1、生物技术平台的两根支柱：细胞培养技术&单克隆抗体技术现代生物学的三大基石：进化论、遗传学&细胞学说多莉多莉克隆猴克隆猴我可以养细胞吗？阅读细胞培养相关理论及实验平台培训细胞种类及培养条件的确立参考文献，专业书籍及网站，询问他人，参考类似细胞的培养原代培养或购买细胞株，请有经验的老师指导操作 胆大心细一、基本理论知识一、基本理论知识二、组织培养设施和基本条件二、组织培养设施和基本条件三、培养用液三、培养用液四、污染、清洗与消毒四、污染、清洗与消毒五、细胞培养基本技术五、细胞培养基本技术六、细节问题六、细节问题第一章第一章细胞培养的基本理论知识细胞培养的基本理论知识组织（细胞）培养发展史年鉴166
2、5 Robert Hooke:用自制的显微镜观察软木薄片，首次发现植物的细胞结构，并借用了拉丁文cella（小室）一词。组织（细胞）培养发展史年鉴1838-39 Schleiden&schwann:确立了“细胞学说”的基本原则 *细胞是有机体，动植物都是由细胞发育而来的；*每个细胞都作为一个相对独立单位，有自己的“生命”*新的细胞可以由老的细胞繁殖产生 Matthias Schlieden Theodor Schwann (1804-1881)(1810-1882)组织（细胞）培养发展史年鉴组织和细胞培养的早期萌芽阶段组织和细胞培养的早期萌芽阶段1878 Claude Bernard:证明一个
3、器官的生理系统在个体死亡以后仍然可以人工维持。1885 Wilhelm Roux:在一个生理溶液中维持一块鸡胚的活性并观察其发育，第一个进行动物组织培养实验的人。1887 Arnold;1897 Loeb;1903 Jolly;1906 Beebe&Ewing:进行了细胞的体外培养。离体细胞的短期存活，无细胞增殖离体细胞的短期存活，无细胞增殖现代细胞培养的新纪元现代细胞培养的新纪元1907 Ross Harrison:利用凝固的青蛙淋巴液作为培养基，在体外培养青蛙神经嵴，维持其活性达数星期，观察到了神经纤维的生长，解决了神经纤维的来源问题。“细胞培养之父”。1910 Burrows:率先在血浆
4、凝块中长期培养鸡胚细胞。1911 Lewis:以海水、血清、胚胎提取物、盐和蛋白胨为原料配制成了第一个人工的细胞培养液，并观察到了单层细胞的有限生长。1916 Rous&Jones:开创用胰酶来收获贴壁生长的细胞。现代细胞培养的新纪元现代细胞培养的新纪元1912-1931 Carrel:为细胞的传代培养奠定了基础为细胞的传代培养奠定了基础 将无菌技术引入细胞培养 -在没有抗生素的情况下，使鸡胚心脏细胞维持34年，传代3400多次 研制T型培养瓶（Carrel flask）大规模培养细胞1927 Carrel&Rivera:制造了第一个病毒疫苗-牛痘疫苗。1933 Gey:发明了转管培养细胞的技
5、术。现代细胞培养的新纪元现代细胞培养的新纪元1948 Fisher:研制成了第一个化学成分清楚的细胞培养液CMRL1006。1952 Gey 和同事:分离培养了HeLa细胞。1952 Dulbecco:发明了噬斑法，用长满的单层细胞检测病毒。1954 Abercrombie:观察到了体外培养细胞接触抑制的现象。1961 Hatflick&Moorhead:发现人成纤维细胞在一定的代数之后会死亡。1965 Ham:配制了第一个无血清培养液。1975 Khler&Milstein:成功得到第一个用于单抗生产的杂交瘤细胞株。培养方法培养方法 单玻片悬滴培养法-双玻片悬滴培养法-旋转管培养法-灌注小室
6、培养法-单层培养法培养液培养液 天然培养基-人工合成培养基-无血清细胞培养基基本概念一、概 念动物细胞与组织培养（动物细胞与组织培养（cell and tissue culture）是动物细胞工程的重要技术基础。从活的机体中取出组织或细胞，模拟机体内生理条件，在体外建立无菌、适温和一定营养条件等，使之生长和生存，并维持其结构和功能的技术。组织培养组织培养组织培养这一名词实际上是一个通用名词，习惯上泛指所有的体外培养。根据培养物的不同可概括为三个不同概念：细胞培养、组织培养和器官培养。将活体的一小片组织放在盛有培养液的玻璃或塑料培养器皿中，待组织块粘着后，沿底面平面移动生长的过程。B、组织培养、
7、组织培养(tissue culture)将组织块用机械方法或酶解法分离成单个细胞，做成细胞悬液，再培养于固体基质上，成单层细胞生长，或在培养液中呈悬浮状态培养的技术。A、细胞培养、细胞培养(cell culture)C、器官培养、器官培养(organ culture)是指采取某些措施使器官的原基、器官的一部分或整个器官在体外存活、生长，并保持其原有结构和功能的培养技术。细胞培养细胞培养组织培养组织培养器官培养器官培养体外培养体外培养体外培养的种类体外培养的种类贴壁培养（贴壁培养（anchorage-dependent culture）细胞或培养物只有贴附于不起化学作用的物体（玻璃或塑料等无活性
8、物体）的表面时才能生长、生存或维持功能。不能表明细胞属于正常或恶性转化悬浮培养（悬浮培养（suspension culture）细胞或细胞聚集体悬浮于液体培养基中增殖的一种培养方式。淋巴细胞、血液肿瘤细胞等初代培养初代培养/原代培养（原代培养（primary culture）从直接取自生物体细胞、组织或器官开始的培养。初代培养物一旦进行传代培养后，就成为细胞系细胞系。通常10代以内的培养物用作原代培养。-有限细胞系（finite cell line）生存期有限的细胞系，不能继续传代或传代数有限(二倍体细胞)-连续细胞系或无限细胞系（infinite cell line）获无限繁殖能力能持续生存
9、的细胞系，能连续传代(异倍体细胞)传代培养（传代培养（sub-culture）不论是否稀释，在体外培养条件下，将细胞从一个培养器皿转移至另一培养器皿。细胞株（细胞株（cell strain）通过筛选或克隆化从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标志的细胞。这些特性（有一定的标记染色体、特殊的抗原性等）在以后的培养中必须持续存在。-有限细胞株（finite cell line）生存期有限的细胞株。不能继续传代或传代数有限 -连续细胞株或无限细胞株（infinite cell line）已获无限繁殖能力能持续生存的细胞株。能连续传代亚株（亚株（substrain）由原细胞株进一步分离培养出与原
10、株性状有一定不同的细胞群二倍体细胞系或株二倍体细胞系或株 细胞群染色体数目具有与原供体二倍体细胞染色体数相同或基本相同（2n细胞占75以上）的细胞群。在正常情况下具有限生命期，属有限细胞系。随供体年龄和组织来源的不同，寿命长短各异。-人胚肺成纤维细胞可传40-60代 -人胚肾细胞只有8-10代 -人胚神经胶质细胞15-30代 为保持二倍体细胞能长期被利用，一般在初代或2-5代即大量冻存作为原种（原种（stock cells），用时再进行繁殖，用后再继续冻存，可供长期使用或延缓细胞的衰老。假二倍体：假二倍体：仅数目相同，而核型不同，即染色体形态有改变者。遗传缺陷细胞系或株遗传缺陷细胞系或株 从有
11、先天遗传缺陷者取材（主要为成纤维细胞）培养的细胞，或用人工方法诱发突变的细胞，都属遗传缺陷细胞。这类细胞可能具有二倍体核型，也可呈异倍体。肿瘤细胞系或株肿瘤细胞系或株 是现有细胞系或细胞株中最多的一类，我国已建细胞系主要为这类细胞。肿瘤细胞系由癌瘤建成，多呈类上皮型细胞，常已传几十代或百代以上，并具有不死性不死性和异体接种致瘤性异体接种致瘤性。细胞凋亡（细胞凋亡（apoptosis）细胞内死亡程序的开启而导致细胞自杀的过程。与机体正常发育、形态形成、消除多余细胞等生理过程密切相关。主要形态特征为细胞皱缩、染色质聚集与周边化，以及凋亡小体的形成。ATCC（American type cultur
12、e collection）美国模式培养物收集中心/美国菌种保藏中心。除收集细菌、病毒外，还保藏有大量的细胞株（系）。体外转化（体外转化（in vitro transformation）细胞在体外培养过程中发生与原代细胞形态、抗原、增殖或其它特性的可遗传的变化，但不具有致瘤性。汇合（汇合（confluence）在瓶中培养的细胞彼此汇合形成单层。细胞融合（细胞融合（cell fusion）在体外培养条件下，经化学试剂（PEG）、病毒（灭活仙台病毒）或物理方法（电脉冲）诱发，使不同种的体细胞融合产生杂交细胞。细胞周期（细胞周期（cell cycle）细胞从前一次分裂结束开始至本次分裂结束所经历的时间
13、，分为间期和有丝分裂期（M期）两个阶段。间期又分为有丝分裂完成至DNA合成开始的间隙期（DNA合成前期/DNA复制期,G1期）、DNA合成期（S期）、DNA复制结束至有丝分裂开始的间隙期（DNA合成后期,G2期）Tc=G1+S+G2+M群体倍增时间（群体倍增时间（population doubling time）在对数生长期进行计算的细胞增加一倍所需的时间。细胞代时（细胞代时（cell generation time）单个细胞两次连续分裂的时间间隔。接触抑制（接触抑制（contact inhibition）当一个贴壁生长的体外正常细胞生长至与另一个细胞表面相互接触时，抑制了细胞的运动。接触抑制
14、是区别正常细胞和肿瘤细胞的标志之一密度抑制（密度抑制（density inhibition）细胞发生接触抑制后，只要营养充分，细胞仍然能够进行增殖，数量仍在增多。但当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，导致细胞分裂停止。Hayflick界限（界限（Hayflick life span）:脊椎动物成纤维细胞在体外培养条件下只能进行有限次的分裂群体密度（群体密度（population density）培养器皿内，每单位面积或体积中的细胞数，多用细胞数/cm2表示。饱和密度（饱和密度（saturation density）在特定条件下，培养皿内能
15、达到的最高细胞数，当细胞达到饱和密度后细胞群体停止繁殖。贴壁培养：细胞数/cm2 悬浮培养：细胞数/cm3分子生物学分子生物学生物工程生物工程临床诊断临床诊断和治疗和治疗生物制品生物制品药物开发药物开发二、二、细胞培养的现实意义细胞培养的现实意义分离提取研究基因导入研究原位检测研究染色体工程染色体组工程细胞质工程细胞融合工程单克隆抗体病毒疫苗生长因子免疫调节剂酶细胞克隆 药物筛选模型1.1.研究的对象是活细胞研究的对象是活细胞 在实验过程中，根据要求可始终保持细胞活力，并可长时间监控、检测甚至定量评估一部分活细胞的情况，包括活细胞的形态、结构、生命活动等。三、细胞培养的优点三、细胞培养的优点2
16、.2.研究条件可以人为控制研究条件可以人为控制 可以根据需要，控制包括pH、温度、氧气、二氧化碳、张力等物理化学的条件，同时，可以施加化学、物理、生物等因素作为条件而进行实验观察，这些因素同样可以处于严格控制之下。3.3.研究的样本可以达到比较均一性研究的样本可以达到比较均一性 通过细胞培养一定代数后，所得到的细胞系则可以达到均一性而属于同一类型的细胞，需要时，可采用克隆化等方法使细胞达到纯化。三、细胞培养的优点三、细胞培养的优点4.4.研究内容便于观察、检测和记录研究内容便于观察、检测和记录 研究:倒置生物显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、流 式细胞术、激光共焦显微镜、免疫组织化学、原 位杂交
17、、同位素标记。记录:摄影照片、缩时电影、电视。5.5.研究的范围比较广泛研究的范围比较广泛 学科多：细胞学、免疫学、肿瘤学、生物化学、遗传学、分子生物学等 对象广：各种动物：低等动物-高等动物-人类 一种动物：不同年龄-不同组织：正常或异常（肿瘤-）三、细胞培养的优点三、细胞培养的优点6.6.研究的费用相对较经济研究的费用相对较经济可提供大量、同一时期、重复性好的、生物学性状相似的实验对象 人工所模拟的条件与体内实际情况仍不完全相同。当细胞被置于体外培养后，生活在缺乏动态平衡的环境中久了，必然发生变化。1.与体内主要不同 相对孤立、单一 缺乏体内的系统作用、失去神经体液的调节和细胞相互间的影响
18、 2.主要表现 失去原有组织结构和细胞形态 分化减弱或不明显,细胞趋向单一化四、细胞培养的缺点四、细胞培养的缺点对于体外培养的细胞，应该把他们视作一种对于体外培养的细胞，应该把他们视作一种既既能保持动物体内原细胞一定的性状、结构和功能保持动物体内原细胞一定的性状、结构和功能能又具有某些改变的、特定的细胞群体又具有某些改变的、特定的细胞群体，而不，而不能将之与体内的细胞完全等同。能将之与体内的细胞完全等同。五、体内外细胞的差异和分化五、体内外细胞的差异和分化体内细胞体内细胞机体神经体液调节和其他类型细胞影响基因表达受到外来信号调节增殖过程中不断发生着分化（由一般到特殊）高度特化的结构和功能体外细
19、胞体外细胞失去机体神经体液调节和其他类型细胞影响细胞的许多外来信号被切断特定分化基因表达减弱或停止而进化中保守的增殖活动维持（由特殊到一般）与体内细胞结构和功能的差异失去原有形态，分化特性减弱；形态功能趋于单一；一定代数后衰老死亡或发生转化，获不死性而成为能无限传代培养细胞的分化培养细胞的分化 1不适应不适应(Deadaption)细胞在原体内时所拥有的分化特性减弱或不显肝细胞产生酪氨酸转移酶(Tyrosine Aminotranserase)特性的丧失2脱分化或去分化脱分化或去分化(Dedifferentiation)细胞也可能出现脱分化或去分化，即细胞失掉发生分化的能力。培养物的 生长生物
20、学一、体外细胞培养物的生长类型 按生长方式按生长方式粘附型细胞上皮细胞型上皮细胞型成纤维细胞型成纤维细胞型游走细胞型 多型细胞型各种实体瘤细胞悬浮型细胞造血系统肿瘤细胞（一）贴附（一）贴附(粘附粘附)型细胞型细胞 粘附：大多数有机体细胞在体内生存和生长发育的基本存在方式含义：细胞与细胞间接触，细胞与细胞外基质结合。结果：细胞与细胞之间相互结合形成组织，使细胞与其周围环境间始终保持联系，使有机体内几乎不存在“自由”的细胞。培养时：这些细胞被放到体外环境中以后，同样需要粘附于某一固相表面才能生存和生长，属于粘附型细胞。+细胞的贴附过程细胞的贴附过程贴附物质带正电荷贴附物质带正电荷细胞带负电荷细胞带
21、负电荷(1)(1)上皮型细胞上皮型细胞(2)(2)成纤维型细胞成纤维型细胞(3)3)游走型细胞游走型细胞(4)(4)多形型细胞多形型细胞1234成纤维细胞：梭形、三角形、成纤维细胞：梭形、三角形、2-3个突起个突起上皮细胞：扁平、多角形、圆核上皮细胞：扁平、多角形、圆核可连成单层可连成单层细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。生长时呈膜状移动，处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少单独行动。起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝、胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态。来源：来源于外胚层，内胚层细胞 如：皮肤及其衍生物，乳腺外胚层 消化道，呼吸道上皮内胚层 内皮
22、中胚层 上皮性肿瘤形态：类似体内的上皮细胞，但不完全相同上皮细胞型上皮细胞型 易相连成片相靠紧密相连成薄层铺石状生长时呈膜状移动很少脱离细胞群而单个活动上皮细胞型上皮细胞型生长特点生长特点成纤维细胞型 名称：名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的来源：来源：由中胚层间充质组织起源的组织 如：真正的成纤维细胞 心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮形态：形态：似体内成纤维细胞的形态，梭形或不规则三角形，胞质向外伸出23个长短不等的突起，中有卵圆形核。排列成放射状，漩涡状 不紧靠连成片，细胞与细胞接触易断开而单独行动 游离的单独的成纤维样细胞，常有几个伸长的细胞突起成纤维细胞型成纤维细胞型生长特点生长特
23、点体外培养的大鼠主动脉平滑肌细胞体外培养的大鼠主动脉平滑肌细胞游走型细胞游走型细胞 经常处于较活跃的变形及游走状态，速度快且不规则。外形不规则且不断变化，细胞质常伸出伪足或突起。当细胞密度增大相互连接成片时，游走受限，形状上类似上皮型细胞或成纤维细胞型的细胞。表现这种形态的细胞主要是具有吞噬作用的单核巨噬细胞系统的细胞，如颗粒性白细胞、淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、肝枯否细胞(Kupffer cell)以及某些肿瘤细胞等。脑脊液淋巴细胞和单核细胞脑脊液淋巴细胞和单核细胞monocytelymphocyteRaw264.7小鼠腹腔巨噬细胞多形型细胞多形型细胞 多形型细胞是一些形态上不规则的细胞，
24、不规则形态由宽扁的胞质突起所致。其细胞一般分胞体和胞突两部分。胞突为细长形，似丝状伪足。胞体虽略呈多角形，但没有成纤维细胞型那样不规则。体外培养中呈现多形型的细胞最常见的类型是神经元和神经胶质细胞。人神经元和星形胶质细胞人神经元和星形胶质细胞培养细胞形态不稳定培养细胞形态不稳定血清血清Hela高血清高血清低血清低血清成纤维细胞样 上皮样细胞pHHela太酸或太碱太酸或太碱 标准标准pH成纤维细胞样上皮样细胞细胞密度细胞密度 3T3低密度低密度高密度高密度成纤维细胞样上皮样细胞生长状态改变生长状态改变悬浮悬浮贴附贴附圆形成纤维或上皮样转化与否转化与否未转化未转化转化转化成纤维样上皮样（二）悬浮生
25、长型（二）悬浮生长型概念概念 培养时不贴附于基质而呈悬浮状态生长，或以培养时不贴附于基质而呈悬浮状态生长，或以机械方法使保持悬浮状态下生长机械方法使保持悬浮状态下生长来源来源 自血，脾或骨髓，尤其血中白细胞，癌肿细胞自血，脾或骨髓，尤其血中白细胞，癌肿细胞也可能也可能特点特点 在悬浮中生长良好，细胞圆形，单个或小细胞在悬浮中生长良好，细胞圆形，单个或小细胞团团THP-1K562优点优点 生存空间大，生存空间大，提供数量多提供数量多 传代方便传代方便 (不需消化不需消化)易于收获易于收获 可获得稳定状态可获得稳定状态缺点缺点 观察不方便观察不方便 很多细胞不能很多细胞不能悬浮生长悬浮生长 (尤其
26、正常细胞尤其正常细胞)培养细胞随贴附支持物形状不同而形态各异，最常见的是贴附于平面支持物细胞。在一般光镜下生存的细胞是均质而透明的，结构不明显。细胞在生长期常有1-2个核仁。在细胞机能状态不良时，细胞轮廓会增强，反差增大。若胞质中时而出现颗粒、脱滴和腔泡等，表明细胞代谢不良二、培养细胞的生长和增殖过程二、培养细胞的生长和增殖过程分裂增殖和生长发育是体外培养细胞的两大生命特征增殖能力一般与该种细胞在体内的增殖能力相仿）单个细胞的生长过程：）单个细胞的生长过程：Tc 原代培养期原代培养期）培养细胞的生长过程）培养细胞的生长过程传代期传代期衰退期衰退期DNA合成细胞分裂（一）组织培养细胞生命期一）组
27、织培养细胞生命期 (Life Span of Culture Cells)原代培养期 传代培养期 衰退期有限细胞系无限细胞系 体外培养细胞的整个生命活动过程分期体外培养细胞的整个生命活动过程分期1、原代培养期、原代培养期(Primary Culture stage)也称初代培养，即从体内取出组织、器官，经过粉碎、消化，接种培养到第一次传代阶段，一般持续1-4周。特点特点：细胞呈活跃移动，可见细胞分裂，但不旺盛，多呈二倍体核型。与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大，是检测药物很好的实验对象。细胞群是异质的，各细胞的遗传性状互不相同，细胞相互依赖性强。原代培养细胞来源肾小管上皮细胞淋巴细胞鸡
28、胚细胞2、传代期、传代期(passage stage)特点特点：在全生命期中此期的持续时间最长，细胞增殖旺盛，维持二倍体核型，增殖能力有限（50）具有明显的贴壁依赖和接触抑制特点无致瘤性原代培养细胞经过传代、筛选、克隆，从多种细胞成原代培养细胞经过传代、筛选、克隆，从多种细胞成分的组织中挑选并纯化出具有一定特征的细胞株，建分的组织中挑选并纯化出具有一定特征的细胞株，建立细胞系。立细胞系。传代传代：当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代。原代培养传代培养原代培养传代培养镜下观察镜下观察选取生长良好的细胞选取生长良好的细胞加入胰蛋白酶
29、消化液加入胰蛋白酶消化液倒去酶液，加入培养液倒去酶液，加入培养液反复吹打制成细胞悬液反复吹打制成细胞悬液按比例分装后培养按比例分装后培养3、衰退期、衰退期(decline stage)细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡3、转化细胞系、转化细胞系(transformation cell line)核型多变为异倍体失去正常细胞贴壁依赖性和接触抑制的特点细胞倍增时间较短，获得无限增殖能力（永生性）或恶性性质对培养条件和生长因子等要求较低，适合大规模工业化生产的需要自发转化：啮齿动物人工转化：采用某些病毒(SV40)或化学试剂(甲基胆蒽)直接从动物的肿瘤组织中建立的细胞系（
30、二）体外培养细胞一代生存期（二）体外培养细胞一代生存期细胞传代数（细胞传代数（passage number）：）：从细胞接种到分离再培养时的次数细胞倍增代数（细胞倍增代数（generation number）：）：细胞分裂的次数游离期贴壁期潜伏期对数生长期停止期（平台期）游离期：游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态，也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。细胞株10 min-4 h；原代细胞10-24 h甚至更长。潜伏期：潜伏期：此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6-24 h，原代细胞为24-96 h。贴壁期：贴壁期：细胞附着于底物上，游离期 结束。底物：胶原、玻璃、塑料
31、、其他细胞等血清中有促进细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），带正电荷。进口塑料培养瓶壁涂有生长基质（化学合成的功能基因）对数生长期：对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，细胞数量呈指数增长，细胞群体均一。最适合进行实验研究。细胞分裂指数细胞分裂指数 1000个细胞中分裂细胞所占的百分比，用来表示细胞分裂相数量。是判定细胞生长旺盛与否的重要标志。一般细胞2-5，肿瘤细胞30-50。停止期（平台期）：停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂。继而培养液中营养逐渐耗尽、代谢产物积累、pH降低等导致细胞中毒，发生形态改变甚至脱落死亡。应尽早传代a.贴附b.
32、接触抑制c.密度抑制培养细胞的生长特点培养细胞的生长特点（三）培养细胞生长测定是肿瘤体外研究中应用最广的技术手段之一。由死细胞和活细胞组成，从形态上区别死、活细胞是困难的。方法：细胞计数法 台盼蓝染色法 生长曲线法 四唑盐（MTT）比色法 3H-胸腺嘧啶核苷渗入法 5-溴脱氧尿嘧啶核苷渗入法细胞计数法细胞计数法用血细胞计数板计数细胞悬液中的细胞数目，以测定细胞增殖和调整细胞浓度用细胞计数法测定细胞生长动力学是目前采用的最普遍的方法。血细胞计数板人工计数 细胞计数器 血细胞计数板：常用的是改良的纽巴氏(Neubauer)血细胞计数板。细胞计数细胞计数实验原理实验原理：血球计数盘一般有二个室(ch
33、amber)，每个室中细刻9 个1 mm2 大正方形，其中4 个角落之正方形再细刻16 个小格，深度均为0.1 mm。当室上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1 mm20.1 mm=1.010-4 ml。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml 中之细胞数目。存活测试为利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。具体操作程序如下：具体操作程序如下：1、取血细胞计数板和盖玻片，用75%酒精擦净。将盖玻片放于计数板上。2、用滴管取混合均匀的细胞悬液，滴入计数室内。要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽
34、中。滴加细胞悬液后约静置1分钟后则可以进行计数。3、统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，分别数出四角的四个大格（每个大格含有16个中格）中的细胞数。对压边线细胞：计上不计下，计左不计右计算：一般以计算：一般以每毫升含细胞数每毫升含细胞数来表示来表示 大方格的面积为1 mm2，室深为0.1 mm，则体积为0.1 mm3。推算得0.1 mm3104，才为1 ml体积。所以计算公式为：细胞悬液的细胞数）/ml（四个大格子细胞数/4)稀释倍数 104/ml注意：镜下偶见有两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬
35、液如果细胞悬液的细胞浓度过高，必须稀释后再计；如果细胞数太少低于104/ml,可离心浓缩后再计。每个细胞悬液至少滴样两次求平均值。细胞群体中有一些因各种原因而死亡的细胞，活细胞所占总细胞的百分比叫做细胞活力。由于死细胞的细胞膜通透性发生改变，某些染料可大量进入却不被排出，因而细胞呈色。而活细胞反之，能排出进入细胞内的染料，因而不易着色。此法的原理即是利用死、活细胞对染料的不同反应而区分开两种细胞。台盼蓝染细胞时，时间不宜过长（约2 min）。台盼蓝排除检测法台盼蓝排除检测法 将1滴细胞悬液(贴壁细胞可经0.25胰蛋白酶溶液消化后，吹打制成细胞悬液)与2滴台盼蓝液混合染色5-15 min，滴入细
36、胞计数板。在显微镜下计数至少500个细胞。未着色的为活细胞，呈蓝色的为死细胞。计算活细胞百分比。活体染色与细胞计数活体染色与细胞计数细胞生长曲线的绘制细胞生长曲线的绘制 细胞生长曲线(cell growth curve)是观测细胞在一代生存期内的增生过程的重要指标可根据细胞生长曲线分析细胞增殖速度，确定细胞传代、细胞冻存或具体实验的最佳时间。它以培养时间为横坐标、细胞密度为纵坐标作坐标图。1)培养细胞 首先在2孔培养板内分别接种相同数量的细胞。计数并记录接种的细胞悬液之密度。接种时间记为0 h。2)计数细胞密度 从接种时间算起，每隔24 h计数孔内的细胞密度，算出平均值。为提高准确率，对每孔细
37、胞可计数2-3次。如此操作至第七天结束。l 3)绘制曲线 以培养时间为横坐标、细胞浓度 （104/ml）为纵坐标，将全部结果在坐标纸上绘图，即得所培养细胞的生长曲线。四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝原理：活细胞中琥珀酸脱氢酶能将四唑盐还原成不溶于水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比，用酶标仪测定OD570nm值。可反映活细胞的代谢水平MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒性试验、肿瘤放射敏感性实验等。四唑盐（四唑盐（MTTMTT）比色法）比色法操作步骤
38、操作步骤四唑盐（四唑盐（MTTMTT）比色法）比色法100 L单细胞悬液接种于96孔板(5104)。37、5CO2培养箱中培养一段时间加入2 mg/ml的MTT液（50 L/孔）；继续培养3 h。吸出孔内培养液后，加入DMSO液（150 L/孔），将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10 min，使结晶物溶解。酶标仪检测各孔OD值（检测波长570 nm）。记录结果。结果分析结果分析 细胞存活率细胞存活率=注意事项注意事项高浓度血清可影响光吸收值,常使用含10%血清的培养液,在加入异丙醇溶液或DMSO前尽量吸净培养液。吸去培养液时动作要慢,以免吸去形成的结晶。实验组光吸收值实验组光吸收值对照组光吸收值
39、对照组光吸收值100%3 3H-H-胸腺嘧啶核苷渗入法胸腺嘧啶核苷渗入法 将用3H标记的胸腺嘧啶脱氧核苷渗入到新和成的DNA中，通过测定3H放射性脉冲比较不同细胞的增殖活性5-5-溴脱氧尿嘧啶核苷溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)(BrdU)渗入法渗入法 BrdU是DNA前体胸腺嘧啶核苷类似物，通过竞争渗入S期细胞单链DNA核苷酸序列替代胸腺嘧啶。BrdU被渗入到DNA复制位点，这些位点可被荧光剂或酶偶联的抗体检测。三、培养细胞的生存条件三、培养细胞的生存条件培养皿培养皿培养瓶培养瓶 温度、湿度温度、湿度和气体和气体由CO2恒温孵育箱提供 生长培养液生长培养液1020的血清 维持培养液维持培养液25
40、的血清 营养物质营养物质糖、氨基酸、维生素、无机离子、微量元素等 1.细胞的营养需要细胞的营养需要基本营养物质：基本营养物质：氨基酸（氨基酸（12种谷氨酰胺）种谷氨酰胺）维生素维生素 葡萄糖、核糖、脱氧核糖等葡萄糖、核糖、脱氧核糖等 无机离子无机离子促生长因子、激素、血清等物质促生长因子、激素、血清等物质2.细胞的生存环境细胞的生存环境温度:适宜的温度与取材的动物种类有关气相及pH:一般气体环境为95%空气加5%CO2的混合气体。pH7.2-7.4。CO2为细胞生长所需要，同时又是细胞代谢的产物，并与维持培养基的pH有关，CO2增加将使pH下降。CO2+H2O H2CO3 H+HCO3-渗透压
41、：因细胞的类型及种族而异。由于人类血浆的渗透压约为290 mmol/L，因此认为这是体外培养人类细胞的理想渗透压。无无 毒毒：无毒是培养细胞的必需条件。凡与细胞 直接或间接接触的东西都必须是无毒的。无污染无污染不同细胞类型的交叉污染微生物的污染细菌霉菌支原体等3.无污染及无毒无污染及无毒 对已建成的各种细胞系或细胞株习惯上都给以名称；细胞的命名无严格统一规定，大多采用有一定意义缩写字或代号表示。但不论什么形式，均不宜太长，以便记忆和了解 HeLa：为供体患者的性名(来源于宫颈癌)CHO：中国地鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary)宫743：宫颈癌上皮细胞，1974年3月建立
42、NIH3T3；美国国立卫生研究所(National Institute of Health)建立,每3天传代一次，每次接种3106 cell/ml。细胞系或细胞株的命名细胞系或细胞株的命名已建立细胞系或株的签定、管理和使用已建立细胞系或株的签定、管理和使用培培 养养 简简 历：历：组织来源日期、物种、组织起源、性别、年龄、供体正常或异常健康状态、细胞已传代数等。冻冻 存存 液：液：培养基和防冻液名称。细细 胞胞 活活 力：力：融解前后细胞接种存活率和生长特性。培培 养养 液：液：培养基种类和名称(一般要求不含抗生素)，血 清来源和含量。ATCC（American type culture co
43、llection）入库细胞要）入库细胞要求检测项目如下：求检测项目如下：已建立细胞系或株的签定、管理和使用已建立细胞系或株的签定、管理和使用细细 胞胞 形形 态：态：类型，如为上皮或成纤维细胞等。核核 型：型：二倍体或多倍体，标记染色体的有无。无污染测验：无污染测验：包括细菌、真菌、支原体、原虫和病毒等。物物 种种 检检 测：测：检测同功酶，主要为G6PD和LDH，以证明细 胞有否交叉污染。免免 疫疫 检检 测：测：一两种血清学检测。细胞建立细胞建立 者：者：建立者性名；检测者姓名。有标准化的工作方法 培养用的液体极多（如培养液、胰蛋白酶、HANKS液及 抗菌素等），应由专人负责，并保证做到按规程行事，配制浓度准确，灭菌可靠，所有配好的溶液瓶上都要标 明名称、浓度、消毒与否和制备日期等。一切培养用品都要有固定的存放点，避免杂乱无章，其中尤其重要的是：培养用品与非培养用品应严格分 开，已消毒品与未消毒品应分别存放。细胞培养的工作原则细胞培养的工作原则
