1、分子诊断技术平台的进展及展望分子诊断技术平台的进展及展望内内 容容 病原体检测技术概述病原体检测技术概述 病原体核酸检测技术概述病原体核酸检测技术概述 病原体核酸检测新技术应用病原体核酸检测新技术应用 核酸检测新技术存在问题及发展核酸检测新技术存在问题及发展治治 疗疗 近近1010年新发传染病绝大多数是病毒引起年新发传染病绝大多数是病毒引起病毒与亚病毒6819种408属动物病毒1917种204属感染人296种37属背景背景病毒分离培养血清学鉴定PCR 和DNA测序NGS测序背景检测技术概述 形态学（电镜）形态学（电镜）组织学（细胞培养）组织学（细胞培养）免疫学（免疫学（ELISA,Wester
2、n Blot,ELISA,Western Blot,IF,NT,HI IF,NT,HI）分子生物学（分子生物学（PCR,RT-PCR,qPCR,mPCR,PCR,RT-PCR,qPCR,mPCR,Microarray,Sequencing Microarray,Sequencing）传统检测方法的局限性传统检测方法的局限性 胶体金胶体金 （灵敏度（灵敏度 窗口期）窗口期）ELISA ELISA （灵敏度（灵敏度 窗口期）窗口期）PCR/RT-PCR PCR/RT-PCR （通量（通量 未知病原）未知病原）Real-time PCR Real-time PCR（通量（通量 未知病原未知病原)巣式
3、巣式PCR/RT-PCR (PCR/RT-PCR (污染，电泳）污染，电泳）核酸扩增检测技术概述核酸扩增检测技术概述 核酸扩增技术是一种常规生物技术，是分子生物学的基础研究方法。核酸扩增技术是一种常规生物技术，是分子生物学的基础研究方法。作为主流检测技术被广泛应用于实验室、医院。作为主流检测技术被广泛应用于实验室、医院。核酸扩增技术可分为核酸扩增技术可分为变温扩增技术变温扩增技术和和等温扩增技术等温扩增技术。变变 温温 扩扩 增增PCRPCRRealtimeRealtime PCR PCRRT PCRRT PCRNested PCRNested PCRMultiplex PCRMultiple
4、x PCRDigital PCRDigital PCR等等 温温 扩扩 增增TMA/NASBATMA/NASBASMARTSMARTHDAHDASDA/NDASDA/NDARCA/MDARCA/MDALAMPLAMP/基于基于T7 PromoterT7 Promoter基于解旋酶基于解旋酶基于链置换活性的基于链置换活性的DNA DNA 聚合酶聚合酶链置换和重组酶链置换和重组酶核酸检测新技术核酸检测新技术 LAMP/IMSA/RPA LAMP/IMSA/RPA Multiplex PCR Multiplex PCR Nested PCR(Nested PCR(一步法）一步法）Digital PC
5、R Digital PCR 自动化检测自动化检测 再测序芯片再测序芯片 PCR PCR 阵列阵列 二代测序（二代测序（NGSNGS）POCT POCT（现场检测）（现场检测）核酸检测技术发展趋势 未知病原 多病原 高通量 自动化 现场技术(POCT)中中 心心 实实 验验 室室 科科 研研 方方 向向 简简 介介 未知病原检测技术平台 高通量自动化工作站技术平台 多病原、症候群检测技术平台 现场检测技术平台4123u 现场检测技术 -LAMP,IMSAu 多病原检/监测技术 -GeXP,Qiaxcel,RPMu 未知病原鉴定未知病原鉴定 -NGS，VIDISCA,RPM u 自动化检测-Liq
6、uid handling systemu 生物信息学支持-VIP软件 检测检测/监测监测/鉴定鉴定技术平台定位功能实际应用相关英文文章（中文文章略）未知病原鉴定国家级技 术 服务 和 支撑T e m b u s u V i r u s i n ducks,China,Echo 33Echo33J.Virol.2012,86(6):3406Emerging Infect Dis,2011.17(10):1873Archive virology,2014，DOI 10.1007自动化检测 国家级技 术 服务 和 支撑全国分子和血清学流行病学调查，大规模SNP分析J.Infection 2011，6
7、2(1):107BMC Infect Dis,2010，10:178Inflam.Bowel Dis 2011,1 7(12):2472PLOS One,2013,8(1):e55197多病原检测/监测省级高 通 量检 测 和症 候 群监测呼吸道(9+7)，手足口，流感，腹泻，HPV分型，SNP，耐药,转基因，脑炎J Virol Met.168(2010)255258Adv.in Virology 2011:129134J.Clin.Microbiol 2012,50(2):288J.Med Virol.2012,84:957J.Clin.Microbiol.2012,50(7)：2384BM
8、C Infect Dis,2012,12:189BMC Microbiology 2013,13:58PLOS One,2013(accepted)现场检测地市级现 场 初步筛查手足口，H1N1H1N1，H7N9H7N9流感流感，诺如病毒,HPV，HIV，HCV,MERS,EbolaJ Virol Met 2010,167(2),214J Virol Met 2011,175:283J.Clin.Microbiol 2011,49(10）3545PLOS One,2012,7(12):e52486Adv.in Infect Dis,2012,2,110-118 生物信息学软件DS2，VIP 国
9、家级技 术 服务 和 支撑表位分析，抗原抗体相互作用J Virol Met 181(2012)182 187 Biomed Environ Sci,2012;25(1):98-103 病毒检测病毒检测/监测监测/签定技术平台及生物信息学签定技术平台及生物信息学 核酸检测新技术核酸检测新技术 LAMP/Multiplex PCR Nested PCR(一步法）Digital PCR 自动化检测 再测序芯片 PCR 阵列 二代测序（NGS）POCT（现场检测）LAMPLAMP技术特点技术特点u 特异性强特异性强:2:2对引物配对对引物配对6 6个区域或个区域或3 3对引物配对对引物配对8 8个区域
10、个区域u 灵敏度高：灵敏度高：10-100 copies10-100 copiesu 设备要求低设备要求低:不需要不需要PCRPCR仪器，仪器，65 65 水浴（等温）水浴（等温）u 检测快速：检测快速：1 1小时小时u 操作简单：操作简单：一步法（单管）一步法（单管）u 结果判定方便：颜色（肉眼观察颜色变化和沉淀）结果判定方便：颜色（肉眼观察颜色变化和沉淀）吸光值（半定量，吸光值（半定量，650nm650nm比色）比色）普通琼脂糖电泳普通琼脂糖电泳 浊度（浊度仪，实时监测，半定量）浊度（浊度仪，实时监测，半定量）实时荧光定量PCR仪2小时水浴、热块、PCR仪、浊度仪电泳、浊度、颜色指示剂、肉
11、眼观察1小时25￥/Reaction仪器要求实验结果反应时间实验成本Realtime PCR 与 LAMPLAMP 特点比较Realtime PCRLAMPVS实时荧光定量PCR仪50￥/ReactionLAMP 结 果 分 析肉 眼 观 测焦磷酸镁沉淀DNA显色剂Mg2+显色剂仪 器 检 测凝胶电泳实时浊度仪病原体检测LAMP扩 展J Virol Met 2010,167(2),214H1N1J Virol Met 2011,175:283Advances in Infect.Dis.2012EV71CA16J Clin.Microbiol 2011,49(10):3545HPVNorVPL
12、OS One 2012,7(12)direct LAMP定量 HIVIMSA/EV71/CA16 JCM,2014,52（6):1862MERS(submitted)Gene,2014,541,123-128Food and enviromental virology,2014GEAR/HRVClin Microbiol Infect.2013H7N9submitted 内容：LAMP检测技术应用于手足口病例的现场评价 合作单位：湖南、山东、河北省CDC 标本数量：手足口500份（每省）LAMP 技术的现场评价LAMP 技术现场评价LAMP 检测技术应用于手足口病例的评价(湖南)2012,4(
13、2)110-118试验真阳性(TP)真阴性(TN)合计LAMP阳性233(DP)0(FP)233LAMP阴性0(FN)282(DN)282总数233282515肠道病毒EV71型核酸检测结果比较肠道病毒CoxA16型核酸检测结果比较试验真阳性(TP)真阴性(TN)合计LAMP阳性103(DP)0(FP)103LAMP阴性2(FN)410(DN)412总数105410515p小结临床标本515份EV71符合率100%CA16符合率99.6%参照：国产RealTime PCR 检测试剂盒IMSAIMSA(Isothermal Multiple (Isothermal Multiple Self-m
14、atching-initiated AmplificationSelf-matching-initiated Amplification)目的：建立具有自主知识产权的等温多自配体 引发扩增反应 专利进入实质审查 引物设计软件：www.imsa-IMSA 与 LAMP 的特点比较IMSALAMP引物6条4-6条靶基因上的7个位点靶基因上的6-8个位点外引物为混合型：对应2个位点外引物只对应1个位点内引物5端互补-外/内/茎=1/4/8外/内/环=1/8/4扩增反应产生4种可自我循环复制的基本结构产生1种可自我循环复制的基本结构所有引物在反应中持续起作用外引物只在反应初始起作用IMSA 与 LAM
15、P 方法检测手足口病结果IMSA方法在常见传染病检测中的应用方法在常见传染病检测中的应用IMSA法针对EV71和CVA16 检测的最低检测线：利用概率元分析法（probit analysis）拷贝数（copies/反应）阳性数/总测试数，括号外为 EV71的测试，括号内为CVA16的测试IMSA实时浊度法mHNB颜色判定法（IMSA）HNB颜色判定法（IMSA）LAMP实时浊度法1000015/15(15/15)15/15(15/15)15/15(15/15)15/15(15/15)500015/15(15/15)15/15(15/15)15/15(15/15)15/15(15/15)1000
16、15/15(15/15)15/15(15/15)15/15(15/15)9/15(15/15)50012/15(15/15)10/15(15/15)9/15(15/15)6/15(15/15)2509/15(15/15)9/15(15/15)6/15(15/15)3/15(12/15)1006/15(15/15)6/15(15/15)3/15(15/15)3/15(6/15)503/15(12/15)3/15(9/15)0/15(9/15)0/15(3/15)250/15(9/15)0/15(6/15)0/15(3/15)0/15(0/15)100/15(3/15)0/15(3/15)0/15
17、(0/15)0/15(0/15)50/15(3/15)0/15(0/15)0/15(0/15)0/15(0/15)10/15(0/15)0/15(0/15)0/15(0/15)0/15(0/15)93710391749326667108149430JCM,2014,52（6):1862IMSA 与 LAMP 方法检测手足口病临床标本结果IMSA法针对261份手足口临床标本的检测：以商业化qRT-PCR试剂盒检测结果为标准qRT-PCR检测IMSA实时浊度法HNB颜色判定法（IMSA）mHNB颜色判定法（IMSA）LAMP实时浊度法 阳性阴性阳性阴性阳性阴性阳性阴性EV71 阳性（56）5425
18、24542515阴性（205）0205020502050205灵敏度（%）96.4%(95%CI:87.7-99.6%)92.9%(95%CI:82.7-98.0%)96.4%(95%CI:87.7-99.6%)91.1%(95%CI:80.4-97.0%)特异性（%）100.0%(95%CI:98.2-100.0%)100.0%(95%CI:98.2-100.0%)100.0%(95%CI:98.2-100.0%)100.0%(95%CI:98.2-100.0%)阳性预测值（%）100.0%(95%CI:93.4-100.0%)100.0%(95%CI:93.2-100.0%)100.0%(
19、95%CI:93.4-100.0%)100.0%(95%CI:93.0-100.0%)阴性预测值（%）99.0%(95%CI:96.6-99.9%)98.1%(95%CI:95.2-99.5%)99.0%(95%CI:96.6-99.9%)97.6%(95%CI:94.5-99.2%)CVA16 阳性（130）123712010122811812阴性（131）0131013101310131灵敏度（%）94.6%(95%CI:89.2-97.8%)92.3%(95%CI:86.3-96.3%)93.9%(95%CI:88.2-97.3%)90.8%(95%CI:84.4-95.1%)特异性（%
20、）100.0%(95%CI:97.2-100.0%)100.0%(95%CI:97.2-100.0%)100.0%(95%CI:97.2-100.0%)100.0%(95%CI:97.2-100.0%)阳性预测值（%）100.0%(95%CI:97.1-100.0%)100.0%(95%CI:97.0-100.0%)100.0%(95%CI:97.0-100.0%)100.0%(95%CI:96.9-100.0%)阴性预测值（%）94.9%(95%CI:89.8-97.9%)92.9%(95%CI:87.3-96.6%)94.2%(95%CI:89.0-97.5%)91.6%(95%CI:85
21、.8-95.6%)IMSA法对手足口临床标本的检测，其诊断灵敏度要高于LAMP法IMSA检测H7N9方法的建立及评估 5份临床标本的实验室检测验证 与国家流感中心结果（qPCR）相一致 卫生部临检中心的H7N9检测技术考核Panel 共计10份标本，结果全部符合，无漏检及误检 2013年12月末，参与广东省新发H7N9病例检测 结果符合，显色法结果判读准确 H7N9检测试剂盒转让北京爱普益生物科技有限公司 现场无仪器化提取核酸，发展直接法现场无仪器化提取核酸，发展直接法 多重检测多重检测 （含内参）（含内参）污染问题污染问题存在问题核酸检测新技术核酸检测新技术 LAMP/Multiplex P
22、CR Nested PCR(一步法）Digital PCR 自动化检测 再测序芯片 PCR 阵列 二代测序（NGS）POCT（现场检测）DPODPO探针熔解曲线探针熔解曲线BioPlex氨基糖苷类耐药基因氨基糖苷类耐药基因结核杆菌多耐药性结核杆菌多耐药性-手足口病相关病毒手足口病相关病毒-人乳头瘤病毒人乳头瘤病毒流感病毒流感病毒-648520腹泻相关病毒腹泻相关病毒-呼吸道病毒呼吸道病毒乳腺癌宫颈癌相关乳腺癌宫颈癌相关SNPsSNPsTemperature Switch PCR (TSP)GeXP,QIAxcelBMC Microbiology.2013,13:582013,8(4):e621
23、26BRI,2013,327620 研究结果研究结果 引物浓度调整：嵌合引物和通用引物的比例；各嵌合引引物浓度调整：嵌合引物和通用引物的比例；各嵌合引物浓度；扩增体系选择物浓度；扩增体系选择 三个退火温度调整，三个退火温度调整，三个循环数调整，三个循环数调整，扩增条件探索与优化扩增条件探索与优化研究结果：研究结果：基于基于QIAxcelQIAxcel全自动电泳仪全自动电泳仪Group A（9种）Group B（7种）流感病毒A型和B型、季节性H1N1呼吸道合胞病毒A型和B型副流感病毒1型副流感病毒2、3型冠状病毒OC43、229E、HKU1冠状病毒NL63人鼻病毒；腺病毒人偏肺病毒；人博卡病毒
24、两组中均加入两组中均加入Rnasep-DNARnasep-DNA引物作为内参；引物作为内参；病原体分组病原体分组基于基于QiaxcelQiaxcel的多重的多重PCRPCR检测技术检测技术16种常见呼吸道病毒分型检测种常见呼吸道病毒分型检测 呼吸道病毒多重呼吸道病毒多重PCR快速检测试剂盒快速检测试剂盒(ABT9+7)商业化商业化发热呼吸道症候群多种病原核酸检测培训班发热呼吸道症候群多种病原核酸检测培训班 -北京北京 2012.05 “常见常见1616种呼吸道病毒检测的多重种呼吸道病毒检测的多重PCRPCR试剂盒试剂盒”应用于十二五传染病重大应用于十二五传染病重大专项发热伴呼吸道症候群监测项目
25、专项发热伴呼吸道症候群监测项目“常见常见16种呼吸道病毒检测的多重种呼吸道病毒检测的多重PCR试剂盒试剂盒”应用于全应用于全国流感监测网络部分实验室国流感监测网络部分实验室呼吸道病毒多重呼吸道病毒多重PCRPCR快速检测试剂盒快速检测试剂盒 存在问题：病毒变异存在问题：病毒变异 （引物优化）（引物优化）病毒地区差异病毒地区差异 （引物优化）（引物优化）结果判断结果判断 阳性对照阳性对照 （1616质粒质粒/RNA/RNA）增加病原体（流感亚型）增加病原体（流感亚型）内参更换内参更换 （假病毒）（假病毒）两管并一管（两管并一管（1111种病毒）种病毒）流感耐药流感耐药 基于基于熔熔解曲线分析的解
26、曲线分析的多重多重PCRPCR检测技术检测技术六种常见食源性细菌的检测六种常见食源性细菌的检测目的菌种目的菌种致泻性大肠杆菌致泻性大肠杆菌沙门氏菌沙门氏菌志贺氏菌志贺氏菌单核细胞单核细胞增生增生性性李斯李斯特氏菌特氏菌副溶血弧菌副溶血弧菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌引物设计引物设计单引物单模板单引物单模板多引物多模板及引物分组多引物多模板及引物分组3 沙门氏菌沙门氏菌3 副溶血弧菌副溶血弧菌1 1 志贺氏菌志贺氏菌2 2 致泻性大肠杆菌致泻性大肠杆菌1 1 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌2 李斯特氏菌李斯特氏菌122331十二种腹泻病原体的检测十二种腹泻病原体的检测(submitted)(sub
27、mitted)目的病毒目的病毒目的细菌目的细菌 诺如病毒诺如病毒GIGI型型空肠弯曲菌空肠弯曲菌札如病毒札如病毒鼠疫耶尔森菌鼠疫耶尔森菌腺病毒腺病毒F F组组副溶血弧菌副溶血弧菌诺如病毒诺如病毒GIIGII型型志贺氏菌志贺氏菌轮状病毒轮状病毒A A组组大肠杆菌大肠杆菌人类星状病毒人类星状病毒沙门氏菌沙门氏菌核酸检测新技术核酸检测新技术 LAMP/Multiplex PCR Nested PCR(一步法）Digital PCR 自动化检测 再测序芯片 PCR 阵列 二代测序（NGS）POCT（现场检测）one-step Real-Time nested RT-PCR(ORTN RT-PCR)(s
28、ubmitted)基于基于 TSP TSP 设计的新型设计的新型一步法一步法巣式巣式PCRPCR 方法方法实验设计：实验设计：一管四引物两退火温度一管四引物两退火温度 F1 F2R2 R1 不同长度的内外引物不同长度的内外引物 退火温度不同退火温度不同 引物浓度不同引物浓度不同 溶解曲线分析溶解曲线分析 极高灵敏度极高灵敏度实验结果：实验结果：熔解曲线熔解曲线&琼脂糖电泳琼脂糖电泳1 1（L1L1）：阴性样品。）：阴性样品。2 2（L2L2）：阳性样品）：阳性样品实验结果：实验结果：EV71 EV71 标准曲线图标准曲线图本试验方法可用作本试验方法可用作EV71EV71样品的定量分析，样品的定
29、量分析，CTCT值可达到值可达到38.4038.40，1010倍于倍于qPCRqPCRAssaysPositive No.and Percentage of EV71Negative No.and Percentage of EV71Ct valueORTN RT-PCR41（41%）59（59%）26-38qRT-PCR29（29%）71（71%）26.5-35传统传统巣式巣式PCRPCR41（41%）59（59%）新型一步法巣式巣式PCR与荧光定量探针法PCR和传统两步法巣式巣式PCRPCR比较比较（100份临床样品）针对针对1212例检测结果不同样品，采取重复试验并测序的方法验例检测结果
30、不同样品，采取重复试验并测序的方法验证新型一步法检测结果的准确性。证新型一步法检测结果的准确性。Advantages of digital PCRAdvantages of digital PCR（优点）（优点）Not rely on external references Increased tolerance to enzyme-inhibiting substances Simultaneous template amplification Superior precision,sensitivity and reproducibility lower coefficient of va
31、riation Reduced background DNA and contaminant levels which consequently increases the signal-to-noise ratio in positive reaction partitions核酸检测新技术核酸检测新技术 LAMP/Multiplex PCR Nested PCR(一步法）Digital PCR 自动化检测 再测序芯片 PCR 阵列 二代测序（NGS）POCT（现场检测）自动化高通量检测Beckman Biomek NX/FXBeckman Biomek NX/FX型型实验室自动化工作站实验
32、室自动化工作站 主要特点：单臂或双臂，主要特点：单臂或双臂，9696道、道、384384道或智能八道加样器供选，道或智能八道加样器供选，2424个微孔盘工作区，多种分注功能及配件定位器可选个微孔盘工作区，多种分注功能及配件定位器可选未知病原检测未知病原检测 再测序芯片（再测序芯片（RPMRPM）PCR PCR 阵列（阵列（PCR array)PCR array)二代测序二代测序 （NGSNGS）智能化的智能化的分析软件分析软件 芯片滚动芯片滚动杂交仪杂交仪芯片洗芯片洗涤工作涤工作站站定制基因芯定制基因芯片片 高分辨率的高分辨率的芯片扫描仪芯片扫描仪未知病原未知病原RPMRPMu 完成完成4 4
33、种不同症候群（呼吸道感染，种不同症候群（呼吸道感染，7 7科科2323属；胃肠道感染属；胃肠道感染，6 6科科1313属；脑炎和神经系统感染，属；脑炎和神经系统感染，6 6科科1717属；病毒性出血血热属；病毒性出血血热相关，相关，4 4科科1010属）的相关病毒性病原体的全部引物和探针的生属）的相关病毒性病原体的全部引物和探针的生物信息学分析、设计和芯片定制（物信息学分析、设计和芯片定制（650650片）和储备片）和储备u 建立了呼吸道感染和胃肠道感染再测序检测芯片技术平台建立了呼吸道感染和胃肠道感染再测序检测芯片技术平台RPM-Flu3.1：FluA(35%)12种病毒种病毒21种细菌种细
34、菌RPM-IVDC1：86种病毒亚型种病毒亚型 22种细菌种细菌Plos One,2013 8(9):e75704Frontier in Microbiology,2015(accepted)Resequencing Pathogen Microarray再测序芯片（再测序芯片（RPM）高通量自动化的脑炎症候群检测高通量自动化的脑炎症候群检测PCR ArrayPCR Array方法方法方法建立的基础方法建立的基础 1 1：样品体积扩大：样品体积扩大RNA LcDNA L自动化640RNARNAcDNAcDNA方法所需样品量方法所需样品量3232L L（1616个孔）个孔）方法建立的基础方法建立
35、的基础 2 2：9696孔板的分配孔板的分配特点：特点：1.1.引物组在引物组在9696孔板上的分布是模式化的。孔板上的分布是模式化的。2.2.更快的分配体系。更快的分配体系。3.3.节省了样品编号的时间。节省了样品编号的时间。引物组可以安排在同一个整行或整列也可以平均分配整行或者整列ABCDEFGH12肠道病毒乙脑疱疹腮腺炎弹状病毒副粘病毒麻疹西尼罗蜱传脑炎细菌16s呼吸道合胞风疹布尼亚病毒虫媒病毒沙粒病毒黄病毒方法中所用的引物：方法中所用的引物：200200对对+来源来源1.1.再测序芯片的引物再测序芯片的引物2.2.文献文献中查到的中查到的3.3.各个各个科室提供的科室提供的4.4.根据
36、每年流行情况不同，对引物组进行调整根据每年流行情况不同，对引物组进行调整特点：特点：1.1.每个样品由每个样品由1616个不同的引物组检测个不同的引物组检测2.2.整板的整板的PCRPCR产物都用同一对引物测序。产物都用同一对引物测序。方法流程（方法流程（2424小时完成）小时完成）全自动电泳仪RNAcDNA工作站加样与PCR可以做成预制反应体系获得电泳结果获得sanger法测序结果 测序阴性样本：做二代测序Real time Real time 结果结果PCRPCR array array方法结果方法结果提示提示所有样品一般都所有样品一般都为为Real timeReal time阴阴性样本性
37、样本常见病原体阳性常见病原体阳性有突变，或方法灵敏度不同有突变，或方法灵敏度不同不常见病原体阳性不常见病原体阳性少见的病原体少见的病原体阴性阴性参考参考16SRNA16SRNA结果结果结果分析结果分析临床检测结果：儿童医院样品临床检测结果：儿童医院样品lz18Pseudomonaslz32Mumpslz144EVMumpslz162EVlz136EVPseudomonaslz149Pseudomonaslz160Mumpslz130cEVMumpslz153EVlz117cEVLZ104cMumpsLZ155EVLz87MumpsLz67EVLz81EVLz85EVLz91MumpsLz75M
38、umpsLz79Mumps阳性率：1996(19.8%)另有147份样本进行中新一代测序技术应用领域新一代测序技术应用领域携带者筛查预处理药理基因测试产前监测孕后监测孕期监测胚胎遗传学诊断遗传疾病遗传疾病肿瘤研究肿瘤研究肿瘤切除边缘治疗状态监测预后复发检测风险预警早期检测筛查肿瘤诊断设备平台感染疾病感染疾病动物微生物研究微生物定性病毒载量监测微生物定量突变株鉴定病毒整合移植配型移植配型鉴定和配型组织排斥全程监测移植后排斥监测以及更广阔的应用以及更广阔的应用可感染人病毒的发现时间曲线Woolhouse M E et al.Proc.R.Soc.B 2008;275:2111-2115 随着越来越
39、多的病毒被发现了，其中可能致病的病毒种随着越来越多的病毒被发现了，其中可能致病的病毒种类也随之增加。类也随之增加。临床样本临床样本细菌真菌寄生虫其他病毒临床宏基因组(Clinical Metagenomics)高通量测序高通量测序可以在不需要目标病原体的背景资料的情况下，一次高通量测序试验就可以完成检测工作。0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%100%脑脊液粪便呼吸道人体组织血清人相关病毒细菌其他临床样本临床样本病毒检测如大海捞针病毒检测如大海捞针Oxford Nanopores disruptive MinION USB device (GridION)优化NGS应用于
40、未知病原体筛查流程样品收集及富集核酸提取及降低扩增背景信号NGS测序生物信息学分析(VIP)病原体分离培养及鉴定rRNA消除病毒核酸靶向扩增1未知样品接收，从出血热室领取未知样品1份，液体，体积200l时间点：2014年12月10日10点10分2未知样品核酸提取，提取总RNA，洗脱体积50l时间点：2014年12月10日11点30分3未知样品核酸的cDNA文库构建及扩增时间点：2014年12月10日17点40分4测序文库的制备及油包水扩增时间点：2014年12月11日9点至-过夜5油包水扩增产物的纯化、测序及数据分析(VIP)时间点：2014年12月12日8点至22点工作流程及时间点*从收样至
41、病毒鉴定初步结论，共计用时60小时。十二五重大专项能力考核%Coverage96.4110.295.792.90.680.430.02Flavivirus(Dengue virus 1 isolate RR57)Lymphocryptovirus(Epstein-Barr virus)Orthobunyavirus(Ngari virus)Pestivirus(Bovine viral diarrhea virus)TeschovirusPneumovirusOrthopoxvirus(Monkeypox virus)020406080100120%Coverage筛查到的主要病毒基因组覆盖率
42、 登革病毒I型基因组覆盖率MERS-NGS应急工作NGS TimelineSpeciesGenusGI%CoverageReads_hitReads_numAverage depth of coverageMiddle East respiratory syndrome coronavirus,complete genomeBetacoronavirus51126266267.95598063403506.33NGS Data Analysis by VIP PipelineMERS-CoV Genome Assembly 建立针对未知病毒鉴定的生物信息学分析方案 Virus Identifi
43、cation Pipeline(VIP)Advantages of VIP（优势）Cross-platform support（交叉平台适用）(454,PGM,Illumina.etc)Ultrafast and accuracy（超快准确）Low hardware requirements（硬件要求低）One-Touch command（一键式命令）下一步工作目标：挖掘NGS的潜力 vs 节约实验成本 硬件成本和人员要求高（不同需求）标准化（加强内部合作）结合临床数据（精准医学）存存 在在 问问 题题核酸检测新技术核酸检测新技术 LAMP/Multiplex PCR Nested PCR(一
44、步法）Digital PCR 自动化检测 再测序芯片 PCR 阵列 二代测序（NGS）POCT（现场检测）现场检测系统（现场检测系统（POCTPOCT）免疫学技术免疫学技术 上转发光上转发光 胶体金胶体金 免疫荧光免疫荧光 核酸技术核酸技术 定量定量PCR 微阵列微阵列 等温扩增等温扩增 定量PCR图图 雅培公司雅培公司生产的生产的Abbott m2000 System比利时比利时Biocartis 公司的公司的Idylla多重定量多重定量PCR图图 illumipro-10自动化等温扩增和检测系统自动化等温扩增和检测系统(应用于应用于LAMP)图图 BDBD公司公司ViperViper系统（应用于系统（应用于SDASDA）微流控芯片（和国外合作）国内商业化的核酸POCT是空白 交叉学科融合 产学研结合存 在 问 题
