1、WATERS液相色谱教程三四七液相色谱教程三四七(最全最全)开启开启HPLC系统系统各个设备的电源各个设备的电源打开泵、自动进样器、检测器电源，待设打开泵、自动进样器、检测器电源，待设备通过自检后，打开计算机，启动色谱管备通过自检后，打开计算机，启动色谱管理软件理软件准备流动相准备流动相过滤过滤,脱气脱气色谱泵排气色谱泵排气用新配制的流动相灌注泵用新配制的流动相灌注泵用准备好的流动相平衡色谱系统用准备好的流动相平衡色谱系统可在泵的控制面板上设定流速参数可在泵的控制面板上设定流速参数(15(155 5泵需在软件泵需在软件控制下操作控制下操作)系统大约需平衡系统大约需平衡0.5-10.5-1小时方
2、能稳定工作小时方能稳定工作准备样品准备样品用流动相溶样或重组样品用流动相溶样或重组样品编制仪器方法编制仪器方法,开始实验开始实验色谱柱对流动相的要求色谱柱对流动相的要求 过滤除去微粒过滤除去微粒 纯度的要求纯度的要求超纯水，或用超纯水，或用KMnO4处理过的双蒸水处理过的双蒸水有机溶剂：色谱纯有机溶剂：色谱纯(溶剂中的杂质含量尽可能低溶剂中的杂质含量尽可能低)，并与填料相匹配并与填料相匹配 缓冲液的缓冲液的pH值，在填料的允许范围值，在填料的允许范围(一般在一般在pH2-8)2-8)内内 缓冲液（盐）的浓度不要太高缓冲液（盐）的浓度不要太高(100mM)流动相对样品的溶解度流动相对样品的溶解度
3、调整有机溶剂和水的比例调整有机溶剂和水的比例最好用流动相溶样最好用流动相溶样液相色谱仪器对流动相的要求液相色谱仪器对流动相的要求 与检测器匹配与检测器匹配脱气脱气避免用含卤素离子的缓冲盐（不锈钢系统）避免用含卤素离子的缓冲盐（不锈钢系统）溶剂的粘度溶剂的粘度防止细菌的生长防止细菌的生长流动相脱气的目的流动相脱气的目的 使色谱泵的输液准确使色谱泵的输液准确输液量均匀准确，并且脉动减小输液量均匀准确，并且脉动减小保留时间及色谱峰面积的重现性提高保留时间及色谱峰面积的重现性提高 提高检测的性能提高检测的性能防止气泡引起的尖峰防止气泡引起的尖峰基线稳定，信噪比增加基线稳定，信噪比增加溶剂的紫外吸收本底
4、降低溶剂的紫外吸收本底降低 保护色谱柱保护色谱柱减少死体积减少死体积防止填料的氧化防止填料的氧化加热加热简单，如同抽真空一起使用，其效果很好。但容易简单，如同抽真空一起使用，其效果很好。但容易造成流动相组成的变化造成流动相组成的变化抽真空抽真空同上，一般在溶剂抽滤的同时，也有脱气的效果同上，一般在溶剂抽滤的同时，也有脱气的效果超声波振荡超声波振荡简单，但效果不够理想；超声时间不要太长简单，但效果不够理想；超声时间不要太长(1分钟分钟左右即可左右即可)通惰性气体（一般用氦气）通惰性气体（一般用氦气）可保持在线连续脱气，多用于低压梯度可保持在线连续脱气，多用于低压梯度在线脱气机在线脱气机（in-l
5、ine degasser)可保持连续脱气，多用于低压梯度可保持连续脱气，多用于低压梯度有机溶剂流动相有机溶剂流动相:室温下密封室温下密封,避光保存避光保存缓冲盐流动相缓冲盐流动相:当日现配现用当日现配现用低温下密封保存低温下密封保存,一般不超过一般不超过3 3天天防止微生物生长防止微生物生长有机溶剂与水（缓冲盐）混配的流动相有机溶剂与水（缓冲盐）混配的流动相:低温密封保存低温密封保存防止有机相的挥发防止有机相的挥发选用适宜的容器选用适宜的容器2 星期1 天1 星期1 小时新鲜配制5101520250分测试条件测试条件水样水样:40ml trace enrichment 2.0 ml/min色谱
6、柱色谱柱:C18 反相柱反相柱(Waters)梯度梯度:线性线性 100%水水 100%乙腈乙腈波长波长:254 nm1 天1星期新鲜配制5101520250分测试条件测试条件水样水样:40ml trace enrichment 2.0 ml/min色谱柱色谱柱:C18 反相柱反相柱(Waters)梯度梯度:线性线性 100%水水 100%乙腈乙腈波长波长:254 nm色谱泵实验前，应先确认泵头内没有气体，如有色谱泵实验前，应先确认泵头内没有气体，如有气体要按以下步骤排气：气体要按以下步骤排气：将泵入口管吸滤头放入脱过气的流动相中将泵入口管吸滤头放入脱过气的流动相中打开泵及在线脱气机电源开关打
7、开泵及在线脱气机电源开关将排液阀打开，或断开与色谱柱连接的管路将排液阀打开，或断开与色谱柱连接的管路设置流速到设置流速到6-9ml/min,排液阀出口有液流连续流出排液阀出口有液流连续流出必要时必要时(600(600泵泵)用用10ml注射器从泵入口注入流动相注射器从泵入口注入流动相对于对于600,2695600,2695四元梯度泵四元梯度泵,分别对所用各路溶剂进行分别对所用各路溶剂进行排气操作排气操作 停止泵流速停止泵流速,关闭排液阀关闭排液阀,恢复断开的管路恢复断开的管路,备用备用注注:泵排气后泵排气后,应输液稳定应输液稳定(系统压力脉动小系统压力脉动小,一般在几十一般在几十 Psi Psi
8、以内以内),),否则否则,需重做排气操作需重做排气操作电源开关电源开关柱塞杆清洗孔柱塞杆清洗孔排液阀排液阀Waters 600泵的前面板泵的前面板柱塞杆柱塞杆清洗孔清洗孔电源开关电源开关排液阀排液阀泵控制器泵控制器泵体泵体泵灌注阀泵灌注阀溶剂瓶盘溶剂瓶盘注射器箱门注射器箱门柱温箱柱温箱溶剂配比单元溶剂配比单元进入门进入门检测器接液盘检测器接液盘前面板显示前面板显示屏和键盘屏和键盘 软盘驱动器软盘驱动器样品室门样品室门溶剂输送单溶剂输送单元进入门元进入门2695排气操作示意图排气操作示意图面板操作面板操作:打开状态打开状态(Statas)画面画面 按右下角按右下角Direct Function功
9、能键功能键选选 Dry Pime或或 Wet Prime命令命令选选OK 即可进行泵的排气即可进行泵的排气注注:当流路中充满空气时当流路中充满空气时,按图示做按图示做Dry Prime若只是更新流动相时若只是更新流动相时,只须作只须作Wet Prime关于色谱系统的反压关于色谱系统的反压什么是反压什么是反压(back pressure)流动相流经管路及色谱柱时会有阻力流动相流经管路及色谱柱时会有阻力,即所谓的反压即所谓的反压,又称系统反压或系统压力又称系统反压或系统压力Waters习惯用的压力单位是习惯用的压力单位是Psi(磅磅/平方英吋平方英吋)其它单位有其它单位有:Bar,Mpa影响系统反
10、压的主要因素影响系统反压的主要因素:流动相的溶剂组成流动相的溶剂组成温度温度流速流速反压与溶剂组成的关系反压与溶剂组成的关系Pressure vs.Organic-Water Percentage02004006008001000120014001600020406080100Percent Organic SolventpsiMeOHACN流动相的粘度是产生反压的主要原因流动相的粘度是产生反压的主要原因有机溶剂水的粘度随组成而改变有机溶剂水的粘度随组成而改变其压力随组成变化如下图所示其压力随组成变化如下图所示反压与流速的关系反压与流速的关系流速对反压的影响是线性关系流速对反压的影响是线性关系
11、流速增加，反压亦增大流速增加，反压亦增大 下图的实验条件：下图的实验条件：2.130mm Symmetry C18柱柱,20Pressure vs.Flow Rate at 20 C05001000150020002500300035004000450050000.00.20.40.60.81.01.2mL/minpsi50%MeOH50%ACN100%H2O100%MeOH100%ACN反压与温度的关系反压与温度的关系温度对反压的影响是反比关系温度对反压的影响是反比关系温度升高温度升高,反压降低反压降低,对某些流动相的影响更大一些对某些流动相的影响更大一些 Pressure vs.Tempe
12、rature050010001500200025003000350040004500500010.020.030.040.050.060.070.0Degrees,Cpsi50%MeOH50%ACN100%H2O100%MeOH100%ACN影响系统反压的其它因素影响系统反压的其它因素反压与色谱柱长度成正比反压与色谱柱长度成正比反压与填料颗粒度的平方成反比反压与填料颗粒度的平方成反比2.5m2.5m填料比填料比3.5m3.5m填料反压高填料反压高反压与管路直径的四次方成反比反压与管路直径的四次方成反比(1/D(1/D4 4)反压与管路的长度成正比反压与管路的长度成正比排气后的色谱泵即可用于实验
13、运行排气后的色谱泵即可用于实验运行 注意注意排气后，先设流速为排气后，先设流速为 0 0恢复排气时断开的部分，如恢复排气时断开的部分，如:进样器、色谱柱进样器、色谱柱如需要，恢复排气时断开的控制线如需要，恢复排气时断开的控制线根据色谱柱的不同，逐渐提高流速到设定值根据色谱柱的不同，逐渐提高流速到设定值若使用缓冲盐流动相若使用缓冲盐流动相,用前和用后均需用水过渡用前和用后均需用水过渡(包括排气操作包括排气操作)流动相要过滤流动相要过滤常用缓冲液时，停泵前要用水清洗泵头，并用水常用缓冲液时，停泵前要用水清洗泵头，并用水冲洗柱塞杆清洗孔冲洗柱塞杆清洗孔关闭排液阀时，不要太用力拧紧，以不渗液为准关闭排
14、液阀时，不要太用力拧紧，以不渗液为准更换流动相时，要保证两种溶剂的互溶性更换流动相时，要保证两种溶剂的互溶性,如不如不互溶，要用一种中间溶剂过渡互溶，要用一种中间溶剂过渡色谱泵在停用时色谱泵在停用时,应先用水洗去缓冲盐应先用水洗去缓冲盐,然后用纯然后用纯甲醇充满泵头及管路甲醇充满泵头及管路,并保存在纯甲醇中并保存在纯甲醇中 色谱泵吸滤头色谱泵吸滤头,进出口阀及管路进出口阀及管路(包括进样器和检包括进样器和检测池测池)若被污染若被污染,应作清洗和钝化处理应作清洗和钝化处理一般采用一般采用30磷酸水溶液作为清洗剂，用磷酸水溶液作为清洗剂，用6M硝酸硝酸作为钝化剂，先清洗再钝化作为钝化剂，先清洗再钝
15、化清洗的目的是去除不锈钢管路及系统内的污垢清洗的目的是去除不锈钢管路及系统内的污垢钝化的目的是使不锈钢管路的内表面形成光滑均钝化的目的是使不锈钢管路的内表面形成光滑均匀的氧化膜匀的氧化膜清洗液用清洗液用30%磷酸水溶液磷酸水溶液30%磷酸配制磷酸配制:取取85%浓磷酸浓磷酸35ml与与65ml水混匀水混匀清洗步骤如下清洗步骤如下:取下色谱柱，用两通取下色谱柱，用两通(Union)连接进样器和检测器连接进样器和检测器 用纯水灌注泵头用纯水灌注泵头(四元泵的四元泵的A,B,C,D四路各为四路各为25%)用用30%磷酸清洗液洗系统磷酸清洗液洗系统(1ml/min流速流速)45分钟分钟 (四元泵的四元
16、泵的A,B,C,D四路各为四路各为25%)换成清水洗至出口水换成清水洗至出口水pH显显中性中性 用纯甲醇过渡，浸润泵头及管路，备用用纯甲醇过渡，浸润泵头及管路，备用钝化液用钝化液用6M硝酸水溶液硝酸水溶液6M硝酸的配制硝酸的配制:取浓硝酸取浓硝酸40ml与与60ml水混匀水混匀钝化步骤如下钝化步骤如下:在清洗步骤完成后进行钝化处理在清洗步骤完成后进行钝化处理 确认清洗用的磷酸已基本洗净确认清洗用的磷酸已基本洗净 用纯水灌注泵头用纯水灌注泵头(四元泵的四元泵的A,B,C,D四路各为四路各为25%)用用6M硝酸水溶硝酸水溶液钝化系统液钝化系统(1ml/min流速流速)45分钟分钟 换成清水洗至出口
17、水换成清水洗至出口水pH显显中性中性 用纯甲醇过渡，浸润泵头及管路，备用用纯甲醇过渡，浸润泵头及管路，备用标样和样品标样和样品 标样标样:又称对照品又称对照品,它作为液相色谱定性和定量分析的参它作为液相色谱定性和定量分析的参 考标准物考标准物,一般是纯度较高的纯物质一般是纯度较高的纯物质 样品样品:待测物待测物,一般是成分复杂的混合物一般是成分复杂的混合物液相色谱对样品液相色谱对样品(包括标样包括标样)制备的要求制备的要求:必须能溶于流动相必须能溶于流动相如样品的溶剂不是流动相如样品的溶剂不是流动相,一定要用流动相试溶解度一定要用流动相试溶解度,以免在进以免在进样时样品在流动相中析出样时样品在
18、流动相中析出,堵塞管路和色谱柱堵塞管路和色谱柱 样品溶液要过滤除去微粒及杂质样品溶液要过滤除去微粒及杂质了解样品对色谱柱的基质了解样品对色谱柱的基质/填料是否有破坏作用填料是否有破坏作用样品预处理的目的样品预处理的目的除去微粒除去微粒减少干扰杂质减少干扰杂质浓缩微量的组份浓缩微量的组份提高检测的灵敏度及选择性提高检测的灵敏度及选择性改善分离的效果改善分离的效果有利于保护色谱柱及仪器有利于保护色谱柱及仪器是影响实验成败的决定性步骤是影响实验成败的决定性步骤占样品分析时间的比例最大占样品分析时间的比例最大 样品预处理所用时间远多于色谱分离的时间样品预处理所用时间远多于色谱分离的时间占分析消耗总成本
19、的比重最大占分析消耗总成本的比重最大 消耗大量的溶剂及其它化学品消耗大量的溶剂及其它化学品对分析结果的重现性及准确性影响最大的环节对分析结果的重现性及准确性影响最大的环节影响实验结果好坏的最重要因素影响实验结果好坏的最重要因素高速离心取上清液高速离心取上清液过滤、超滤过滤、超滤选择性沉淀选择性沉淀衍生反应衍生反应液液-液萃取液萃取固相提取固相提取(Solid Phase Extract,SPE)Oasis 和和Sep-Pak固相提取小柱固相提取小柱其它其它过滤过滤过滤膜过滤膜/过滤装置过滤装置有机滤膜有机滤膜(0.5 m)/水溶性滤膜水溶性滤膜(0.45 m)膜片可更换膜片可更换一次性使用的膜
20、一次性使用的膜“Cartridge”使用方便简单，交叉污染小使用方便简单，交叉污染小有更小内径，可用于微量样品的处理有更小内径，可用于微量样品的处理高速离心高速离心大于：大于：10,000rpm机理机理 超滤是一种基于分子量分离的技术超滤是一种基于分子量分离的技术目的目的根据分子量的不同把分子、细胞及病毒等分为根据分子量的不同把分子、细胞及病毒等分为不同的馏份不同的馏份除去小分子样品中的大分子蛋白除去小分子样品中的大分子蛋白脱盐脱盐常用于生化样品中除蛋白常用于生化样品中除蛋白有机溶剂有机溶剂乙腈，甲醇乙腈，甲醇强酸强酸三氯乙酸，高氯酸三氯乙酸，高氯酸盐盐50%硫酸铵硫酸铵10%TCA(三氯乙酸
21、钠三氯乙酸钠)提高检测的灵敏度提高检测的灵敏度 增加紫外基团以增强紫外检测的灵敏度增加紫外基团以增强紫外检测的灵敏度 增加荧光基团以便使用高灵敏度荧光检测器增加荧光基团以便使用高灵敏度荧光检测器改变分离的选择性改变分离的选择性改变组份的基团，如：改变组份的基团，如：变离子型化合物为非离子型，用反相方法分离变离子型化合物为非离子型，用反相方法分离典型的例子典型的例子柱前衍生氨基酸分析柱前衍生氨基酸分析NNOHOONO+NOR1R2HNNOOOHNH20NH2NOOOHN+AQC衍生试剂及氨基酸衍生后的氨基酸CO2N-羟基琥珀酰亚胺N-羟基琥珀酰亚胺半衰期1秒半衰期约15秒6-氨基喹啉目的：富集微
22、量或痕量组份目的：富集微量或痕量组份浓缩样品的方法浓缩样品的方法 萃取萃取/吹干吹干 沉淀沉淀/再溶解再溶解 色谱法色谱法 固相提取固相提取 Oasis 小柱小柱 Sep-Pak小柱小柱Oasis HLB固相提取小柱固相提取小柱 亲亲水水-亲亲脂脂平衡共聚物平衡共聚物“亲水亲水”使填料具有水可浸润性质使填料具有水可浸润性质降低与水的接触角降低与水的接触角“亲脂亲脂”提供对被分析物质的反提供对被分析物质的反相保留能力相保留能力NO亲水性单体亲水性单体 N-乙烯基吡咯烷酮乙烯基吡咯烷酮亲脂性单体亲脂性单体 二乙烯基苯二乙烯基苯活化/平衡1ml 甲醇甲醇/1ml 水水上样多至多至 200 ml 样品
23、样品冲洗废弃物1ml 5%甲醇甲醇/水溶液水溶液洗脱想要的化合物1ml 甲醇甲醇挥发溶剂并重新定容制备样品这是适合于分析众这是适合于分析众多基质中大多数样品的多基质中大多数样品的通用操作步骤通用操作步骤建议首先使用这种建议首先使用这种通用的操作步骤通用的操作步骤如果需要进一步降如果需要进一步降低干扰物的影响，可使低干扰物的影响，可使用用二维二维SPE方法方法注注:此 方 法 于 规 格 为此 方 法 于 规 格 为3cc,60mg的的OasisHLB 小柱上开发小柱上开发SPE处理处理的效果的效果进样器的种类进样器的种类:手动进样器手动进样器7725i 自动进样器自动进样器717Plus，26
24、95样品管理系统样品管理系统进样器与系统的连接：进样器与系统的连接：进样器的入口与色谱泵的出口相连进样器的入口与色谱泵的出口相连 进样器的出口与色谱柱的入口相连进样器的出口与色谱柱的入口相连 要求：出入口方向不能接错，接头不能留有空隙要求：出入口方向不能接错，接头不能留有空隙进样器的连接管路：进样器的连接管路：出口管路一定要用细管出口管路一定要用细管(内径内径0.009),0.009),长度要短长度要短,尽量减少谱带扩展尽量减少谱带扩展 7725i手动进样器的进样方式手动进样器的进样方式:固定体积进样固定体积进样:进样量取决于进样量取决于Loop的体积的体积 可变体积进样可变体积进样:进样量由
25、微量注射器量取进样量由微量注射器量取注意注意:固定体积进样需要用超过固定体积进样需要用超过Loop体积体积5-10倍的样品量倍的样品量进样进样,以保证进样浓度不被稀释以保证进样浓度不被稀释 可变体积进样在注射器注入样品后可变体积进样在注射器注入样品后,应尽快将进样器应尽快将进样器扳至扳至Inject位置位置,以避免样品在以避免样品在Loop中的扩散中的扩散进样器的清洗进样器的清洗:每次进样前应将微量注射器清洗干净每次进样前应将微量注射器清洗干净,防止样品间交防止样品间交叉污染叉污染,影响实验结果影响实验结果自动进样器自动进样器(717Plus和和2695样品管理系统样品管理系统):样品瓶位置和
26、进样量由软件设定样品瓶位置和进样量由软件设定注意注意:样品瓶中应有超过样品瓶中应有超过13瓶高度的样品量瓶高度的样品量 使用内衬管使用内衬管(Insert)时应设定针高度为时应设定针高度为2mm(2695)或或 75%高度高度(717Plus)进样器的清洗进样器的清洗:进样针是流路的组成部分进样针是流路的组成部分,运行中一直由流动相清洗运行中一直由流动相清洗 进样针外部由软件控制在每次进样前用洗针液清洗进样针外部由软件控制在每次进样前用洗针液清洗 若注射器内出现气泡若注射器内出现气泡，用面板操作的用面板操作的Purge Inject功功能清除之能清除之注意注意洗针溶剂瓶洗针溶剂瓶(内放绿色塑料
27、管内放绿色塑料管)不要放在仪器的上部，应不要放在仪器的上部，应放于与仪器同一水平面的实验台上放于与仪器同一水平面的实验台上流动相洗针溶剂缓冲溶液，反相50%水 50%甲醇纯缓冲溶液100%水非水溶液，反相100%甲醇正相流动相GPC流动相离子交换对离子试剂的水溶液洗针溶剂根据流动相的不同应有不同：洗针溶剂根据流动相的不同应有不同：连通流路：连通流路：色谱柱出口接检测器入口色谱柱出口接检测器入口注意接头不要留有空隙注意接头不要留有空隙连接管路要用细管连接管路要用细管(0.009)检测器出口用适当的管路检测器出口用适当的管路(内径内径,长度长度)通向废液瓶通向废液瓶连通数据线路连通数据线路:IEE
28、E 电缆电缆(对大多数检测器对大多数检测器)与软件与软件busLAC/E卡连接卡连接手动进样器的启动信号线与检测器背板上的手动进样器的启动信号线与检测器背板上的Inject Start 接口连接接口连接开启电源开关后开启电源开关后,需待检测器通过自检后需待检测器通过自检后,才能被软件控制才能被软件控制(约需约需5-10分钟分钟)通流动相平衡至少通流动相平衡至少30分钟后才能正常工作分钟后才能正常工作通道通道吸光度吸光度灯开灯开/关关波长波长灵敏度灵敏度下一画面下一画面运行时间运行时间(分分)自控自控/遥控遥控诊断开诊断开/关关键盘锁开键盘锁开/关关单单/双波长双波长Shift 开开/关关AUF
29、S(Absorbance Unit Full Scale):满量程吸光度单位满量程吸光度单位回车键回车键分屏显示键分屏显示键选项移动键选项移动键主屏幕主屏幕方法调用，方法调用，A/B通道切换通道切换设置及诊断设置及诊断单单/双波长，双波长，自动调零自动调零运行运行/停止键停止键第二功能键第二功能键监视色谱图监视色谱图屏幕对比度屏幕对比度Waters 2996 PDA 检测器检测器PDA(PhotoDiode Array):光电二极管矩阵光电二极管矩阵由软件设定检测器参数由软件设定检测器参数只需设定如下只需设定如下参数即可采集参数即可采集数据数据波长范围波长范围分辨率分辨率每秒采集的每秒采集的光
30、谱数光谱数操作极为简便操作极为简便不需费神选择不需费神选择参比波长及其参比波长及其带宽带宽Waters 2414示差折光检测器示差折光检测器冲洗参比池冲洗参比池折射率折射率极性极性RIU量程量程检测器温度检测器温度下一画面下一画面运行时间运行时间(分分)自控自控/遥控遥控键盘锁开键盘锁开/关关模式模式Shift回车键回车键屏幕对比度屏幕对比度选项移动键选项移动键主屏幕主屏幕方法调用，方法调用，温度设置温度设置自动调零自动调零运行运行/停止键停止键第二功能键第二功能键监视色谱图监视色谱图冲洗参比池冲洗参比池设置及诊断设置及诊断下一页下一页设定检测器内、外设定检测器内、外(如有柱温箱如有柱温箱)温
31、度温度以以5ml/min的流速的流速“purge”参比池五分钟参比池五分钟不接色谱柱！不接色谱柱！参数设置按文献值或实验决定参数设置按文献值或实验决定至少需要至少需要2小时以上的平衡时间小时以上的平衡时间通常检测器可以在白天结束工作后不关机，保持通常检测器可以在白天结束工作后不关机，保持0.1到到0.5ml/min的流速循环冲洗样品池和参比池的流速循环冲洗样品池和参比池,可节省第二天的平衡时间可节省第二天的平衡时间不能做梯度实验不能做梯度实验最大的池耐压是最大的池耐压是 100 psi 注意保持出口管路的畅通注意保持出口管路的畅通流速范围是流速范围是 0.1-10 ml/min 此种类型检测器
32、是压力敏感和温度敏感型检测器此种类型检测器是压力敏感和温度敏感型检测器 注意保持泵压力的平稳注意保持泵压力的平稳 注意环境温度的恒定注意环境温度的恒定Waters 2475荧光检测器荧光检测器可调波长荧光检测器可调波长荧光检测器双扫描双扫描在扫描模式下在扫描模式下(Scan)发射波长及激发波长均可扫描发射波长及激发波长均可扫描高灵敏度高灵敏度 水的水的RAMAN峰峰S/N大于大于200可编程可编程 时间时间-波长波长 时间时间-增益增益由由RS232串行口或网线与计算机相连串行口或网线与计算机相连发射发射/能量能量灯开灯开/关关下一页下一页运行时间运行时间(分分)面板面板/软件控制软件控制键盘
33、锁键盘锁/开开Shift开开/关关单单/多波长多波长通道选择通道选择增益增益波长波长诊断键开诊断键开/关关灵敏度灵敏度回车键回车键分屏显示键分屏显示键选项移动键选项移动键主屏幕主屏幕方法调用，方法调用，通道切换通道切换设置诊断设置诊断自动调零自动调零运行运行/停止键停止键第二功能键第二功能键监视色谱图监视色谱图开关灯开关灯屏幕亮度调节屏幕亮度调节光谱扫描光谱扫描扫描功能扫描功能 由面板功能执行由面板功能执行 Empower 英文版亦能由软英文版亦能由软件执行件执行不是所有化合物都有荧光，有时需要衍生不是所有化合物都有荧光，有时需要衍生检测器对溶解气体及其它检测器对溶解气体及其它“淬灭淬灭”物质
34、物质(如甲醇如甲醇)敏感敏感,流动相最好能在线脱气流动相最好能在线脱气对对ExEx及及EmEm的最佳的最佳，易受温度、溶剂极性和粘度、，易受温度、溶剂极性和粘度、pHpH及样品浓度影响及样品浓度影响检测池的耐压较低检测池的耐压较低,注意出口管路要畅通注意出口管路要畅通设置的发射波长至少要比激发波长高设置的发射波长至少要比激发波长高10nmMinutesColumn-Waters PAH Column,27 CEluent A:WaterEluent B:AcetonitrileGradient:60%B to 100%B usingcurve 9 in 12 minutesHold 11 mi
35、nutesBack to initial conditionsFlow Rate 1.2 ml/minInjection:20ulTime programmedwavelength changes20.521.022.01000 MV脱气脱气未脱气未脱气Breeze with Fluorescence1231.Benzo(b)flouranthene 400 ppb2.Benzo(k)fluoranthene-200 ppb3.Benzo(a)pyrene-200 ppb发射发射 激发激发 103 M105 M在庚烷中在庚烷中如长时间不用检测器可以关掉光源灯如长时间不用检测器可以关掉光源灯(U
36、V,FL)(UV,FL)仅在仅在4 4小时以上不用时小时以上不用时,才需关灯才需关灯频繁开关灯也会影响灯寿命频繁开关灯也会影响灯寿命不要让缓冲液长期停滞在检测池内不要让缓冲液长期停滞在检测池内用纯水冲洗用纯水冲洗保存在纯甲醇中保存在纯甲醇中示差检测器及荧光检测器若与其它检测器串联使用示差检测器及荧光检测器若与其它检测器串联使用,应将此两种检测器串在其它检测器的后面应将此两种检测器串在其它检测器的后面不用检测器的液晶显示屏时，应将其亮度调暗不用检测器的液晶显示屏时，应将其亮度调暗Waters 中国有限公司中国有限公司培训中心培训中心反相色谱柱的选择反相色谱柱的选择Waters 中国有限公司中国有
37、限公司培训中心培训中心从色谱方法上分从色谱方法上分正相正相/反相反相离子交换离子交换分子体积排除分子体积排除亲合亲合疏水回受疏水回受从柱子类型上分从柱子类型上分分配分配/吸附吸附离子交换离子交换凝胶凝胶亲合亲合合适的选择性合适的选择性满足不同的分离要求满足不同的分离要求良好的色谱峰形良好的色谱峰形重现性重现性宽应用范围宽应用范围色谱实验结果揭示：色谱实验结果揭示：疏水性不同疏水性不同残留硅羟基活性不同残留硅羟基活性不同为什么？为什么？不同不同 C18配体键合水平（状况）配体键合水平（状况）配体覆盖率配体覆盖率不同硅胶颗粒基质不同硅胶颗粒基质密度，表面积，孔径密度，表面积，孔径纯度纯度不同色谱柱
38、不同色谱柱“品牌名称品牌名称”表示不同的硅胶基质表示不同的硅胶基质Waters Symmetry C18Waters Nova-Pak C18相同的相同的“品牌名称品牌名称”,不同的配体表示相同的不同的配体表示相同的硅胶基质，键合相不同硅胶基质，键合相不同Waters Symmetry C18Waters Symmetry C8注意注意：由于：由于硅羟基硅羟基的影响，许多情况下硅胶基质对的影响，许多情况下硅胶基质对 整个键合相的性能起决定作用整个键合相的性能起决定作用Minutes04812162024YMC-Pack Pro C18YMC-Pack Pro C4二氢苊二氢苊萘萘对羟基苯甲酸丁
39、酯对羟基苯甲酸丁酯提示提示:相似的选择性归因于相同的硅相似的选择性归因于相同的硅 胶基质胶基质(同一品牌同一品牌,不同键合相不同键合相)分分45678910YMC-Pack ODS-AQYMC-Pack Pro C18 酮洛芬酮洛芬痛灭定痛灭定萘普生萘普生舒洛芬舒洛芬舒洛芬舒洛芬 萘普生萘普生酮洛芬和痛灭定酮洛芬和痛灭定注意注意:由于硅胶颗粒基质不同由于硅胶颗粒基质不同(品牌不同品牌不同),分离的分离的选择性选择性不同不同01020304050用于浸润固定相的甲醇水溶液的比例用于浸润固定相的甲醇水溶液的比例%020406080100在在1 mL/min流速下的流速下的 浸润率浸润率%注意注意：
40、需要有机溶剂来保证反相填料有合适的湿度需要有机溶剂来保证反相填料有合适的湿度,反之停流速后易出现反之停流速后易出现“疏水塌陷疏水塌陷”问题问题未湿润的孔湿润的孔注意：注意：保留时间与填料表面积与配体有关。然而，如果硅胶表面未湿润，保留时间与填料表面积与配体有关。然而，如果硅胶表面未湿润，那么有效的色谱表面积会减少那么有效的色谱表面积会减少95%95%，因此，因此，减少被分析物的保留减少被分析物的保留时间即等于时间即等于“疏水塌陷疏水塌陷”，记住：记住：几乎所有的表面积都在孔内几乎所有的表面积都在孔内！低比例有机溶剂或低比例有机溶剂或纯水溶液流动相纯水溶液流动相C18 硅胶硅胶分分0246810
41、流动相：流动相：0.1%醋酸水溶液醋酸水溶液阿莫西林阿莫西林Vo：被分析物没有保留：被分析物没有保留“湿润时湿润时”“去湿后去湿后”停流速后停流速后(孔去湿孔去湿:3%)流动相：流动相：0.1%醋酸水溶液醋酸水溶液Minutes0246810 初始时初始时保留时间无变化保留时间无变化阿莫西林阿莫西林内嵌极性基团键合相：内嵌极性基团键合相：使用高比例水溶液流动相时色谱性能稳定使用高比例水溶液流动相时色谱性能稳定 OSiCH3CH3PolarGroup内嵌极性基团配体OSiCH3CH3传统直链烷基配体SiCCCOCN(CH2)7CH3H3COOHCH3SiOOOOSiOOOOHH-极性基团增加了填
42、料表层水的浓度极性基团增加了填料表层水的浓度降低碱性物质的保留降低碱性物质的保留减少了拖尾减少了拖尾改善与水的浸润性改善与水的浸润性屏蔽了带负屏蔽了带负电的硅羟基电的硅羟基水水“屏蔽屏蔽”层层降低了碱性化合物的保留降低了碱性化合物的保留降低了拖尾现象降低了拖尾现象屏蔽了带负屏蔽了带负电的硅羟基电的硅羟基CH3NH3CH+SymmetryShield RP18Tf USP=1.1分分0102030阿米替林阿米替林Symmetry C18Tf USP=1.9注意：对碱性化合物而言，可以减少保留时间并且改善色谱峰形注意：对碱性化合物而言，可以减少保留时间并且改善色谱峰形内置极性基团的配体与直链烷烃配
43、体的比较内置极性基团的配体与直链烷烃配体的比较注注:使用相同的流动相使用相同的流动相SymmetryShield RP8Symmetry C80102030-0.00200.0020.0040.0060.0080.010102030-0.00200.0020.0040.0060.0080.01minutesminutes呋喃唑酮呋喃唑酮(痢特灵痢特灵)杂质分析杂质分析色谱柱选择性比较表色谱柱选择性比较表(ln k 二氢苊二氢苊)Hypersil BDS C18Symmetry C18Inertsil ODS-2Inertsil ODS-3Kromasil C18YMC-Pack Pro C18
44、YMC-Pack ODSAQNova-Pak C18Hypersil ODSYMC Jsphere ODSH80YMC Jsphere ODSM80Nucleosil C18Bondapak C18YMC Jsphere ODSL80Waters Spherisorb ODS1Resolve C18Waters Spherisorb ODS2-0.20.30.81.31.82.32.811.522.533.5疏水性增加疏水性增加硅羟基活性硅羟基活性降低降低(ln a 阿米替林阿米替林/二氢苊二氢苊)选择性变化选择性变化合适的选择性合适的选择性良好的色谱峰形良好的色谱峰形定量精度、灵敏度与分离度
45、定量精度、灵敏度与分离度重现性重现性宽应用范围宽应用范围USP 拖尾因子（拖尾因子（Tailing Factor）:Tf 不对称因子不对称因子(Assymmetry Factor):Asab峰高之峰高之5%处处abab)(a2+更准确与精确的定量结果更准确与精确的定量结果纯度分析纯度分析稳定性分析稳定性分析 更高的灵敏度更高的灵敏度 更好的检出限与定量限（更好的检出限与定量限（LOD 和和LOQ）对低浓度杂质有更强的检测能力对低浓度杂质有更强的检测能力更好的分离度更好的分离度更有利于相邻色谱峰的分离更有利于相邻色谱峰的分离99.6%99.8%99.9%峰面积回收率峰面积回收率T=1.00Wat
46、ers21,37992.3%95.3%97.8%T=1.58峰面积回收率峰面积回收率 他莫昔芬他莫昔芬0.25 g/mL信噪比信噪比11.06.5AUSymmetry C18AU5.0010.00MinutesConventional C18Rs=(t 峰峰 2 t峰峰 1)/0.5(w4.4%峰峰1+w4.4%峰峰2)=(11.5-10.6)/0.5(2.0+0.5)=0.72Minutes0510152025提示提示:基线分离的分离度基线分离的分离度 =1.51.二羟基丙酮二羟基丙酮2.心得安心得安(T=1.0)3.二氢苊二氢苊4.阿米替林阿米替林(T=1.6)1.二羟基丙酮二羟基丙酮2.
47、心得安心得安(T=5.7)3.二氢苊二氢苊4.阿米替林阿米替林(T=7.0)Alltima C8 Symmetry C8建立高效液相色谱柱的新标准，开创新一代高品建立高效液相色谱柱的新标准，开创新一代高品质色谱柱质色谱柱全新的标准：全新的标准：在很宽的在很宽的pHpH范围下，对酸、碱及中性化合物均范围下，对酸、碱及中性化合物均有非常好的色谱峰形有非常好的色谱峰形极高的批间重现性极高的批间重现性独特的选择性独特的选择性良好的柱寿命良好的柱寿命合适的选择性合适的选择性良好的色谱峰形良好的色谱峰形重现性重现性色谱柱间重现性色谱柱间重现性批次间重现性批次间重现性宽应用范围宽应用范围重现性是液相色谱分析
48、的基本要求重现性是液相色谱分析的基本要求缺乏重现性是用户最担心的问题缺乏重现性是用户最担心的问题加快方法验证加快方法验证(Validation)的速度的速度更容易传递方法更容易传递方法色谱系统之间以及实验室之间色谱系统之间以及实验室之间确保长期符合认证及系统适应性等要求确保长期符合认证及系统适应性等要求 更容易符合法规要求更容易符合法规要求同一批次合成的填料同一批次合成的填料色谱柱之间的重现性色谱柱之间的重现性柱床填充质量控制柱床填充质量控制塔板数塔板数色谱峰对称性色谱峰对称性反压反压无选择性差异无选择性差异不同批次合成的填料不同批次合成的填料色谱柱批次间重现性色谱柱批次间重现性颗粒的物理性质
49、颗粒的物理性质表面之化学性质表面之化学性质不同产品批号间的差别最低，充分满足各种不同产品批号间的差别最低，充分满足各种严格的严格的cGMP要求要求孔径孔径RSD=3%渗透性渗透性RSD=2%特征表面积特征表面积RSD=2%平均颗粒度平均颗粒度RSD=2%-0.20.30.81.31.82.32.811.522.533.54(l n k acenapht hene)(l n a am i t ri pt yl i ne/acenapht hene)Symmetry C18品牌 B品牌 C Symmetry C18 45 批批紫杉醇中的不纯物分析紫杉醇中的不纯物分析:三批色谱柱所得色谱重叠图三批色
50、谱柱所得色谱重叠图色谱柱色谱柱:Symmetry C8 3.5 m(4.6 x 100 mm)8 流速流速:1.8 mL/min流动相流动相:甲醇甲醇/乙腈乙腈/水水 9:34:57检测波长检测波长:UV 230nm样品样品:25 L of 1 mg/mL 紫杉醇紫杉醇0.0010.0020.0030.00Minutes 优异的色谱峰形优异的色谱峰形无可比拟的重现性无可比拟的重现性所认证的方法置信度高所认证的方法置信度高容易达到法规要求容易达到法规要求认证方法的长期稳定性认证方法的长期稳定性有利于长期符合法规要求有利于长期符合法规要求合适的选择性合适的选择性良好的色谱峰形良好的色谱峰形重现性重
