1、实时荧光定量实时荧光定量PCR技术的原理及应用技术的原理及应用(Real time Quantitative PCR)讲讲 座座 提提 纲纲q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的几种方法介绍的几种方法介绍q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR医学和科研中的应用医学和科研中的应用q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的几种方法介绍的几种方法介绍q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR医学和科研中的应用医学和科研中的应用实时荧光定量实时荧光定量PCR定义定义 在在PCRPCR反应体系中加入反应体
2、系中加入荧光基团荧光基团，利用荧光，利用荧光信号累积信号累积实时监测实时监测整个整个PCRPCR进程，最后通过标进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法准曲线对未知模板进行定量分析的方法 实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 实时原理实时原理 常常 规规 PCRPCR技术：技术：对对PCRPCR扩增反应的扩增反应的终点产物终点产物进行定量和定性分析进行定量和定性分析 无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测实时定量实时定量PCRPCR技术：技术：利用利用荧光信号的变化实时检测荧光信号的变化实时检测PCRPCR扩增反应中扩
3、增反应中每每一个循环扩增产物量的变化一个循环扩增产物量的变化，通过，通过CtCt值值和标准曲线和标准曲线的分析对的分析对起始模板起始模板进行进行定量分析定量分析实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理 定量原理定量原理介绍三个概念：介绍三个概念：扩增曲线、荧光阈值、扩增曲线、荧光阈值、CtCt值值如何对起始模板定量？如何对起始模板定量？通过通过Ct值和标准曲线对值和标准曲线对起始模板起始模板进行定量分析进行定量分析实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 -扩增曲线扩增曲线扩增曲线图：扩增曲线图：横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度 每个循环进行一次荧光信号的收集荧光
4、基团荧光基团荧光检测元件荧光检测元件实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 -荧光阈值荧光阈值荧光信号阈值荧光信号阈值 （threshold threshold）：q 前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值q 荧光域值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍q 手动 设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99q 真正的信号:荧光信号超过域值实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 -Ct值CtCt值的定义值的定义：PCR扩增过程中，扩增
5、产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数C(t)value 实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 -Ct值的重现性横轴：横轴：PCR反映循环数反映循环数纵轴：荧光信号量纵轴：荧光信号量CtCt值的特点值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值则极具重现性实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 -定量原理定量原理理想的PCR反应：X=X0*2n非理想的PCR反应：X=X0(1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 -定量原理定量原理在扩增产物达
6、到阈值线时:XCt=X0(1+Ex)Ct=M (1)XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量.在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M方程式(1)两边同时取对数得:log M=log X0(1+Ex)Ct (2)整理方程式(2)得:log X0=-log(1+Ex)*Ct+log M (3)Log Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的域值的循环数即循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量就可计算出样品中所含的模板量实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 -标准曲线标准曲线q 模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，
7、即Ct值越小q Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量Sample实时荧光定量PCR原理 绝对定量25讲讲 座座 提提 纲纲q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的几种方法介绍的几种方法介绍q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR实验设计及应用实验设计及应用q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的几种方法介绍的几种方法介绍q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR实验设计及应用实验设计及应用非特异性荧光标记：非特异性荧
8、光标记：1、SYBR Green 特异性荧光标记：特异性荧光标记：2、TaqMan 3、Molecular Beacon 4、Amplisensor实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 -DNA-DNA 产物的荧光标记产物的荧光标记QQR实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 方法方法 1-1-SYBR Green 法SYBR Green SYBR Green 法 工作机理q SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位q SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光q 变性时，DNA双链分开，无荧光q 复性和延伸时，形成双链DNA，SYBR Green 发荧光，在此
9、阶段采集荧光信号。SYBR Green 5353SGNo EmissionSGSGSGExcitationExcitationSGSGSGSGSGSGSG5353EmissionExcitationExcitation温度温度荧光强度荧光强度Tm-dIdTTmSYBR Green SYBR Green 法法 融解曲线分析融解曲线分析融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光定量准确融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确非特异性产物非特异性产物Cycle numberFlourescenc Ck 102Ck 104SampleCycle numberLog of DNA conc
10、entrationSYBR Green 法 定量原理q 模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少q Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量SYBR Green 法 -PCR反应的建立反应体系的建立及优化:1.SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测2.Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准3.MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物4.反应Buffer 体系的优化5.反应温度和时间参数:由酶和引物决定6.其他与常规PCR相同天为时代公司利用SYBR Green 法定量检测样品DN
11、ASYBR Green SYBR Green 法法 应用范围应用范围q 起始模板的测定q 基因型的分析q 融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。SYBR Green SYBR Green 法法 优缺点优缺点 q 对DNA模板没有选择性 -适用于任何DNAq 使用方便 -不必设计复杂探针q 非常灵敏q 便宜优 点q 容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性 但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件q 对引物特异性要求较高缺 点与目标序列互补实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 方法方法2-TaqM
12、an2-TaqMan法法TaqMan-水解型杂交探针v 5端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等 v 3端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)v 探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光v Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探针TaqManTaqMan法法 工作原理工作原理每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光TaqManTaqMan 法法 PCRPCR反应的建立反应的建立1、引物、探针的设计：探针Tm为68-70，30 bp,5不能有G，G可能会淬灭荧光素，引物尽量靠近探针，扩增片段400 bp，引物
13、Tm为59-60 2、反应参数的确定：一般为：94，10-20S 60，30-60S（Taq酶53外切核酸酶活性在60 最高）也可通过温度梯度优化退火温度 72，45 S，3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值 引物浓度：50-900nM 探针浓度：50-250nM4、其他与常规PCR相同已肝病人血液中HBV的绝对定量q目的：利用核酸检测，缩短检验时间，提高灵敏度，为诊断用药提供依据q方法：从血液中提取病毒DNA，扩增病毒基因，以TaqMan探针进行检测q设置对照：浓度为106、105、104 103 的标准样品各一个，设阴性和空白对照q实验步骤：提取HBV DNA 设计特
14、异引物 设计TaqMan探针并标记探针 扩增程序q结果：获取血液样品中HBV DNA的精确copy数利用利用TaqManTaqMan法法 检测血液中的检测血液中的HBVHBV数据分析分析结果：HBV DNA的精确copy数为3.7X105利用利用TaqManTaqMan法法 检测血液中的检测血液中的HBVHBVTaqManTaqMan法法 应用范围应用范围q 起始模板的定量q 基因型分析q 目的基因定量q 产物鉴定q SNP分析TaqManTaqMan法法 优缺点优缺点q 对目标序列的高特异性 -阴性结果确定q 设计相对简单 -与目标序列某一区域互补q重复性比较好优 点q 只适合一个特定的目标
15、q 委托公司标记，价格较高q 不易找到本底低的探针缺 点实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 方法方法 3-Molecular beacon 3-Molecular beacon 法法(分子信标分子信标)标记荧光的发夹探针 环与目标序列互补茎由互补配对序列组成环茎荧光素 淬灭剂发夹型杂交探针发夹型杂交探针Molecular beacon(Molecular beacon(分子信标分子信标)工作原理工作原理q 荧光共振能量转移（FRET）q 探针与DNA杂交时产生荧光 -变性过程：产生非特异性荧光 -延伸过程：不产生荧光 -退火过程：产生特异性荧光，检测荧光信号Molecular beacon
16、(Molecular beacon(分子信标分子信标)应用范围应用范围 q 起始模板的定量q 基因型分析q 产物鉴定q SNP（单核苷酸多态性）分析Molecular beacon(Molecular beacon(分子信标分子信标)优缺点优缺点q高特异性：高特异性：对目标序列 检测SNP最灵敏的试剂之一q荧光背景低荧光背景低优 点q 只能用于一个特定目标q 设计困难q 价格比较高缺 点讲讲 座座 提提 纲纲q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的几种方法介绍的几种方法介绍q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR实验设计及应用实验设计及应用q
17、实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的几种方法介绍的几种方法介绍q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR实验设计及应用实验设计及应用实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR法法 标准样品标准样品相对定量中的内标相对定量中的内标 内标通常是内标通常是-actin、GAPDH基因等看家基因基因等看家基因 在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量绝对定量的标准样品：绝对定量的标准样品：已知拷贝数
18、的质粒已知拷贝数的质粒DNADNA和体外转入的和体外转入的RNA RNA 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR法法 标准样品标准样品用于生成标准曲线的样品如何设定？用于生成标准曲线的样品如何设定？含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒含有和待测样品相同扩增片段的含有和待测样品相同扩增片段的cDNAcDNA紫外分光光度计或荧光酶标测定浓度紫外分光光度计或荧光酶标测定浓度根据质粒或根据质粒或cDNAcDNA分子量换算成拷贝数，做系列稀释分子量换算成拷贝数，做系列稀释实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR法法 定量方法定量方法q 绝对定量检测起始模板数的精确拷贝数，通
19、常用到标准曲线绝对定量检测起始模板数的精确拷贝数，通常用到标准曲线q 相对定量确定经过不同处理的样本目标转录本之间基因的表相对定量确定经过不同处理的样本目标转录本之间基因的表达差异（不同时相）达差异（不同时相）v 2 2-C C（t t）v 双标准曲线法双标准曲线法实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR法法 TaqManTaqMan法举例法举例 TaqMan TaqMan法举例法举例 标记探针标记探针使用 TaqMan 探针进行双通道荧光定量q FamFam标记目标基因探针标记目标基因探针q VIC VIC标记看家基因探针标记看家基因探针TaqManTaqMan法举例法举例 材料准备材料准备q从
20、正常乳腺组织中提取的从正常乳腺组织中提取的总总 RNA RNA q从乳腺癌组织中提取的从乳腺癌组织中提取的 总总RNARNAq含含 ERBB2 and GAPDH ERBB2 and GAPDH 的质粒用于生成标准曲线的质粒用于生成标准曲线q单双通道同时进行，独立分析单双通道同时进行，独立分析TaqManTaqMan法举例法举例 反应程序反应程序 RT-qPCR 反应程序：反应程序：50C,30min95C,15min94C,15sec60C,1minplate read10C,foreverEnd35 more timesTaqManTaqMan法举例法举例 癌症标记物表达癌症标记物表达Co
21、lor 2-VIC detection for GAPDHColor 1 FAM detection for ERBB2TaqManTaqMan法举例法举例 实验结果实验结果 单双通道相互验证A.Multiplex ReactionsHealthy RNACarcinoma28.4826.4228.6826.9828.7826.9828.65 0.1526.80 0.32B.Singleplex reactionsHealthy RNACarcinoma28.6727.0928.7126.6828.7326.7028.70 0.0326.82 0.24TaqManTaqMan法举例法举例 实验
22、结果实验结果 定量定量Copies ng/l Total RNAHealthyRNATumorRNATumor/HealthyERBB21095 1052213024922.16 XGAPDH95500857301360001308001.45 XTaqManTaqMan法举例法举例 实验结果实验结果 定量分析定量分析ERBB2 copies/GAPDH copies1095/95500=0.0111052/85730=0.0122130/136000=0.0172492/130800=0.019Healthy RNATumor RNA0.01150.0180.018/0.011GraphCo
23、pies ng/l Total RNATaqManTaqMan法举例法举例 实验结果实验结果 表达差异表达差异HealthyTissueCarc.TissueRelative ExpressionERBB2的表达差异TaqManTaqMan法举例法举例 实验结果实验结果 讨论讨论通过通过RT-qPCR成功检测了成功检测了ERBB2基因在基因在不同组织的不同组织的 表达差异；在乳腺癌组织中，表达差异；在乳腺癌组织中，ERBB2的表达量是正常水平的的表达量是正常水平的1.8倍倍实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR法法 SYBR Green ISYBR Green I法举例法举例利用利用SYBR G
24、reen 1进行进行GMO定量定量 SYBR Green I SYBR Green I法法 GMOGMO概念概念 转基因生物又称遗传修饰生物（Genetically Modified Organisms，GMO），是经基因工程技术改变基因组构成的生物，包括转基因植物、转基因微生物和转基因动物。SYBR Green I SYBR Green I法法 GMOGMO概念概念 SYBR Green I SYBR Green I法法 检测方法检测方法q 转基因生物包括了特异的核酸序列，调控序列、目标基因、报告基因q 通过内源基因来对每个样品DNA进行定量（Normalization)q 利用插入基因的定
25、量来进行GMO含量检测SYBR Green ISYBR Green I法法 材料准备材料准备q Roundup Ready 大豆（RTC公司，IRMM-41050-56）q 普通非转基因大豆q 从超级市场买来的下列食物用来作为测试样品：大豆饼,豆制甜点 和两个牌子的大豆粉SYBR Green ISYBR Green I法法 样品制备样品制备标准品的制备:转基因成分含量分别为 0%,0.1%,0.5%,1%,2%和 5%转基因大豆实验样本 从含大豆成分的样本中提取DNADNA from Standard/SamplePCR mixGMO primersTUBE 1TUBE 2PCR mixLec
26、tin primersSYBR Green ISYBR Green I法法 引物设计引物设计Lectin 扩增片段长度为318bp 其引物为：正向：5-GAC-GCT-ATT-GTG-ACC-TCC-TC-3，反向：5-GAA-AGT-GTC-AAG-CTT-AAC-AGC-GAC-G-3EPSPS 扩增片段长度为356bp 其引物为：正向：5-TGG-CGC-CCA-AAG-CTT-GCA-TGG-C-3 反向：5-CCC-CAA-GTT-CCT-AAA-TCT-TCA-AGT-3SYBR Green ISYBR Green I法法 C C（t t）定量）定量 log A/B =logA-l
27、ogB A:EPSPS GMO B:Lectin all bean A/B:%GMO%GMOC（t）SYBR Green ISYBR Green I法测法测GMO GMO 数据收集与分析数据收集与分析SYBR Green ISYBR Green I法测法测GMO GMO 熔解曲线分析熔解曲线分析Tm=92oC熔解曲线熔解曲线 Lectin 扩增扩增 Tm=88.5oC熔解曲线熔解曲线 epsps 扩增扩增SYBR Green ISYBR Green I法测法测GMO GMO 实验结果实验结果1:1:标准曲线标准曲线不同转基因成分含量与不同转基因成分含量与Ct epsps做做标准曲线标准曲线Cp
28、4-epspsSYBR Green ISYBR Green I法测法测GMO GMO 实验结果实验结果2:2:样品的样品的扩增曲线扩增曲线LectinepspsFood Sample#2Food Sample#1SYBR Green ISYBR Green I法测法测GMO GMO 实验结果：实验结果：定量分析定量分析Standards/SampleC(t)epspsC(t)Lectin0ND22.60.1ND22.60.528.222.51.027.222.52.026.222.85.024.622.7Soy Dessert24.622.4Soy FlourND22.2Soy Burger2
29、4.223.4SYBR Green ISYBR Green I法测法测GMO GMO 实验结果实验结果 定量分析定量分析1.Calculate C(t)=C(t)epsps C(t)lectinStandards/SampleC(t)epspsC(t)LectinC(t)0ND22.6ND0.1ND22.6ND0.528.222.55.61.027.222.54.72.026.222.83.45.024.622.71.9Soy Dessert24.622.42.1Soy FlourND22.2NDSoy Burger24.223.40.7SYBR Green ISYBR Green I法测法测
30、GMO GMO 实验结果实验结果 标准曲线生成标准曲线生成y=-0.264x+1.202R2=0.998-0.40-0.200.000.200.400.600.800123456 C(t)Log percent GMOSYBR Green ISYBR Green I法测法测GMOGMO实验结果实验结果 Standards/SampleC(t)%GMO0ND0.1ND0.55.61.04.72.03.45.01.9Soy Dessert2.14.40Soy FlourND 5SYBR Green ISYBR Green I法测法测GMO GMO 实验结果实验结果 讨论讨论用于转基因成分定量生成标
31、准曲线的样品如何设定？用于转基因成分定量生成标准曲线的样品如何设定？v阳性材料与阴性材料按比例混合成为不同转基因百分含量的标准品阳性材料与阴性材料按比例混合成为不同转基因百分含量的标准品v分别提取分别提取DNADNAv紫外分光光度计或荧光酶标测定浓度，稀释至同一浓度紫外分光光度计或荧光酶标测定浓度，稀释至同一浓度SYBR Green ISYBR Green I法测法测GMO GMO 讨论讨论 看两个反应是否具有相同的扩增效率的看两个反应是否具有相同的扩增效率的方法是：方法是：v cDNAcDNA样品在样品在100100倍浓度梯度稀释后倍浓度梯度稀释后扩增产物扩增产物C CT T如何变化如何变化v 斜率绝对值接近于斜率绝对值接近于0 0为保证上述假定成立，即ExA=ExB扩增子长度扩增子长度引物设计引物设计模板纯度、复杂度等模板纯度、复杂度等反应条件反应条件www.tw-谢 谢！
