1、同迴速操作條件下厭氧氨氧化反 應效能與菌相變化之研究摘要 厭氧氨氧化反應(Anammox,Anaerobic Ammonia Oxidation)為將氨氮(NH4+)及亞硝酸氮(NO2-)直接反應生成氮氣(N2)。此反應具有需添加碳源與曝氣、污產低等多優點。由於操作條件如反應槽上升速等對於系統效能有直接之影響，因此本研究設計厭氧氨氧化批次反應槽，控制同的污迴速，分別為0 ml/min、10 ml/min、100 ml/min，用可區分菌種活性之藥品Propidiummonoazide(PMA)和聚合酶鏈鎖反應-變性梯凝膠電泳(PCR-DGGE)等分子生物技術以及水質分析方法，探討同污迴速條件下
2、其系統具活性之厭氧氨氧化菌群結構變化和除氮效能間的關係。一、前言 由於市快速發展，使得部分工業廢水、家庭廢水未經適當處即排入天然水域中，導致環境中氨氮濃逐漸增加，可能會低水中溶氧及影響水質的安全衛生，進一步對原有的自然環境生態造成破壞，故近國內環保單位正討並草擬嚴格的放水標準以保護生態平衡。目前有許多研究以發展出多種去除含氮污染物的處程序，其中的生物處法仍是處含氨氮廢污水最經濟的方法之一。近研究發現，特殊的自營性微生物可於無氧環境下，用二氧化碳(CO2)作為碳源，將氨氮(NH4+)與亞硝酸根子(NO2-)反應直接轉化生成氮氣(N2)(Jettenet al.,2001)，此除氮機制即所謂的厭氧
3、氨氧化反應(Anaerobic AmmoniaOxidation,Anammox)，其化學方程式為NH4+NO2-N2+2H2O。此程序有別於一般傳統硝化結合脫硝程序系統，具有需添加碳源、污產低以及需額外曝氣節能源消耗等多優點；此外，其應用範圍廣泛，包含工業製程廢水、畜牧業廢水以及掩埋場滲出水等。近位學者用Ethidium monoazide(EMA)或Propidium monoazide(PMA)區分環境樣本的菌群存活與否，過去的研究中有學者針對EMA 與PMA進比較與探討，由結果發現EMA 對於活菌具有毒性但PMA 則否(Pan et al.,2007)；此外，PMA 對於生物膜的通透性
4、較佳，因此對於菌種的專一性較強(Nockeret al.,2006；Flekna et al.,2007；Cawthorn and Witthuhn,2008)。過去有學者用Propidium monoazide(PMA)藥品區分環境樣本中菌種之死活，並透過分子生物技術PCR-DGGE，探討微生物組成（Nocker et al.,2006）。但目前相關文獻鮮少探討具活性的厭氧氨氧化菌種之定性分析，因此無法釐清真正存活於系統中的厭氧氨氧化菌群，能建區分厭氧氨氧化菌種存活與否的分析方法，將有助於厭氧氨氧化系統穩定與功能提升。二、實驗材料與方法 1.樣本源 本研究取自於工業技術研究院所架設同污迴速之
5、厭氧氨氧化系統中污樣本。取適之污以10000rpm 心1 分鐘以收集污沉澱物(pellet)並去除上澄液，用1PBS 再懸浮並以10000rpm 心1 分鐘，重複上述步驟以清洗pellet。2.Propidium Monoazide(PMA)處 將PMA 溶於20%dimethyl sulfoxide，濃配置為20 mM，將2.5 L PMA加入500 L 的樣本並放置於暗處5 min，之後將樣本置於冰上並開啟650W 的鹵素燈照射樣本24 min，再以10000rpm 心2 分鐘(Nocker et al.,2009)。3.DNA 萃取及聚合酶鏈鎖反應 將樣本用商用試劑UltraCleanT
6、M Soil DNA Isolation Kit(Mo Bio,USA)進DNA 萃取。將萃取後之DNA 進PCR 增幅，本研究將使用之引子為針對厭氧氨氧化菌之PLA46f 及Amx368r 與針對氨氧化菌之amoA gene 引子對(1F vs2R)，其相關實驗條件如文獻所示(Neef et al.,1998；Schmid et al.,2003)以及(Rotthauwe et al.,1997)。將PCR 增幅後之產物，用1.5%之瓊脂膠明膠進電泳(Agarose gel)分析，再以Safe ViewerTM N u c l e i c A c i d S t a i n 染色 3 0 分
7、鐘並以紫外光顯 像。4.變性梯凝膠電泳分析及DNA 純化 本研究使用之DGGE 膠體為6%(wt/vol)acrylamide/bis，變性梯範圍為30%55%分析以PCR 所增幅針對Anammox 族群之產物。用變性梯凝膠電泳槽(Dcode gene System,Bio-Rad)，以80 伏特電壓及60 條件下進電泳12 小時，最後用Safe ViewerTM Nucleic Acid Stain 進核酸染色，並以紫外光顯像。PCR-DGGE 分析後，將膠體上相的帶分別下後置於無菌水中，經過凍-解凍過程獲取目標DNA 片段；並重複進PCR-DGGE 與膠純化的分析直至確定為單一帶為止。5.
8、水質分析 系統水質監測部份，由工研院每週監測進出水之NH4+-N、NO2-N、與NO3-N，其分析方式為用子層析儀（Ion Chromatography,IC，型號DioNEX-DX100，陰子分析管柱AS-4A，洗液為NaCO3 與NaHCO3；陽子分析管柱CS-15、洗液為H2SO4）。三、結果與討論 1.Propidium monoazide(PMA)與厭氧氨氧化族群之分析方法本研究先以系統污經過處(放置於100 水浴中30 min 並加入70%酒反應30 min)與未處後分別添加PMA 進測試，並以針對厭氧氨氧化菌之專一性引子對PLA46 和AMX368 分析系統中污樣本(如表1)，用
9、agarose gel確定產物長為377 bp(如圖1 所示)。由分析結果發現經馴化後的樣本有明顯帶，代表系統中確實存在厭氧氨氧化菌，並正確的增幅其目標片段。此外，由結果亦發現經過高溫與酒處後之馴養污添加PMA 後，其增幅之帶並未十分明顯，亦證明PMA 可與死亡菌種之DNA 結合，因此無法藉由PCR 增幅放大，故DGGE 圖譜中(圖2)帶並明顯，由此結果得知，PMA 方法確實可以用進厭氧氨氧化菌群之存活與否作判別。2.批次厭氧氨氧化系統菌相變化與除氮效能之分析本實驗原始污自於生物除氮系統馴養後之污，植種於低溶氧濃的UASB 反應槽，所使用之基質採氨氮與亞硝酸鹽以約一比一之濃進，添加額外碳源，以
10、三種同的污迴速馴養厭氧氨氧化菌，嘗試探討最佳的污迴速，作為提供日後實廠操作所需之重要。分別採集操作初期(反應槽操作56 天)、操作穩定(反應槽操作115 天)等同時期污樣本，以DGGE 進微生物族群分析，並探討菌相消長與系統中除氮效能間關係。(1)污迴速為0ml/min 當污迴速為0ml/min 時，系統中的氨氮與亞硝酸氮去除盡想。由批次水質實驗得知，進氨氮濃約為70 mg/L，經12 小時反應後，出濃僅去除至50 mg/L，去除約為30%；亞硝酸氮部分，進濃約為180 mg/L，出濃僅減低至150 mg/L，去除效約為20%；硝酸氮部分僅增加0.1 mg/L；而氮氣部分約增加44 ml(如圖
11、3)，此系統中氨氮及亞硝酸鹽去除佳，未有硝酸鹽的積，但有大的氮氣產生。污迴速為0ml/min 時之族群分析如圖4 所示，由結果中得知此時系統中存在厭氧氨氧化菌Candidatus Brocadia anammoxidans、Candidatus Brocadiasp.、Candidatus Kuenenia stuttgartiensis；此外，亦發現有氨氧化菌存在於系統中。系統中氨氮與亞硝酸鹽去除佳，推測可能因為厭氧氨氧化菌無法與基質充分混合均勻，導致部份菌群死亡，釋放至反應槽中COD 之濃高達97 mg/L，因此可能存在營脫硝菌與厭氧氨氧化菌競爭，消耗系統中的亞硝酸鹽與硝酸鹽，並增加氮氣的
12、產；此外，由於營菌生長快速，可能會取代厭氧氨氧化菌成為系統中的優勢菌種，導致除氮效果。因此未建厭氧氨氧化反應槽時，應定期監測系統中之碳氮比，避免造成營性微生物成為系統中的優勢菌種。(2)污迴速為10ml/min 當污迴速為10 ml/min 時，系統中的氨氮與亞硝酸氮去除十分好。由批次水質實驗得知，進氨氮濃約為60mg/L，出濃去除至0 mg/L，去除約為100%；亞硝酸氮部分，進濃約為120 mg/L，出濃僅減低至3 mg/L，去除效約為97%，而硝酸氮部分，增加約為30 mg/L；而氮氣部分約增加38 ml(如圖5)。此系統即可在12 小時內幾乎將氨氮與亞硝酸氮完全去除，除氮能十分好，且有
13、少硝酸氮之積與氮氣之產生，十分符合典型的厭氧氨氧化反應。污迴速為10ml/min 時之族群分析如圖6 所示，由結果中得知此時系統中存在厭氧氨氧化菌Candidatus Brocadia anammoxidans、Candidatus Brocadiasp.、Candidatus Kuenenia stuttgartiensis；此外，亦發現有氨氧化菌存在於系統中。此系統的除氮效極佳，推測系統中的厭氧氨氧化菌能充分與基質混合，並且保持污結構緊密，使氨氮與亞硝酸鹽的去除效最好，因此未實場操作厭氧氨氧化系統時，建議可採用較低的污迴速(如速為10 ml/min)，做為反應槽設計之一。(3)污迴速為10
14、0ml/min 當污迴速為100 ml/min 時，系統中的氨氮與亞硝酸氮去除較差。由批次水質實驗得知，進氨氮濃約為50 mg/L，經12 小時反應後，出濃去除至13 mg/L，去除約為74%；亞硝酸氮部分，進濃約為130 mg/L，出濃減低至45 mg/L，去除效約為 65%，而硝酸鹽氮部分，增加約為30mg/L；而氮氣部分約增加1 ml(如圖7)。氨氮與亞硝酸氮去除較低，積較多的硝酸鹽，但僅產生微的氮氣；此外，亦發現此系統中的ORP 均高於200 mV且溶氧均高於2 mg/L。而當系統操作120 天後水中pH 逐漸低於7 以下且積於系統的硝酸鹽濃大幅上升，因此在150 天換基質時於系統內沖
15、提氮氣，使ORP 小於50 mV 讓環境為無氧態，由水質據發現，系統中的氨氮與亞硝酸鹽幾乎沒有去除，且系統操作169 天後，由針對氨氧化菌的agarose gel 圖譜中(如圖8)發現，此時系統中的氨氧化菌喪失其活性。污迴速為100ml/min 時之族群分析如圖9 所示，由結果中得知此時系統中存在有厭氧氨氧化菌Candidatus Brocadia anammoxidans、CandidatusBrocadia sp.、Candidatus Kuenenia stuttgartiensis；此外，亦發現有氨氧化菌存在於系統中。過去文獻指出在高剪的環境下，會導致厭氧氨氧化顆污破碎，而造成厭氧氨氧
16、化菌活性低(Arrojo et al.,2008)，因此推測操作於高速的環境，可能會低厭氧氨氧化菌的活性；此外，系統中溶氧與ORP 過高將導致硝化菌大生長，可能取代厭氧氨氧化菌成為系統中的優勢菌種。因此未操作厭氧氨氧化系統，應避免速過快而造成厭氧氨氧化菌活性低之現象。表.圖.四、結論 1.污迴速為0 ml/min 時，推測厭氧氨氧化菌可能無法與基質充分混合，而導致部份菌群死亡，增加系統中COD 之濃，可能造成營菌與厭氧氨氧化菌競爭，影響整體的除氮效。2.污迴速為10 ml/min 時，推測厭氧氨氧化菌與基質均勻混合，並保持污結構緊密，使總氮去除十分好。3.污迴速為100 ml/min 時，推測操作於高速的環境，可能會低厭氧氨氧化菌的活性；此外，系統中溶氧與ORP 過高將導致硝化菌大生長，可能取代厭氧氨氧化菌成為系統中的優勢菌種。4.未操作厭氧氨氧化系統，應避免速過快而造成厭氧氨氧化菌活性低，建議可採用低迴速10 ml/min 作為反應槽設計之一；此外，應定期監測系統中碳氮比，避免營性微生物成為系統中優勢菌種。
