1、基因芯片技术基因芯片技术State-of-the artState-of-the art*冯永强冯永强*Graham Ramsay,Nature Biotechnology 1998,16:401.人类基因组（测序）计划（Human genome project）的逐步实施，现（1997年底）已完成2%序列及800，000个cDNA片段(EST)的测序工作，预计2005年可全部完成；2.其它生物基因组的测定工作：11种微生物0.6-4.2Mb、大肠杆菌4.6Mb、酵母13Mb全序列，线虫71%、果蝇6%、小鼠0.2%序列得到测定。然而，怎样去研究如此众多基因的生物信息及其在生命过程中所担负的功
2、能，成了全世界生命科学工作者共同的课题！速度快、效率高 可同时对大量核酸序列进行检测和分析 操作简便、自动化程度更高 总体效率较常规杂交方法高基因芯片(Gene chip)又称DNA芯片（DNA Chip）或生物芯片(Biological chip，不过该词尚包括肽芯片等其它类型),它是指将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布进而对靶分子的序列和数量进行分析。早在八十年代初有人就曾设想利用计算机半导体技术生产基因芯片以对人类基因组大量的遗传信息进行分析和检查，但直到光引导原位合成(light-directed in situ synthesis)高
3、密度探针技术和激光共聚焦显微扫描问世之后才使该设想逐步成为现实，并迅速应用到分子生物学的多个领域，得到了科学界的高度重视。操操作作自自动动化化程程度度一一次次可可检检测测的的序序列列个个数数总总体体效效率率基基因因芯芯片片技技术术简简便便很很高高极极大大很很高高传传统统杂杂交交方方法法复复杂杂很很低低很很小小很很低低 基因芯片技术从本质上说与Southern Blotting或Northern Blotting相同（所以Affymetrix曾与Southern就专利问题产生冲突），只是探针密度极高而已。不过，为此花费了大量的人力物力从事研制工作。当然，其结果也很是诱人。1.支持物：如玻片、硅片
4、、NC膜、Nylon膜2.探针：高密度的探针序列按照一定的次序固定在支持物上，每个位点的序列是已知的外观探针支持物剖面图平面局部放大硬件：序列合成设备包括：核酸或多肽合成仪（作预合成点样用）、照相平板印刷及半导体制作相应设备（作光引导原位合成）。激光共聚焦显微扫描设备：激光共聚焦显微镜或相应设备，以采集高密度点阵杂交信号并进行数字化处理分析。软件基因序列分析及探针筛选技术（可能涉及专利等产权问题）序列合成及定位技术（光引导原位合成或微量点样技术）杂交信号的采集和分析技术（需要处理极大量的杂交信号并能由此得到所需信息）现在全世界已有十多家公司专门从事基因芯片的研究和开发工作，而且已有较为成型的产
5、品和设备问世。这些公司主要以美国的Affymetrix公司为代表，该公司聚集有多位计算机、数学和分子生物学专家，其每年的研究经费在一千万美元以上，且已历时六七年之久，拥有多项专利。产品即将或已有部分投放市场，产生的社会效益和经济效益令人瞩目。详情如下表所示：世界十大基因芯片研制单位简要情况一览PCRT7 promoterT7 promoter体内转录片段化1.5小时杂交、冲洗ACGT扫描分析1小时荧光素图2 样品处理与检测过程简图续表点点 阵阵密密 度度合合 成成 大大 量量 探探 针针 需需要要 的的 反反 应应 步步 数数检检 测测效效 率率技技 术术难难 度度设设 备备 情情 况况 知知
6、 识识 产产 权权 问问 题题光光 引引 导导 原原 位位合合 成成 技技 术术很很 高高合合 成成 4 n 个个 序序 列列 只只需需 4*n 步步 反反 应应很很 高高很很 高高需需 要要 大大 型型 复复杂杂 设设 备备有有 可可 能能 侵侵 权权*预预 合合 成成 点点 样样技技 术术比比 较较低低合合 成成 4 n 个个 序序 列列 需需4 n 个个 反反 应应较较 高高较较 低低设设 备备 代代 价价 相相对对 低低 廉廉无无 侵侵 权权 可可 能能 基因芯片以其片基(substrate)的不同可以分为无机片基和有机合成物片基。前者主要包括半导体硅片和玻璃片，其上的探针主要以原位聚
7、合的方法合成，后者主要有特定孔径的硝酸纤维膜和尼龙膜，其上的探针主要是预先合成后通过特殊的微量点样装置或仪器滴加到片基上去（如下表所示）。基因芯片的主要类型及其简要特点 不过，也有人(Robert S.Matson)等以聚丙烯膜为支持物用传统的亚磷酰胺固相法原位合成高密度探针序列。基本过程用生物素标记并经扩增（也可使用其它放大技术）的靶序列或样品然后再与芯片上的大量探针进行杂交用链霉亲和素(streptavidin)偶联的荧光素（常用的荧光素还有lassamine 和phycoerythrin）进行显色图象的采集用落射荧光显微镜(epifluorescence microscope)、激光共聚
8、焦显微镜或其它荧光显微装置对片基扫描由计算机收集荧光信号，并对每个点的荧光强度数字化后进行分析。由于完全正常的 Watson-Crick配对双链要比具有错配(mismatch)碱基的双链分子具有较高的热力学稳定性，所以，前者的荧光强度要比后者强出5-35%。从这一点来说，该检测方法是具有一定特异性的，而且荧光信号的强度还与样品中靶分子含量呈一定的线性关系。以下图为例。IncytePharmaceticals（美美国国）压压电电打打印印 PCR 产产物物或或芯芯片片上上合合成成 Oligos1000 最最终终可可达达 10000个个 Oligo/PCR片片断断与与标标记记RNA荧荧 光光/同同位
9、位素素表表达达检检谱谱测测多多态态性性分分析析诊诊断断Moleculardynamics（美美国国）500-5000nt 的的 cDNA用用笔笔打打印印于于 10 cm2玻玻璃璃片片10000 个个 cDNA 点点与与200-400nt标标记记cDNA荧荧光光新新基基因因鉴鉴定定表表达达谱谱检检测测Nanogen（美美国国）预预组组装装的的 20mer 的的探探针针俘俘获获于于电电活活化化芯芯片片位位点点25/64/100/400/最最终终10000 个个 Oligo 点点与与200-400nt标标记记cDNA荧荧光光诊诊断断及及短短的的重重复复序序列列鉴鉴定定Protogene Lab（美美
10、国国）通通过过打打印印于于表表面面张张力力阵阵 列列 将将40-50merOligo 合合成成于于 9 cm2玻玻璃璃片片8000个个 Oligo点点与与200-400nt 标标记记核核酸酸样样品品荧荧光光表表达达谱谱检检测测多多态态性性分分析析Sequenom(德德国国，美美国国)20-25mer 探探针针合合成成后后打打印印成成阵阵列列250 点点，激激光光解解吸吸-质质谱谱分分析析质质谱谱新新基基因因鉴鉴定定诊诊断断及及作作图图Synteni（美美国国）500-5000nt cDNA 用用滴滴头头打打印印于于 4 cm2 的的玻玻璃璃片片10000个个cDNA点点与与200标标记记cDN
11、A荧荧光光新新基基因因鉴鉴定定表表达达谱谱检检测测德德国国癌癌症症研研究究所所（德德国国）约约 1000 个个 PNA 合合成成于于 810 cm2的的芯芯片片荧荧 光光/质质谱谱表表达达谱谱检检测测及及诊诊断断光引导原位合成(Light directed in situ synthesis）光 引 导 聚 合 技 术 是 照 相 平 板 印 刷 技 术(photolithography)与固相合成技术、计算机技术以及分子生物学等多学科相互渗透结果。照相平板印刷技术中可用光引导形成电子线路（electrical circuits），利用类似的道理可在固相支持物上同时合成出大量不同的化合物。操作
12、过程（见下图）*使支持物氨基化*用光不稳定保护基（photo labile protecting group）将NH2基保护起来*选择适当的挡光板（mask）使需要聚合的部位透光，不需发生聚反应的部分不透光。这样，光通过挡光板照射到支持物上，受光的部分NH2解保护*合成所用单体分子一端按传统固相合成方法活化另一端则受光敏保护基团保护。这时，用单体分子去和支持物上解保护的氨基反应，偶联后的部位将仍旧带上保护基团。*类似地，进行以后其它反应直至得到目的寡聚体序列。光引导原位合成技术原理图预合成点样技术（Off-chip synthesis)这一方法在多聚物的设计方面与前者相似，合成工作用传统的DN
13、A或蛋白固相合成仪进行。多聚物合成后再用特殊的点样装置或仪器（如美国Cartesian Technologies公司的PixSys NQ/PA系列产品）将其以较高密度分布于硝酸纤维膜或经过特殊处理的玻璃片上，点阵密度可达到2500spots/cm2（Yershov et al报道点阵密度最高可达20,000-30,000spots/cm2）。支 持 物相 关 技 术照 射 光去 保 护 方 法 及 效 率每 步 聚 合 效 率硅 片 或 玻 片照 相 平 板可 见 光酸 去 保 护（98%）98%（需 预 处 理）印 刷 技 术电 子 射 线 等光 去 保 护（92-94%）92-94%注：美
14、国专利第5,744,305号说明固相表面点阵密度超过400spots/cm2 将侵犯Affymetrix 公司产权片片基基探探针针固固定定方方式式探探针针密密度度显显色色及及检检测测方方式式钢钢性性片片基基如如玻玻片片、半半导导体体硅硅片片等等原原位位合合成成（in situsynthesis）高高荧荧光光，激激光光共共聚聚焦焦扫扫描描、定定量量分分析析；生生物物传传感感器器等等薄薄膜膜片片基基如如NC、Nylon膜膜等等预预先先合合成成后后点点样样(off-chipsynthesis)低低荧荧光光影响光聚合的主要因素现列表如下：其中，保护基团类型与去保护方式严重制约着聚合点阵的密度和探针的长
15、度。如下表所示。不同去保护方式对聚合效果的影响可见，经典光引导聚合技术所存在的问题在于：探针密度低、分辨力差每步反应合成产率低为此，Glenn McGall等将光引导合成技术与半导体工业所用的光敏抗蚀技术相合，以酸作为保护剂，使探针密度达到16,000spots/cm2以上（有望接近106spots/cm2）。光具有波粒二象性，所以具有衍射的特性。当挡光板透光孔间的距离足够小的时候，由于光的衍射，使受光部分与非受光部分光照对比度下降，如果仍用前述光引导合成技术就会使去保护作用不够理想，受照射部分与其它部分差别不够大，聚合纯度不高，降低了检测结果的信噪比(signal-noise ratio)，
16、从而影响了聚合点阵的密度的提高。光敏抗蚀剂的解离对照度的依赖是非线性的，所以当照度达到一定值时它就会解离，这样就部分地解决了由于光衍射引起的问题虽然由此增加了技术的复杂性，但却明显地提高了聚合点阵的密度。NoImage 利用基因芯片进行杂交测序基因芯片不仅可对大量基因或序列同时、快速进行定性、定量分析，而且作为一种极有发展前途的测序策略也倍受人们的重视。以图5为例，首先将八聚体寡核苷酸所有可能的序列组合合成或固定于片基上，对于每一序列其在片基上的位置是预先决定好的。样品扩增并经标记后与片基上所有序列进行杂交反应。这样，就会出现特定的杂交图谱，有杂交信号部位的寡核苷酸片段与待测样品序列是互补的最
17、后分析产生杂交信号的寡核苷酸序列的重叠情况进而推导出样品的核酸序列。利用基因芯片进行杂交测序的原理公公司司阵阵列列方方法法杂杂交交方方式式检检测测应应用用领领域域Affymetrix（美美国国）20-25mer探探针针光光引引导导合合成成在在 1.25/5.25cm2的的硅硅片片10000-260000 个个 Oligo探探针针与与 30-40 个个标标记记样样品品cDNA/asRNA片片断断荧荧光光表表达达谱谱检检测测多多态态性性分分析析诊诊断断Brax（英英国国）Oligo 合合成成后后结结合合于于芯芯片片上上通通用用芯芯片片上上100 个个探探针针与与标标记记核核酸酸质质谱谱诊诊断断、表
18、表达达谱谱检检测测及及新新基基因因鉴鉴定定Hyseq（美美国国）500-2000ntDNA 样样品品印印刷刷于于 0.6cm2/18cm2的的膜膜预预组组装装的的 5mer-Oligo打打印印于于1.15的的玻玻璃璃片片64/55000 个个样样品品cDNA点点与与 8000/300 个个 7mer探探针针通通用用 1024 个个 Oligo 点点探探测测 10kbcDNA 样样品品，加加标标记记的的 5mer 探探针针和和连连接接酶酶同同位位素素诊诊断断、表表达达谱谱检检测测、多多态态性性分分析析、新新基基因因鉴鉴定定及及大大规规模模测测序序IncytePharmaceticals（美美国国）压压电电打打印印 PCR 产产物物或或芯芯片片上上合合成成Oligos1000 最最终终可可达达 10000个个Oligo/PCR片片断断与与标标记记RNA荧荧光光/同同位位素素表表达达检检谱谱测测多多态态性性分分析析诊诊断断 基因芯片技术与生物传感器的结合应用 基因芯片技术在分子免疫学中的应用 基因芯片技术在基因表达谱测定中的应用 基因芯片技术在突变检测及多态性分析方面的应用 基因芯片技术在基因组文库作图中的应用
