（10）第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点体外培养细胞特点：体外培养细胞特点：n成功率高于牙髓细胞，达40%80%n可在体外长时间存活达412个月n可持续传40代以上第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点功能特点功能特点n分泌功能n矿化功能n收缩功能n再生功能n根面吸附等第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点牙周膜细胞增殖分化的影响因素牙周膜细胞增殖分化的影响因素n生长因子n胰岛素n纤维黏连蛋白n抗坏血酸n羟基磷灰石第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点牙髓细胞n培养方法
12、：酶消化法；组织块培养法n细胞形态特点：成纤维细胞型（与牙周膜细胞类似）n免疫组织化学染色：波形丝蛋白（+）；角蛋白（-）n体外培养细胞的生长增殖特点n功能特点第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点生长增殖特点生长增殖特点n生长增殖较快n可传代至第1520代n长时间体外培养可呈复层生长第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点功能特点功能特点n碱性磷酸酶活性n矿化现象n对钙调节因子的反应n对细胞因子的反应n对氢氧化钙、羟基磷灰石盖髓剂的反应第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点二、唾液腺细胞二、唾液腺细胞第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点唾液腺细胞n形态特点n免疫组织化学特点n功能特点n唾液腺
13、细胞的增殖与分化n调节唾液腺细胞增殖、分化和功能的因素第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点细胞形态特点细胞形态特点n腺泡上皮细胞：体外培养的腺泡细胞多呈“铺路石”样排列n导管上皮细胞：导管上皮细胞呈多边形n肌上皮细胞：肌上皮细胞呈梭形或星形第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点导管上皮细胞导管上皮细胞（HSG HSG 细胞系）细胞系）HSG细胞系（4）HSG细胞系（10）第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点A 小型猪腮腺上皮细胞原代培养（10）B 小型猪腮腺上皮细胞alpha淀粉酶免疫组化染色（10）腺泡细胞上皮细胞腺泡细胞上皮细胞第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点免疫组织化学染色免疫
14、组织化学染色n腺泡上皮细胞：角蛋白、淀粉酶、对氨基水杨酸、导管上皮膜、前角蛋白、单克隆角蛋白、分泌成分阳性反应n导管上皮细胞：角蛋白、上皮膜蛋白、磷酸酐酶抗体染色阳性反应n肌上皮细胞：肌动蛋白、S-100蛋白、肌凝蛋白抗体染色阳性反应第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点导管上皮细胞（HSG 细胞系）第三节 细胞培养在口腔再生医学中的应用影响破骨细胞功能的因素：第一节 细胞培养的基本原理牙齿相关细胞、唾液腺细胞、口腔黏膜细胞、颌骨相关硬组织细胞、口腔肿瘤细胞的培养及特点；细胞形态特点：成纤维细胞型（与牙周膜细胞类似）第一节 细胞培养的基本原理第四节 口腔生物学其他研究方法取自体内新鲜组织并置于
15、体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养基因芯片技术是高效地大规模获取相关生物信息的重要手段研究疾病的发病机制，协助寻找疾病诊断和治疗的靶分子Mass spectrum功能特点：分泌功能特点：分泌n腺泡细胞：淀粉酶、PRP、唾液过氧化物酶、特异蛋白等n腺泡上皮细胞：顶端分泌、基底及侧膜分泌n导管细胞：胶原n肌上皮细胞：胶原第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点唾液腺细胞的增殖分化唾液腺细胞的增殖分化n基底潜能干细胞理论n单细胞全能干细胞理论n双细胞亚全能干细胞理论第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点调节唾液腺细胞增殖、分化和功能的因素调节唾液腺细胞增殖、分化和功能的因素n细胞因子n激素n细
16、胞外基质 n钙离子第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点三、口腔黏膜细胞三、口腔黏膜细胞第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点口腔黏膜细胞口腔黏膜细胞n培养方法：组织块法和酶消化法n形态特点：卵圆形、多边形，呈“铺路石”样单层排列n免疫组织化学染色：波形丝蛋白阴性，角蛋白阳性n功能：分泌大量的胶原蛋白与非胶原蛋白第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点 兔口腔黏膜上皮细胞兔口腔黏膜上皮细胞A AB BA 无血清培养基培养条件下（10）B 滋养细胞层培养条件下（4）第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点四、颌骨相关的硬组织细胞四、颌骨相关的硬组织细胞第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点破骨细胞破
17、骨细胞n形态学特点：体积大，多核n组织化学染色：破骨细胞单克隆抗体呈阳性反应，与降钙素反应呈蓝紫色，与抗酒石酸磷酸酶反应呈棕褐色n功能：骨吸收功能n影响破骨细胞功能的因素：促进破骨细胞功能：破骨细胞激活因子、甲状旁腺素等 抑制破故细胞功能：-干扰素、降钙素等第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点成骨细胞成骨细胞n形态学特点：不同培养方法所获得的成骨细胞形态各有差异n免疫组织化学染色特点：BGP、型胶原、碱性磷酸酶活性n功能：成骨作用 调节破骨细胞骨吸收作用第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点软骨细胞软骨细胞n形态学特点：多角形，可形成甲苯胺蓝染色阳性的物质n免疫组织化学染色特点：GAG、型和
18、型胶原n功能：形成软骨或骨n影响软骨细胞功能、分化的因素：激素、细胞因子、机械张力和压力、体外培养环境第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点五、口腔肿瘤细胞五、口腔肿瘤细胞第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点口腔鳞癌细胞口腔鳞癌细胞n细胞系来源：舌鳞状细胞癌标本原代及传代培养n生物学特性：多角形上皮样细胞 核/浆比例高，多核仁 高贴壁率，克隆形成率和软琼脂集落形成率第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点B 实验前75%酒精喷洗双手B 滋养细胞层培养条件下（4）协助人类基因组学的研究可传代至第1520代培养细胞的体外生长环境神经细胞瘤细胞系（10）固定于载体上的蛋白质的稳定性直接影响蛋白芯片的
19、稳定性影响软骨细胞功能、分化的因素：激素、细胞因子、机械张力和压力、体外培养环境第一节 细胞培养的基本原理蛋白质组学研究内容及方法第四节 口腔生物学其他研究方法A 无血清培养基培养条件下（10）蛋白质组研究中主要应用的技术：第四节 口腔生物学其他研究方法第四节 口腔生物学其他研究方法衰退期：此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；污染的途径：空气、器材、操作、试剂、组织标本唾液唾液腺肿瘤细胞腺肿瘤细胞人黏液表皮样癌人黏液表皮样癌MEC-1细胞系细胞系：n低转移细胞株Mc1、Mc2n高转移细胞株Mc3、M3SP4腺样囊腺癌腺样囊腺癌ACC-2、ACC-3细胞系细胞系第二节 口腔医学中相关细胞培养及
20、其特点成釉细胞瘤细胞成釉细胞瘤细胞n细胞系来源：肿瘤组织原代及传代培养n生物学特性：生长增殖缓慢，二倍体细胞型n应用：目前已获得永生细胞系AM-1及 hTERT(+)-AM细胞系第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点第三节 细胞培养在口腔再生医学中的应用n组织工程的基本原理组织工程的基本原理n口腔组织特有的干细胞口腔组织特有的干细胞n再生医学技术在口腔医学中的应用再生医学技术在口腔医学中的应用第三节 细胞培养在口腔再生医学中的应用组织工程的基本原理n种子细胞体外扩增，与生物材料按一定的比例混合，将细胞-材料复合物植入机体的组织或器官的病损部位，以达到修复创伤和重建功能的目的n目前组织工程常用的
21、支架材料是合成的可生物降解的高分子聚合物是聚乳酸（PLA）、聚乙醇酸（PGA）、聚乳酸和聚乙醇酸复合物（PLGA）等第三节 细胞培养在口腔再生医学中的应用口腔组织特有的干细胞n牙髓干细胞n牙周膜干细胞n脱落乳牙牙髓干细胞n根尖牙乳头干细胞n唾液腺干细胞 第三节 细胞培养在口腔再生医学中的应用牙髓干细胞牙髓干细胞n比BMSCS具有更强的增殖率、克隆形成率和倍增率n可被诱导分化为脂肪细胞、神经样细胞nStroo-1和CD146等干细胞表面标记阳性n体内诱导可形成类似牙本质-牙髓复合体样的结构第三节 细胞培养在口腔再生医学中的应用脱落乳牙牙髓干细胞脱落乳牙牙髓干细胞n比BMSSCs具有更强的增殖率、
22、克隆形成率和倍增率nStroo-1和CD146等干细胞表面标记阳性n可诱导分化为神经细胞、脂肪细胞和成牙本质细胞n体外可形成钙化结节n内体可在免疫缺陷小鼠皮下成骨和产生牙本质样物质第三节 细胞培养在口腔再生医学中的应用牙周膜干细胞牙周膜干细胞nStro-1和MUC18及腱特异性标记SCX表达阳性n可被诱导分化为牙髓母细胞、脂肪细胞、纤维母细胞、牙骨质细胞和成骨细胞n体外可形成矿化结节，表达碱性磷酸酶或骨唾液蛋白n体内试验牙周膜干细胞能产生沿牙周膜结缔组织方向走行的牙骨质样结构第三节 细胞培养在口腔再生医学中的应用根尖牙乳头干细胞根尖牙乳头干细胞n比牙髓干细胞具有更高的增殖活性nCD24是SCA
23、P较特异的表面标志物n在体外SCAP可横向分化为成牙本质细胞和脂肪细胞，并能产生比牙髓干细胞更多的牙髓-牙本质复合物第三节 细胞培养在口腔再生医学中的应用唾液腺干细胞唾液腺干细胞 n组织定位：导管上皮 停留在腺泡、间质中的前体细胞n可诱导分化为表达肝细胞和胰腺内分泌细胞表型n体外培养后植入肝脏，可分泌白蛋白第三节 细胞培养在口腔再生医学中的应用再生医学技术在口腔医学中的应用n在颌面重建中的作用：介导颌面部骨及软骨缺损修复n在引导口腔组织再生中的作用：促进牙周组织重建n组织工程化黏膜在口腔医学中的应用 n组织工程用于人造唾液腺n牙再生：组织工程方法-种子细胞+支架材料 发育生物学-模拟牙齿发育的
24、过程第三节 细胞培养在口腔再生医学中的应用第四节 口腔生物学其他研究方法口腔生物学其他研究方法n基因芯片、蛋白芯片 和组织芯片n蛋白质组学n生物信息学n模式生物学n系统生物学第四节 口腔生物学其他研究方法基因芯片技术n基因芯片技术，又称DNA微阵列技术，是将cDNA文库中已知和未知的全长序列或寡核苷酸序列固定于玻片上，同时检测比较生物样品中多个已知或未知序列的表达状况n基因芯片技术基本原理与经典的核酸分子杂交方法是一致的n基因芯片技术是高效地大规模获取相关生物信息的重要手段第四节 口腔生物学其他研究方法基因芯片技术的基因芯片技术的主要技术流程主要技术流程n芯片的设计与制备n靶基因的标记n芯片杂
25、交与杂交信号检测第四节 口腔生物学其他研究方法基因芯片技术的应用基因芯片技术的应用n基因表达谱分析n新基因发现n基因突变及多态性分析n基因组文库作图n疾病诊断和预测n药物筛选n基因测序等第四节 口腔生物学其他研究方法基因芯片技术存在的问题基因芯片技术存在的问题n设备昂贵，例如制造仪器，现代化的实验平台及激光共聚焦显微镜等，并且制造光刻掩膜需较高费用nDNA芯片上原位合成探针难免有错误核苷酸掺入及混入杂质，使整个杂交背景增高，降低特异性第四节 口腔生物学其他研究方法蛋白芯片技术n蛋白芯片是以蛋白质代替DNA作为检测对象，与在mRNA水平上的检测基因表达的基因芯片不同，它直接在蛋白水平上检测表达模
26、式n在基因表达研究中比基因芯片有着更加直接的应用前景第四节 口腔生物学其他研究方法蛋白芯片技术主要技术流程Chip membraneHybridizationLabeled protein sampleAdd StreptavidinStreptavidinFluorescent labelingStreptavidin AbAdd fluorescent labelingStreptavidin AbFluorescent detect第四节 口腔生物学其他研究方法蛋白芯片技术的应用蛋白芯片技术的应用n研究疾病的发病机制，协助寻找疾病诊断和治疗的靶分子n探讨作用物与酶相互作用的机制的分析n开
27、发新药以及协助蛋白质组的研究第四节 口腔生物学其他研究方法存在的问题存在的问题n固定于载体上的蛋白质结构单一，无法反应蛋白质结构的多样性n固定于载体上的蛋白质的稳定性直接影响蛋白芯片的稳定性n蛋白芯片造价比较昂贵n影响结果特异性的因素较多第四节 口腔生物学其他研究方法组织芯片技术n组织芯片技术是近年来基因芯片技术的发展和延伸n它可以将大量临床组织标本排列在一张载体进行分析研究n可以最大限度地利用组织资源n所需样品少，是一种高通量、多样本的分析工具第四节 口腔生物学其他研究方法应用应用n协助人类基因组学的研究n疾病相关基因的验证n新药物的开发与筛选n治疗过程的追踪和预后等方面的研究第四节 口腔生
28、物学其他研究方法蛋白质组学n蛋白质组学的研究对象是特定的时间和特定的空一个完整的生物体（或细胞）所表达的全体蛋白质的特征n包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白质与蛋白质相互作用等n在蛋白质水平上获得对于有关生物体生理、病理等过程的全面认识第四节 口腔生物学其他研究方法蛋白质组学的研究内容蛋白质组学的研究内容n蛋白质鉴定n翻译后修饰n蛋白质功能确定n服务于人类的健康第四节 口腔生物学其他研究方法Intact cell of tissueCell lysisProtein LC2D gelsMixture of proteinsCollect fractionIndividual protei
29、nTrypsin digestionProtein LC profileProtein LC profileMass spectrumMixture of proteinElectrospray of MALDIQuantitative ComparisonsProtein IdentificationMass spectrumProtein LC profile2D gelimageTrypsin digestionExtract spotTrypsin digestionElectrospray of MALDI蛋白质组学研究内容及方法第四节 口腔生物学其他研究方法蛋白质组学研究方法蛋白质
30、组学研究方法n组成性蛋白质组学研究（compositional proteomics）采用高通量的蛋白质组研究技术分析尽可能多乃至接近所有的蛋白质n比较蛋白质组学研究（comparative proteomics）以重要生命过程或人类重大疾病为对象，进行重要生理/病理体系或过程的研究第四节 口腔生物学其他研究方法蛋白质组研究中主要应用的技术：蛋白质组研究中主要应用的技术：n双相电泳（2-DE）n新型质谱（MS）技术n数据库设置与检索系统等第四节 口腔生物学其他研究方法生物信息学n生物信息学是对实验生物学资料进行的再加工整理，同时又通过检索等手段对进一步的生物学实验进行理论预测与指导的一门科学第四节 口腔生物学其他研究方法研究内容研究内容n收集生物信息数据，建立生物信息学数据库n根据生物学知识与统计学知识建立算法理论n通过生物信息学的门户网站和检索与搜索工具有效促进与指导生物信息资源的共享与利用第四节 口腔生物学其他研究方法模式生物学n揭示基因功能的最有效方法之一是定向改变生物的某个基因从而观察其引起的表型，模式生物学就是通过研究模式生物从而获得人类遗传生命奥秘的一门科学n小鼠、果蝇、线虫是最常见最有效的实行大规模基因操作的模式生物第四节 口腔生物学其他研究方法谢谢观看谢谢观看
