1、第二章第二章 微生物的纯培养和微生物的纯培养和显微技术显微技术微生物的分离和纯培养微生物的分离和纯培养显微镜和显微技术显微镜和显微技术1 1微生物的分离和纯培养微生物的分离和纯培养v无菌技术无菌技术v用液体培养基分离、培养用液体培养基分离、培养v用固体培养基分离、培养用固体培养基分离、培养v二元培养物分离、培养二元培养物分离、培养v选择培养分离选择培养分离v单孢子分离单孢子分离微生物分离方法微生物分离方法微生物纯种分离微生物纯种分离v将多种混杂微生物，经某种技术或方法将多种混杂微生物，经某种技术或方法分离成纯种的过程分离成纯种的过程纯培养（纯培养（pure culture）v在适宜条件下培养纯
2、种获得的在适宜条件下培养纯种获得的培养物培养物（群体）（群体）l单个微生物在适宜的固体培养基表面或内单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，见的、有一定形态结构的子细胞群体，称称为菌落为菌落(colony)。菌落菌落一个菌落是一个纯种，也是一个纯培养；一个菌落是一个纯种，也是一个纯培养；单个微生物只在固体培养基上形成菌落；单个微生物只在固体培养基上形成菌落；在液体培养基中不会形成菌落在液体培养基中不会形成菌落同一细菌在不同的培养平板上形成不同的特征菌落同一细菌在不同的培养平板上形成不同的特征菌
3、落 一、用固体培养基（营养琼脂平板）一、用固体培养基（营养琼脂平板）分离纯种分离纯种微生物样品微生物样品多种混杂多种混杂某种方法某种方法分散成单个微生物分散成单个微生物平板平板培养培养单菌落单菌落每个菌落为纯种（纯培养）每个菌落为纯种（纯培养）单菌落转接培养单菌落转接培养纯种（纯培养）纯种（纯培养）（一）、微生物纯种分离的原理和方法（一）、微生物纯种分离的原理和方法（二）、纯种平板分离的不同方法（二）、纯种平板分离的不同方法从土壤中分离纯微生物从土壤中分离纯微生物104/ml103/ml102/ml101/ml涂布平板法涂布平板法稀释倒平板法稀释倒平板法1、涂布平板法、涂布平板法（spread
4、 plate method)2、稀释倒平板法（倾注平板法）、稀释倒平板法（倾注平板法）（pour plate method)分区划线法（蛇形线法）操作图分区划线法（蛇形线法）操作图第一区划线第一区划线灭菌接种环灭菌接种环第二区划线第二区划线灭菌接种环灭菌接种环第三区划线第三区划线灭菌接种环灭菌接种环3、平板划线法（、平板划线法（streak plate method）分区划线法适用范围：分区划线法适用范围：适用于浓度较大的样品适用于浓度较大的样品连续划线法操作图连续划线法操作图连续划线法适用范围：连续划线法适用范围：适用于浓度较小的样品适用于浓度较小的样品培养严格厌氧微生物培养严格厌氧微生物4
5、、稀释摇管法（、稀释摇管法（dilution shake culture method)二、用液体培养基分离纯化培养二、用液体培养基分离纯化培养 个别细胞较大的细菌个别细胞较大的细菌 原生动物、藻类原生动物、藻类接种物液体培养基顺序稀释法分离接种物液体培养基顺序稀释法分离营养琼脂平板不能长菌落营养琼脂平板不能长菌落如何分离纯培养？如何分离纯培养？培养物在液体培养基中进行高度顺序稀释，培养物在液体培养基中进行高度顺序稀释，如果经稀释后的同一稀释度的如果经稀释后的同一稀释度的大多数大多数（95%95%以上）试管中没有微生物生长以上）试管中没有微生物生长，有，有微生物生长的试管得到的培养物可能就是微
6、生物生长的试管得到的培养物可能就是纯培养物。纯培养物。上节课知识回顾上节课知识回顾v微生物分离纯化方法微生物分离纯化方法v用固体培养基分离、纯培养用固体培养基分离、纯培养v稀释倒平板法稀释倒平板法v涂布平板法涂布平板法v平板划线法平板划线法v稀释摇管法稀释摇管法v用液体培养基分离、纯培养用液体培养基分离、纯培养三、单细胞（单孢子）分离三、单细胞（单孢子）分离采用显微分离法从混杂群体中直接分离单采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以得到纯培养，个细胞或单个个体进行培养以得到纯培养，称为单细胞（单孢子）分离法。称为单细胞（单孢子）分离法。l个体较小的微生物需采用显微操作仪个
7、体较小的微生物需采用显微操作仪v分离难度与细胞或个体的大小成反比分离难度与细胞或个体的大小成反比v营养琼脂平板上不能形成菌落营养琼脂平板上不能形成菌落l较大的微生物可使用毛细管提取较大的微生物可使用毛细管提取Each colony was examined microscopically四、选择培养分离四、选择培养分离v创造适于目的微生物生长条件创造适于目的微生物生长条件原理原理v促使目的微生物快速生长呈优势菌促使目的微生物快速生长呈优势菌v抑制非目的微生物生长抑制非目的微生物生长v从混杂微生物中分离目的微生物从混杂微生物中分离目的微生物1 1、利用选择培养基进行直接分离、利用选择培养基进行直
8、接分离选择培养基选择培养基 只允许特定微生物生长，而同时抑制或阻止其只允许特定微生物生长，而同时抑制或阻止其他微生物生长的培养基他微生物生长的培养基土壤土壤目的菌优势目的菌优势非目的菌非目的菌选择培养基选择培养基直接分离直接分离单细胞单细胞选择培养基平板选择培养基平板（含牛奶或酪蛋（含牛奶或酪蛋白唯一白唯一C、N源）源）37培养培养目的菌落目的菌落菌落周围有透明菌落周围有透明蛋白水解圈蛋白水解圈1 1、利用选择培养基进行直接分离、利用选择培养基进行直接分离例一：分离筛选蛋白酶产生细菌例一：分离筛选蛋白酶产生细菌含牛奶选择培养基目的菌生长平板含牛奶选择培养基目的菌生长平板营养选择因子：牛奶或酪蛋
9、白营养选择因子：牛奶或酪蛋白只允许分解利用蛋白质的目的菌生长，淘汰非目的菌只允许分解利用蛋白质的目的菌生长，淘汰非目的菌长出的目的菌并不一定是同种细菌，但皆产蛋白酶长出的目的菌并不一定是同种细菌，但皆产蛋白酶例一：分离例一：分离筛选蛋白酶筛选蛋白酶产生细菌产生细菌例二：分离筛选产高温淀粉酶（例二：分离筛选产高温淀粉酶（65）细菌）细菌单细胞单细胞选择培养基平板选择培养基平板（淀粉为唯一（淀粉为唯一C源）源）65培养培养淀粉水解透明圈淀粉水解透明圈目的菌菌落目的菌菌落选择因子：营养选择因子淀粉选择因子：营养选择因子淀粉 环境选择因子环境选择因子65高温高温人为创造一些条件人为创造一些条件只让所需
10、的微生物生长只让所需的微生物生长，在这些条件下，所需要的微生物能有效地与在这些条件下，所需要的微生物能有效地与其他微生物进行竞争，在生长能力方面远远其他微生物进行竞争，在生长能力方面远远超过其他微生物。超过其他微生物。2 2、富集培养法、富集培养法富集培养是分离微生物菌种最强有力的技术之一富集培养是分离微生物菌种最强有力的技术之一营养选择因子和生理条件选择因子可无穷尽组营养选择因子和生理条件选择因子可无穷尽组合，可从自然界选择分离各类特异微生物合，可从自然界选择分离各类特异微生物例：从土壤中分离能产生例：从土壤中分离能产生 半乳糖苷酶的微生物半乳糖苷酶的微生物富集培养富集培养选择培养基分离选择
11、培养基分离目的菌验证目的菌验证如果培养物中只含有如果培养物中只含有两种两种微生物，而且是有意微生物，而且是有意识的保持两者之间的特定关系的培养物称为二识的保持两者之间的特定关系的培养物称为二元培养物。元培养物。五、二元培养物五、二元培养物微生物纯培养分离方法的比较微生物纯培养分离方法的比较方法方法应用范围应用范围稀释倒平板法稀释倒平板法涂布平板法涂布平板法平板划线法平板划线法稀释摇管法稀释摇管法液体稀释法液体稀释法单细胞分离法单细胞分离法选择培养分离选择培养分离即可定义即可定义,又可定量又可定量,用途广泛用途广泛用得最多用得最多方法简便方法简便,多用于分离细菌多用于分离细菌主要分离严格厌氧菌主
12、要分离严格厌氧菌适用于培养细胞较大的微生物适用于培养细胞较大的微生物局限于高等专业化的科学研究局限于高等专业化的科学研究适用于分离某些生理类型较特殊适用于分离某些生理类型较特殊的微生物的微生物六、无菌技术六、无菌技术在分离、转接及培养纯培养物时防止其被在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其他微生物其他微生物污染的技术称为无菌技术。它是污染的技术称为无菌技术。它是微生物研究进行的关键。微生物研究进行的关键。用于分离、培养微生物的器具事先不含任何微生物用于分离、培养微生物的器具事先不含任何微生物在转接、培养微生物时防止其他微生物的污染在转接、培养微生物时防止其他微生物的污染1 1、所用物品的灭菌技
13、术、所用物品的灭菌技术vA、玻璃或金属器皿灭菌、玻璃或金属器皿灭菌v高温干热灭菌：干燥箱高温干热灭菌：干燥箱v160170干热空气干热空气2h灭灭菌菌v湿热灭菌：高压蒸汽灭菌锅湿热灭菌：高压蒸汽灭菌锅v121湿热灭菌湿热灭菌30minvB、培养基或溶液的灭菌、培养基或溶液的灭菌v湿热灭菌：高压蒸汽灭菌锅湿热灭菌：高压蒸汽灭菌锅v121湿热灭菌湿热灭菌30minC、血清或生长因子溶液灭菌、血清或生长因子溶液灭菌过滤除菌：细菌滤器过滤除菌：细菌滤器滤膜孔径小于细菌细胞的大小滤膜孔径小于细菌细胞的大小上节课知识回顾上节课知识回顾v二、无菌技术二、无菌技术v单孢子分离单孢子分离v选择培养分离选择培养分
14、离v二元培养物二元培养物v一、微生物分离纯化方法一、微生物分离纯化方法1、所用物品的灭菌技术、所用物品的灭菌技术玻璃或金属器皿灭菌玻璃或金属器皿灭菌培养基或溶液灭菌培养基或溶液灭菌血清或生长因子灭菌血清或生长因子灭菌2 2、接种、接种接种接种:将微生物接到适于它生长繁殖的将微生物接到适于它生长繁殖的人工培人工培养基上或活的生物体内养基上或活的生物体内的过程叫做接种的过程叫做接种.无菌接种无菌接种:培养基培养基经高压灭菌后，用经过灭菌的经高压灭菌后，用经过灭菌的工具工具在无菌在无菌条件条件下将含菌材料接种于培养基下将含菌材料接种于培养基上，这个过程叫做无菌接种。上，这个过程叫做无菌接种。1.1.
15、接种针接种针 2.2.接种环接种环 3.3.接种钩接种钩 4.4.接种锄接种锄 5.5.接种铲接种铲6.6.接种匙接种匙 7.7.接种刀接种刀 8.8.接种刀接种刀9.9.剪刀剪刀10.10.钢钩钢钩 11.11.镊子镊子 12.12.弹簧接种枪弹簧接种枪13.13.接种、枪（日本式）接种、枪（日本式）涂布棒涂布棒弹簧接种枪弹簧接种枪接种环的灭菌接种环的灭菌接种环烧红接种环烧红接种环稍冷却接种环稍冷却接种工具接种工具挑选单个菌落挑选单个菌落划线划线1 1、实验台、实验台2 2、空气、空气环境条件环境条件 七、微生物的保藏技术v菌种保藏的原理：菌种保藏的原理：v根据菌种特性及保藏目的的不同，给微
16、生物根据菌种特性及保藏目的的不同，给微生物菌株以特定的条件，使其存活而得以延续。菌株以特定的条件，使其存活而得以延续。例如例如干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养等等条件，使菌株的代谢水平降低，乃至完全停条件，使菌株的代谢水平降低，乃至完全停止，达到半休眠或完全休眠的状态。止，达到半休眠或完全休眠的状态。v传代培养保藏传代培养保藏v冷冻保藏冷冻保藏v干燥保藏干燥保藏v纸片保藏纸片保藏v薄膜保藏薄膜保藏v寄主保藏寄主保藏微生物菌株保藏的方法：微生物菌株保藏的方法：传代保藏传代保藏斜面、半固体琼脂柱、液体斜面、半固体琼脂柱、液体传代培养保藏传代培养保藏斜面：斜面：可保存
17、数周至数年，可用石蜡或橡皮塞封口，低可保存数周至数年，可用石蜡或橡皮塞封口，低 温延长保存时间温延长保存时间 液体：液体：菌苔制成菌悬液，低温（悬液保藏法）菌苔制成菌悬液，低温（悬液保藏法）缺点：繁琐、易污染、变异丧生原有特性缺点：繁琐、易污染、变异丧生原有特性冷冻保藏冷冻保藏液氮保藏、低温冰箱等液氮保藏、低温冰箱等 液氮可达液氮可达196，效果较好效果较好注意：注意：速冻，减少冰晶损伤细胞速冻，减少冰晶损伤细胞冷冻保藏法冷冻保藏法v细胞体积大的要比体积小的对低温更敏感；细胞体积大的要比体积小的对低温更敏感；无细胞壁的比有细胞壁的更敏感。无细胞壁的比有细胞壁的更敏感。干燥保藏干燥保藏沙土管保藏
18、、冷冻真空干燥沙土管保藏、冷冻真空干燥 保藏保藏沙土管：沙土管：产孢子菌。制成孢子悬液，加无菌沙土管，减产孢子菌。制成孢子悬液，加无菌沙土管，减压抽干水分，石蜡封口，冰箱保存。压抽干水分，石蜡封口，冰箱保存。冷冻真空干燥：冷冻真空干燥：加保护剂样品预先冷冻，真空冰升华去加保护剂样品预先冷冻，真空冰升华去水，低温保存，保存数十年，目前最普遍、最重要的方水，低温保存，保存数十年，目前最普遍、最重要的方法，菌种保藏中心多采用此法。菌种保藏时采用法，菌种保藏中心多采用此法。菌种保藏时采用，防止某种方法失败导致菌种丧失防止某种方法失败导致菌种丧失。干燥保藏法干燥保藏法标准菌株的保存使用标准菌株的保存使用
19、v1.1.长期保存的储存菌株以冷冻干燥保藏为主，特殊要求长期保存的储存菌株以冷冻干燥保藏为主，特殊要求的菌种可用其它方法进行保存，保存期可长达几年至几十的菌种可用其它方法进行保存，保存期可长达几年至几十年。年。2.2.半储存菌株以含半储存菌株以含20%20%甘油的肉汤或液体石腊封存的半固甘油的肉汤或液体石腊封存的半固体琼脂为主，在体琼脂为主，在00以下保存，保存期为以下保存，保存期为3 36 6个月。个月。3.3.应用菌株以琼脂斜面为主，在应用菌株以琼脂斜面为主，在44保存，保存期为保存，保存期为1 13 3个月。个月。4.4.菌种的传代不可超过菌种的传代不可超过6 6次。视菌种的特性及使用情
20、况，次。视菌种的特性及使用情况，一般储存菌株每一般储存菌株每5 5年传记代一次，每年传记代一次，每1-21-2年从储存菌株转接年从储存菌株转接至半储存菌株，半储存菌株每至半储存菌株，半储存菌株每3-63-6个月传代一次，每个月传代一次，每1-31-3个个月从半储存菌株转接接至应用菌株。月从半储存菌株转接接至应用菌株。5.5.每次检验用的菌株必须是从应用菌株转接的新鲜菌株。每次检验用的菌株必须是从应用菌株转接的新鲜菌株。每支应用菌株用两次后必须销毁（每支应用菌株用两次后必须销毁（121121，0.1MPa0.1MPa高压灭高压灭菌处理菌处理1515分钟以上）。分钟以上）。国内外菌种保藏部分情况国
21、内外菌种保藏部分情况v我国于我国于19791979年年7 7月成立了中国微生物菌种保月成立了中国微生物菌种保藏管理委员会藏管理委员会(CCCCM).(CCCCM).该委员会下设该委员会下设6 6个菌个菌种保藏管理中心种保藏管理中心,其负责单位、代号及保藏其负责单位、代号及保藏菌种的性质如下菌种的性质如下:v普通微生物菌种保藏管理中心普通微生物菌种保藏管理中心(CCGMC)-(CCGMC)-中中科院微生物所科院微生物所,北京北京(AS),(AS),真菌、细菌真菌、细菌;中科中科院武汉病毒研究所院武汉病毒研究所,武汉武汉(AS-IV),(AS-IV),病毒。病毒。v农业微生物菌种保藏管理中心农业微
22、生物菌种保藏管理中心(ACCC)-(ACCC)-中中国农业科学院土壤肥料研究所国农业科学院土壤肥料研究所,北京北京(ISF)(ISF)。v工业微生物菌种保藏管理中心工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)-(CICC)-轻轻工业部食品发酵工业科学研究所工业部食品发酵工业科学研究所,南京南京(ID),(ID),真菌真菌;卫生部药品生物制品检定所卫生部药品生物制品检定所,北北京京(NICPBP),(NICPBP),细菌；中国医学科学院病毒研细菌；中国医学科学院病毒研究所究所,北京北京(IV),(IV),病毒。病毒。v抗菌素菌种保藏管理中心抗菌素菌种保藏管理中心(CACC)-(CACC)-中国医中国医
23、学科学院抗菌素研究所北京学科学院抗菌素研究所北京(IA)(IA)；四川抗；四川抗菌素工业研究所菌素工业研究所,成都成都(SIA),(SIA),新抗菌素菌种新抗菌素菌种;华北制药厂抗菌素研究所华北制药厂抗菌素研究所,石家庄石家庄(IANP),(IANP),生产用抗菌素菌种。生产用抗菌素菌种。v兽医微生物菌种保藏管理中心兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC)-(CVCC)-农农业部兽医药品监察所业部兽医药品监察所,北京北京(CIVBP)(CIVBP)。v 除了上述保藏中心外除了上述保藏中心外,我国从事微生物研我国从事微生物研究并保藏有一定数量各类专业用微生物菌究并保藏有一定数量各类专业用微生物菌种
24、的科研单位、大专院校还有近百所。种的科研单位、大专院校还有近百所。v世界世界5555个国家的菌种保藏机构共个国家的菌种保藏机构共352352个个,目前目前主要的菌种保藏机构有主要的菌种保藏机构有:v美国的美国的“美国典型菌种收藏所美国典型菌种收藏所”(ATCC)(ATCC)，保，保藏方式主要采用冷冻干燥和液氮超低温冻结藏方式主要采用冷冻干燥和液氮超低温冻结法。法。v美国美国“农业研究服务部菌种收藏所农业研究服务部菌种收藏所”(ARS)(ARS)设立在设立在“北方地区研究室北方地区研究室”(NRRL);(NRRL);v荷兰荷兰“真菌中心收藏所真菌中心收藏所”(CBS);(CBS);v日本日本“大
25、阪发酵研究所大阪发酵研究所”(IFO);(IFO);v法国法国“里昂巴斯德研究所里昂巴斯德研究所”(IPL);(IPL);v西德西德“柯赫研究所柯赫研究所”(RKI);(RKI);v苏联苏联“苏联科学院微生物研究所苏联科学院微生物研究所”(IM)(IM)。作业作业1 1、名词解释：无菌技术、单细胞分离名词解释：无菌技术、单细胞分离 2 2、一般可用哪些方法获得微生物的纯培养一般可用哪些方法获得微生物的纯培养物？物？上节课知识回顾上节课知识回顾v微生物分离纯化方法微生物分离纯化方法v用固体培养基分离、纯培养用固体培养基分离、纯培养v稀释倒平板法稀释倒平板法v涂布平板法涂布平板法v平板划线法平板划线法v稀释摇管法稀释摇管法v用液体培养基分离、纯培养用液体培养基分离、纯培养v单孢子分离单孢子分离v选择培养分离选择培养分离v二元培养物二元培养物
