1、第七章第七章 层析分离技术层析分离技术（7）本章内容本章内容n7.1 层析技术导论层析技术导论 n7.2 凝胶过滤层析凝胶过滤层析n7.3 离子交换离子交换层析层析n7.4 亲和亲和层析层析n7.5 固定金属离子亲和层析固定金属离子亲和层析n7.6 疏水作用层析疏水作用层析n7.7 反相反相层析层析7.7 反相层析反相层析n一、基本原理一、基本原理n二、反相介质的种类二、反相介质的种类n三、特点及用途三、特点及用途n四、影响因素四、影响因素n五五、高效液相色谱简介高效液相色谱简介7.7 反相层析反相层析一、基本原理一、基本原理n反相层析（反相层析（Reversed-phase chromato
2、graphy,RPC）利用）利用非极性的反相介质非极性的反相介质为固定相，为固定相，极性有机溶剂的水溶液为极性有机溶剂的水溶液为流动相，是根据溶质极性（疏水性）的差异进行分离纯流动相，是根据溶质极性（疏水性）的差异进行分离纯化的层析技术。化的层析技术。n反相层析属于分配层析，溶质在固定相（非极性介质）反相层析属于分配层析，溶质在固定相（非极性介质）和流动相之间的分配系数取决于溶质的疏水性：和流动相之间的分配系数取决于溶质的疏水性：n溶质的疏水性越大，其在固定相中的分配系数越大。溶质的疏水性越大，其在固定相中的分配系数越大。n烃类化合物的分配系数与其分子所含碳原子数成正比。烃类化合物的分配系数与
3、其分子所含碳原子数成正比。n当固定相一定时，可通过调节流动相的组成来调整溶质当固定相一定时，可通过调节流动相的组成来调整溶质的分配系数。的分配系数。n流动相的极性越大，溶质的分配系数越大。流动相的极性越大，溶质的分配系数越大。n因此，因此，RPC多采用降低流动相极性（水含量）的线性梯度洗脱多采用降低流动相极性（水含量）的线性梯度洗脱法。法。7.7 反相层析反相层析二、反相介质的种类二、反相介质的种类n反相介质的商品种类繁多，其中最具代表性的是以反相介质的商品种类繁多，其中最具代表性的是以硅硅胶为载体胶为载体，通过硅烷化反应在硅胶表面键和非极性分，通过硅烷化反应在硅胶表面键和非极性分子层。硅烷化
4、反应式如下：子层。硅烷化反应式如下：其中，硅烷化试剂中其中，硅烷化试剂中R1和和R2多为甲基，多为甲基，R为为C4、C8、C18烷基或苯基，一烷基或苯基，一般简称为般简称为C4、C8、C18柱等柱等另外，另外，高分子聚合物高分子聚合物也可作为反相介质，如：也可作为反相介质，如：聚丙烯酸聚丙烯酸酯酯-C-C18187.7 反相层析反相层析三、特点及用途三、特点及用途n一般用非极性固定相（如一般用非极性固定相（如C18、C8）；）；n流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。
5、的有机溶剂以调节保留时间。n为了得到更好的分离效果，有时加入一定浓度的三氟乙酸（为了得到更好的分离效果，有时加入一定浓度的三氟乙酸（TFA）n适用于分离非极性和极性较弱的化合物。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。nRPC主要用于相对分子质量主要用于相对分子质量低于低于5000，特别是，特别是1000以下以下的非极性小分子物质的分的非极性小分子物质的分析和纯化，也可用于蛋白质等生物大分子的分析与纯化。析和纯化，也可用于蛋白质等生物大分子的分析与纯化。n由于反相介质表面为强烈疏水性，并且流动相为低极性的有机溶剂，生物大分子在由于反相介质表面为强烈疏水性，并且流动相为低极性的有机溶剂，生物大分子在
6、RPC过程中容易变性失活。因此，以回收生物活性蛋白为目的时，应注意选择适宜的过程中容易变性失活。因此，以回收生物活性蛋白为目的时，应注意选择适宜的反相介质和流动相。反相介质和流动相。n随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。样品或易解离样品的分析。n为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的pH值。但需要注意的值。但需要注意的是，是，C18和和C8使用的使用的pH值通常为值通常为2.57.5（28），），n太高的太
7、高的pH值会使硅胶溶解，值会使硅胶溶解，n太低的太低的pH值会使键合的烷基脱落。值会使键合的烷基脱落。nRPC在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用应用的的80%左右。左右。7.7 反相层析反相层析三、特点及用途三、特点及用途n相似之处：相似之处：n均是利用不同物质与固定相之间的疏水性作用力不均是利用不同物质与固定相之间的疏水性作用力不同进行色谱分离。同进行色谱分离。n不同之处：不同之处：n固定相的疏水程度不同；固定相的疏水程度不同；n流动相组成不同；流动相组成不同；n操作方式不同；操作方式不同；n应用范围不同。应用范围不同。反
8、相色谱与疏水作用色谱的比较反相色谱与疏水作用色谱的比较7.7 反相层析反相层析四四、反相层析的影响因素、反相层析的影响因素 在反相介质已经确定的情况下，影响反相层析分辨率的因在反相介质已经确定的情况下，影响反相层析分辨率的因素主要包括：流动相的组成、洗脱模式、层析柱尺寸、流素主要包括：流动相的组成、洗脱模式、层析柱尺寸、流速、温度等。速、温度等。1.1.流动相流动相 2.2.洗脱模式洗脱模式 3.3.层析柱的尺寸层析柱的尺寸 4.4.流速流速 5.5.温度温度1.1.流动相流动相n1)1)流动相的组成：流动相中的有机溶剂可降低流动相的极性，流动相的组成：流动相中的有机溶剂可降低流动相的极性，流
9、动相极性越低，其洗脱能力越强，因此洗脱时通常采用的流动相极性越低，其洗脱能力越强，因此洗脱时通常采用的有机溶剂比例会逐渐提高，以使各样品组分按疏水性由弱到有机溶剂比例会逐渐提高，以使各样品组分按疏水性由弱到强的顺序洗脱；强的顺序洗脱；对有机溶剂的要求：对有机溶剂的要求：与水互溶、由较低的紫与水互溶、由较低的紫外吸收及较低黏度（如乙腈、甲醇、乙醇等）。外吸收及较低黏度（如乙腈、甲醇、乙醇等）。n2 2）流动相的）流动相的pHpH值：反相层析的流动相条件多在低值：反相层析的流动相条件多在低pHpH值下值下（pH2-4pH2-4）n层析介质（如硅胶）在高层析介质（如硅胶）在高pHpH下不稳定；下不稳
10、定；n很多组分在低很多组分在低pHpH下具有较好的溶解性；下具有较好的溶解性；n低低pHpH抑制了样品组分中酸性基团及硅胶上硅醇基的解离；抑制了样品组分中酸性基团及硅胶上硅醇基的解离；n为了使流动相保持在低为了使流动相保持在低pHpH下，在流动相中加入酸（下，在流动相中加入酸（如如三氟乙酸三氟乙酸（TFA）。）。2.2.洗脱模式洗脱模式n由于溶质中不同组分的疏水性强弱不同，与固定相由于溶质中不同组分的疏水性强弱不同，与固定相结合的牢固程度不同，在起始条件下，极性很强的结合的牢固程度不同，在起始条件下，极性很强的组分不能结合在固定相上面直接被洗脱，其余组分组分不能结合在固定相上面直接被洗脱，其余
11、组分结合在固定相表面，为了将这些组分洗脱下来，必结合在固定相表面，为了将这些组分洗脱下来，必须降低流动相的极性，即增加流动相中有机溶剂的须降低流动相的极性，即增加流动相中有机溶剂的比例。因此，反相层析的洗脱过程中流动相的组成比例。因此，反相层析的洗脱过程中流动相的组成随时间而变化。随时间而变化。n通常可采用通常可采用阶段洗脱阶段洗脱和和梯度洗脱梯度洗脱。最理想的洗脱条。最理想的洗脱条件是通过多次实验优化后得到的。件是通过多次实验优化后得到的。3.3.层析柱的尺寸层析柱的尺寸n层析柱的尺寸由其内径和柱长所决定，层析柱的尺寸由其内径和柱长所决定，n内径影响层析的规模，但对分辨率没有影内径影响层析的
12、规模，但对分辨率没有影响，响，n柱长对分辨率的影响则与溶质的种类有关。柱长对分辨率的影响则与溶质的种类有关。n对于小分子有机物，增加柱长可以提高柱效改对于小分子有机物，增加柱长可以提高柱效改善分辨率，善分辨率，n而多肽、核酸等生物大分子对柱长的敏感程度而多肽、核酸等生物大分子对柱长的敏感程度较低。较低。4.4.流速流速n流速对于反相层析的影响是多方面的，一般流速对于反相层析的影响是多方面的，一般来说，流速对于小分子的分离影响较大而大来说，流速对于小分子的分离影响较大而大分子对流速变化敏感性较低。分子对流速变化敏感性较低。n通常过高的流速会导致涡流扩散严重，影响通常过高的流速会导致涡流扩散严重，
13、影响样品在固定相和流动相之间的平衡，导致洗样品在固定相和流动相之间的平衡，导致洗脱峰宽度变大分辨率下降；脱峰宽度变大分辨率下降；n但过低的流速可能会导致样品组分纵向扩散但过低的流速可能会导致样品组分纵向扩散加剧，也会使分辨率下降，且分离时间较长，加剧，也会使分辨率下降，且分离时间较长，不利于样品的稳定和较大规模的分离；不利于样品的稳定和较大规模的分离；5.5.温度温度n温度对于反相层析的分离结果有较大温度对于反相层析的分离结果有较大的影响。的影响。n提高温度能够降低流动相的黏度，增提高温度能够降低流动相的黏度，增加传质速度，减少区带变宽现象，从加传质速度，减少区带变宽现象，从而改善分辨率。而改
14、善分辨率。n但是在分离生物大分子的时候必须考但是在分离生物大分子的时候必须考虑到分子的稳定性，因此不宜用太高虑到分子的稳定性，因此不宜用太高的温度。的温度。7.7 反相层析反相层析五五、高效液相色谱简介高效液相色谱简介n1.基本原理基本原理n2.特点特点n3.应用应用n4.高效液相色谱仪的组成高效液相色谱仪的组成n5.HPLC在蛋白分离中的应用及操作规程在蛋白分离中的应用及操作规程n6.HPLC-RPC 在蛋白分离中的应用举例在蛋白分离中的应用举例7.7 反相层析反相层析五五、高效液相色谱简介高效液相色谱简介n高效液相色谱（高效液相色谱（High Performance Liquid Chro
15、matography,HPLC）与经典的色谱法）与经典的色谱法（或层析法）的分离机制类似（或层析法）的分离机制类似混合物在混合物在流动相和固定相之间的流动相和固定相之间的分配系数不同，分配系数不同，在两在两相中作相对运动时相中作相对运动时,经过反复多次的吸附经过反复多次的吸附-解解吸的分配过程吸的分配过程,各组分在各组分在移动速度上产生较大移动速度上产生较大的差别的差别,被分离成单个组分依次从柱内流出。被分离成单个组分依次从柱内流出。1.基本原理基本原理7.7 反相层析反相层析五五、高效液相色谱简介高效液相色谱简介nHPLC在经典液相色谱的基础上，采用了在经典液相色谱的基础上，采用了高压泵、高
16、高压泵、高效固定相效固定相和和高灵敏度的检测器，高灵敏度的检测器，具有高分辨率、高灵具有高分辨率、高灵敏度、速度快敏度、速度快、自动化程度高等优点、自动化程度高等优点。3.应用应用nHPLC被广泛应用到生物化学、食品分析、医药研究、被广泛应用到生物化学、食品分析、医药研究、环境分析、无机分析等各种领域。高效液相色谱仪与环境分析、无机分析等各种领域。高效液相色谱仪与结构仪器的联用是一个重要的发展方向。结构仪器的联用是一个重要的发展方向。2.特点特点7.7 反相层析反相层析五五、高效液相色谱简介高效液相色谱简介n（1）高压输送系统）高压输送系统n（2）进样系统）进样系统n（3）分离系统）分离系统n
17、（4）检测系统及记录系统）检测系统及记录系统4.高效液相色谱仪的组成高效液相色谱仪的组成7.7 反相层析反相层析五五、高效液相色谱简介高效液相色谱简介n溶剂贮存器溶剂贮存器：贮存流动相（贮存流动相（12L）n高压泵：高压泵：将贮存器中的流动相连续送入色谱系统，使将贮存器中的流动相连续送入色谱系统，使样品在色谱柱中完成分离过程。压力：样品在色谱柱中完成分离过程。压力：042MPa，流，流速：速：0.00110ml/min。n梯度洗脱装置：梯度洗脱装置：通过程序控制混合泵来使流动性的离通过程序控制混合泵来使流动性的离子强度子强度/pH/极性等发生梯度变化，提高分离效果和效极性等发生梯度变化，提高分
18、离效果和效率。率。4.高效液相色谱仪的组成高效液相色谱仪的组成（1）高压输送系统）高压输送系统7.7 反相层析反相层析五五、高效液相色谱简介高效液相色谱简介n六通阀进样器是高效液相色谱系六通阀进样器是高效液相色谱系统中最理想的进样器，它是由圆统中最理想的进样器，它是由圆形形密封垫密封垫(转子转子)和和固定底座固定底座(定子定子)组成。组成。n 工作原理：工作原理：手柄装载手柄装载(Load)位置时，样位置时，样品经微量进样针从进样孔注射进品经微量进样针从进样孔注射进定量环，定量环充满后，多余样定量环，定量环充满后，多余样品从放空孔排出；品从放空孔排出；将手柄转动至进样将手柄转动至进样(Inje
19、ct)位置位置时，阀与液相流路接通，由泵输时，阀与液相流路接通，由泵输送的流动相冲洗定量环，推动样送的流动相冲洗定量环，推动样品进入液相分析柱进行分析。品进入液相分析柱进行分析。4.高效液相色谱仪的组成高效液相色谱仪的组成（2）进样系统）进样系统LoadInject7.7 反相层析反相层析五五、高效液相色谱简介高效液相色谱简介n柱管（柱壳）柱管（柱壳）n材质：材质：玻璃柱、不锈钢柱n柱长及柱内径：柱长及柱内径：n4.6mm150mm/4.6mm250mm（分析柱）n柱内经25mm（制备柱）n固定相（填料）固定相（填料）n类型：类型：凝胶柱凝胶柱、离子交换柱、亲和柱和反相柱。反相柱。n孔径：孔径
20、：根据样品分子量大小选择填料的孔径。分子量越小，孔径要求也越小；反之亦然。n粒径：粒径：5m（标准），3.0 m/3.5 m（短柱）4.高效液相色谱仪的组成高效液相色谱仪的组成（3）分离系统）分离系统7.7 反相层析反相层析五五、高效液相色谱简介高效液相色谱简介n检测器：检测器：n类型：紫外、荧光、电导、类型：紫外、荧光、电导、pHpH等检测器。等检测器。n性能要求：灵敏度高、噪音低、线性范围宽、响应性能要求：灵敏度高、噪音低、线性范围宽、响应快及对温度和流速不敏感等。快及对温度和流速不敏感等。n记录系统记录系统：n样品被分离成单个组分后，依次从柱内流出样品被分离成单个组分后，依次从柱内流出,
21、通过通过检测器时检测器时,样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来或在电脑上显示。数据以图谱形式打印出来或在电脑上显示。4.高效液相色谱仪的组成高效液相色谱仪的组成（4）检测系统及记录系统）检测系统及记录系统7.7 反相层析反相层析五五、高效液相色谱简介高效液相色谱简介n（1）色谱柱的选择：）色谱柱的选择：根据被分离蛋白的性质，选择适当的根据被分离蛋白的性质，选择适当的分离模式分离模式和不和不同规格和性能同规格和性能色谱柱色谱柱。n凝胶色谱凝胶色谱n反相色谱反相色谱n（2）样品液的准备：）样品液的准备：将分析样品转化为适合将分析样品转化为适
22、合HPLC直接进样的样品。直接进样的样品。n样品制备步骤：取材样品制备步骤：取材匀浆匀浆预分离预分离浓缩浓缩溶解溶解n保持蛋白活性的措施：低温操作、添加蛋白酶抑制剂等保持蛋白活性的措施：低温操作、添加蛋白酶抑制剂等n提高蛋白溶解性的措施：适当加入表面活性剂、变性剂等提高蛋白溶解性的措施：适当加入表面活性剂、变性剂等n在进样之前最好用在进样之前最好用0.45m/0.22 m膜过滤。膜过滤。n（3）流动相的选择：流动相的选择：合适的极性、良好的选择性、与检测器匹配。合适的极性、良好的选择性、与检测器匹配。npH的选择：的选择：n梯度洗脱条件的选择梯度洗脱条件的选择n有机改良剂的加入：三氟乙酸（有机改良剂的加入：三氟乙酸（TFA）n流动相的配制：互溶性、微孔膜过滤流动相的配制：互溶性、微孔膜过滤5.HPLC在蛋白分离中的应用及操作规程在蛋白分离中的应用及操作规程7.7 反相层析反相层析五五、高效液相色谱简介高效液相色谱简介6.HPLC-RPC 在蛋白分离中的应用举例在蛋白分离中的应用举例思考题思考题n1.反相层析的基本原理是什么？反相层析的基本原理是什么？n2.分析反相层析与疏水作用层析的区别分析反相层析与疏水作用层析的区别与联系。与联系。n3.高效液相色谱的原理和特点是什么？高效液相色谱的原理和特点是什么？n4.高效液相色谱仪有哪几部分组成？高效液相色谱仪有哪几部分组成？
