1、毕业论文毕业论文蜂王浆中氟喹诺酮类抗生素脱除工艺的研究蜂王浆中氟喹诺酮类抗生素脱除工艺的研究 姓名姓名:汤晓娟汤晓娟 专业：生物工程专业：生物工程 指导教师：何荣军、蔡成岗指导教师：何荣军、蔡成岗 时间时间:2008.12.10:2008.12.10一一.课题研究背景和意义课题研究背景和意义1.11.1 课题研究背景：课题研究背景：蜂王浆有增强免疫力、防癌抗癌、抗衰防老、蜂王浆有增强免疫力、防癌抗癌、抗衰防老、健脑益智、促进生长发育、抗菌消炎、抗辐射、促健脑益智、促进生长发育、抗菌消炎、抗辐射、促进组织再生、增强造血功能、调节血压、防止动脉进组织再生、增强造血功能、调节血压、防止动脉硬化、保护
2、肝脏、催眠、强化性功能以及美容润肤硬化、保护肝脏、催眠、强化性功能以及美容润肤等多方面作用。等多方面作用。其中，尤其值得一提的是在其中，尤其值得一提的是在抗衰防老抗衰防老、延年益延年益寿寿方面的良好作用。但蜂王浆里含有氟喹诺酮类抗方面的良好作用。但蜂王浆里含有氟喹诺酮类抗生素。生素。吸收好吸收好 组织浓度高组织浓度高氟喹诺酮类氟喹诺酮类抗生素的特点抗生素的特点 抗菌谱广抗菌谱广 与其他抗菌药物无交叉与其他抗菌药物无交叉 耐药性耐药性1.21.2 课题研究的意义：课题研究的意义：1.21.2 课题研究的意义：课题研究的意义：氟喹诺酮类残留除了其副作用直接危害人类外氟喹诺酮类残留除了其副作用直接危
3、害人类外,更严重的问题是食品中残留低浓度的药物可能使人更严重的问题是食品中残留低浓度的药物可能使人的致病菌产生耐药性的致病菌产生耐药性,从而使氟喹诺酮类药物对人从而使氟喹诺酮类药物对人类疾病的疗效降低甚至失效类疾病的疗效降低甚至失效,同时使新开发的氟喹同时使新开发的氟喹诺酮类药品的市场周期大大缩短。诺酮类药品的市场周期大大缩短。据相关报道所知，我国某些蜂王浆产品抗生素据相关报道所知，我国某些蜂王浆产品抗生素含量有超标现象含量有超标现象,从而导致产品频遭退货，严重影从而导致产品频遭退货，严重影响了蜂王浆的出口。因此响了蜂王浆的出口。因此,脱除氟喹诺酮类抗生素脱除氟喹诺酮类抗生素是非常重要的！是非
4、常重要的！二二.研究内容研究内容分别采用分别采用溶剂法、离子交换法和印迹法溶剂法、离子交换法和印迹法脱除蜂王浆脱除蜂王浆中氟喹诺酮类抗生素（主要指诺氟沙星、氧氟沙星中氟喹诺酮类抗生素（主要指诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星）；、环丙沙星和恩诺沙星）；评价这几种方法对蜂王浆中有效成分（评价这几种方法对蜂王浆中有效成分（蛋白质蛋白质和和癸癸稀酸稀酸）含量的影响；）含量的影响；三三.研究材料、方法和手段：研究材料、方法和手段：3.1 3.1 研究材料研究材料 3.1.13.1.1原料原料:蜂王浆蜂王浆 3.1.2 3.1.2试剂试剂:磷酸盐缓冲溶液、柠檬酸、甲醇、乙腈、甲苯、甲基丙烯酸磷酸盐缓
5、冲溶液、柠檬酸、甲醇、乙腈、甲苯、甲基丙烯酸 N N，N-N-亚甲基双丙烯酰胺、偶氮二异丁腈、乙醇、盐酸亚甲基双丙烯酰胺、偶氮二异丁腈、乙醇、盐酸 3.1.3 3.1.3仪器：仪器：离心机、离心机、Oasis HLBOasis HLB固相萃取柱、紫外可见分光光度计、固相萃取柱、紫外可见分光光度计、液相色谱仪液相色谱仪、干燥箱、分析天平、酸碱滴定管、有机滤膜、干燥箱、分析天平、酸碱滴定管、有机滤膜、3.23.2 研究方法和手段：研究方法和手段：抗生素的脱除的方法：溶剂法、抗生素的脱除的方法：溶剂法、离子交换法、离子交换法、印迹法印迹法抗生素测定方法：液相色谱法抗生素测定方法：液相色谱法 有效成分
6、含量的测定有效成分含量的测定：脂肪和癸烯酸：脂肪和癸烯酸脂肪的测定方法：凯氏定氮法脂肪的测定方法：凯氏定氮法癸烯酸的测定方法：液相色谱法癸烯酸的测定方法：液相色谱法 3.3.2 3.3.2 抗生素的脱除抗生素的脱除溶剂法（乙酸乙酯）溶剂法（乙酸乙酯）加萃取剂加萃取剂蜂王浆蜂王浆混匀充分震荡提取混匀充分震荡提取萃余液萃余液回收有效成分回收有效成分萃取液萃取液合并合并冷冻干燥得产品冷冻干燥得产品离子交换法离子交换法用阴阳离子交换双柱脱除氟喹诺酮类抗生素用阴阳离子交换双柱脱除氟喹诺酮类抗生素 洗脱洗脱 蜂王浆加水稀释蜂王浆加水稀释 用阴或阳离子柱吸附用阴或阳离子柱吸附收集未吸附组分收集未吸附组分冷冻
7、干燥得产品冷冻干燥得产品分级洗脱分级洗脱分部收集分部收集收集已吸附组分收集已吸附组分印迹法印迹法MIPsMIPs模板分子模板分子的制备及提取的制备及提取MIPsMIPs的制备的制备MIPsMIPs吸附性吸附性能的测定能的测定吸附蜂王浆吸附蜂王浆中的抗生素中的抗生素蜂王浆水溶液蜂王浆水溶液离心离心 上清液上清液沉淀物沉淀物蜂王浆蜂王浆回收洗脱回收洗脱MIPsMIPs冷冻干燥得产品冷冻干燥得产品干燥干燥MIpsMIps 3.4 3.4 氟喹诺酮类抗生素含量的测定氟喹诺酮类抗生素含量的测定液相色谱法测定氟喹诺酮类抗生素的含量液相色谱法测定氟喹诺酮类抗生素的含量条件：条件：色谱柱：色谱柱：Alltec
8、h Alltima C18Alltech Alltima C18；柱温为室温；柱温为室温；流动相：柠檬酸（流动相：柠檬酸（0.2 mol/l0.2 mol/l）（甲醇（甲醇 乙腈乙腈=3=3 1 1）=84=84 1616；流速流速1.0 ml/min1.0 ml/min；检测波长：检测波长：275 nm275 nm；进样量：进样量：10 l10 l。3.5 3.5 蛋白质的检测蛋白质的检测凯氏定氮法凯氏定氮法消化消化整流装置的清洗整流装置的清洗蒸馏蒸馏滴定滴定计算：计算：计算：计算：式中式中 X X蜂王浆中蛋白质的含量；蜂王浆中蛋白质的含量；v v1 1滴定试样时滴定试样时0.01 mol/
9、l0.01 mol/l盐酸标准溶液消耗的体积，单位盐酸标准溶液消耗的体积，单位为毫升（为毫升（mlml）；）；v v0 0滴定空白时滴定空白时0.01 mol/l0.01 mol/l盐酸标准溶液消耗的体积，单位盐酸标准溶液消耗的体积，单位为毫升（为毫升（mlml）；）；c c1 1盐酸标准溶液的浓度，单位为摩尔每升（盐酸标准溶液的浓度，单位为摩尔每升（mmol/lmmol/l）；）；14.008 14.008氮的毫摩尔质量，单位为克（氮的毫摩尔质量，单位为克（g g）；）；m m样品的质量，单位为克（样品的质量，单位为克（g g）；）；6.25 6.25氮换算为蛋白质的系数。氮换算为蛋白质的系
10、数。100256255100000814101 .m.c)v(vX3.6 3.6 癸烯酸的测定癸烯酸的测定 用液相色谱法测癸烯酸的含量用液相色谱法测癸烯酸的含量液相色谱条件：液相色谱条件：测定波长：测定波长：210 nm210 nm；柱温度：柱温度：3535；流动相：流动相：CH3OH+0.03mol/l+HCl+H2O=55+10+35CH3OH+0.03mol/l+HCl+H2O=55+10+35 流速：流速：1 ml/min1 ml/min；进样量：进样量：10 l10 l。结果计算：结果计算：式中：式中：X X2 2蜂王浆中癸稀酸的含量，蜂王浆中癸稀酸的含量，%；FF校正因子；校正因子
11、；A Ai i试样中被测组分峰面积；试样中被测组分峰面积；A As s试样中内标物峰面积；试样中内标物峰面积；mms s内标物质量，单位为克（内标物质量，单位为克（g g）；mmi i试样质量，单位为克（试样质量，单位为克（g g）。）。issimmAAFX2四四 实验结果实验结果4.1 4.1 溶剂法溶剂法 溶剂法中用磷酸盐缓冲液脱除出来的抗生溶剂法中用磷酸盐缓冲液脱除出来的抗生素在液相里检测不出来，原因可能是素在液相里检测不出来，原因可能是5 g5 g蜂王浆蜂王浆中的抗生素含量太少了，在液相里面检测不出中的抗生素含量太少了，在液相里面检测不出来，因此初步确定用溶剂法中，在取用来，因此初步确
12、定用溶剂法中，在取用5 g5 g样品样品和本实验条件下，不能对抗生素进行有效检测和本实验条件下，不能对抗生素进行有效检测。4.2 4.2 离子交换法离子交换法 4.2.1 4.2.1 蜂王浆中蛋白质的含量蜂王浆中蛋白质的含量阴离子交换法萃取抗生素：阴离子交换法萃取抗生素：滴定时消耗的滴定时消耗的HClHCl的体积的体积 =（2.05+2.00+2.10/32.05+2.00+2.10/30.12=2.050.12=2.050.050.05 阴离子萃取后的蛋白质含量阴离子萃取后的蛋白质含量%=11.07(=11.07(达标达标)10025.62551000008.14)(101 mcvv1002
13、5.6120201.52551000008.1401058.0)05.005.2(阳离子交换法萃取抗生素：阳离子交换法萃取抗生素：滴定时消耗的滴定时消耗的HClHCl的体积的体积 =（1.35+1.30+1.251.35+1.30+1.25）/3/30.05=1.300.05=1.300.050.05 阳离子萃取后的蛋白质含量阳离子萃取后的蛋白质含量%10025.62551000008.14)(101 mcvv10025.6120201.52551000008.1401058.0)05.030.1(=6.92(=6.92(不达标不达标)4.2.2 蜂王浆中癸稀酸的含量蜂王浆中癸稀酸的含量 原液
14、的液相色谱图原液的液相色谱图 原液的峰面积原液的峰面积%=62.95%=62.95；阴离子交换法处理过的癸稀酸的峰面积阴离子交换法处理过的癸稀酸的峰面积%=17.03(%=17.03(不达标不达标)；阳离子交换法处理过的癸稀酸的峰面积阳离子交换法处理过的癸稀酸的峰面积%=59.21(%=59.21(达标达标)。4.2.3 4.2.3 结论结论 阴阳离子交换法萃取抗生素的过程中，蜂王浆阴阳离子交换法萃取抗生素的过程中，蜂王浆过阳离子交换柱，过柱后对癸烯酸的影响较小，而过阳离子交换柱，过柱后对癸烯酸的影响较小，而蛋白质的量损失大，并且不能达到标准；蜂王浆过蛋白质的量损失大，并且不能达到标准；蜂王浆
15、过阴离子交换柱，过柱后癸稀酸的量损失较大也不能阴离子交换柱，过柱后癸稀酸的量损失较大也不能达到标准，相对蛋白质的影响较小。这两种方法对达到标准，相对蛋白质的影响较小。这两种方法对蜂王浆的有效成分蛋白质和癸稀酸的影响各有侧重蜂王浆的有效成分蛋白质和癸稀酸的影响各有侧重，因此我们不能用阴阳离子交换的方法脱除抗生素，因此我们不能用阴阳离子交换的方法脱除抗生素。4.3 4.3 印迹法印迹法 y=118.99x y=118.99x，R2=0.9976R2=0.9976。0.05 g/l0.05 g/l的诺氟沙星水溶液被的诺氟沙星水溶液被MIPsMIPs吸附后，测得的吸附后，测得的UV=0.998UV=0
16、.998，即，即y=0.998y=0.998，根据公式求，根据公式求的的x=0.008387x=0.008387。所以诺氟沙星被吸附的量。所以诺氟沙星被吸附的量=（0.050.054x4x）101010-3=0.164510-3=0.164510-3 g=0.1645 mg10-3 g=0.1645 mg，即干燥的，即干燥的1.5 g 1.5 g MIPsMIPs能吸附诺氟沙星能吸附诺氟沙星0.1645 mg0.1645 mg。4.3.1 MIPs4.3.1 MIPs对抗生素的吸附对抗生素的吸附诺氟沙星诺氟沙星-UV-UV标准图标准图4.3.24.3.2蜂王浆中抗生素的脱除情况蜂王浆中抗生素的
17、脱除情况 T=14min16minT=14min16min为抗生素诺氟沙星的出峰的时间，左图为蜂王为抗生素诺氟沙星的出峰的时间，左图为蜂王浆吸附前的液相色谱图，诺氟沙星的峰面积浆吸附前的液相色谱图，诺氟沙星的峰面积A5=51.69A5=51.69；右图为；右图为蜂王浆吸附后的液相色谱图，诺氟沙星峰面积蜂王浆吸附后的液相色谱图，诺氟沙星峰面积A=20.59A=20.59，通过，通过比较可以明显的发现诺氟沙星的量减少了，这也说明比较可以明显的发现诺氟沙星的量减少了，这也说明MIPsMIPs对蜂对蜂王浆中的氟喹诺酮类抗生素确实也有吸附作用。王浆中的氟喹诺酮类抗生素确实也有吸附作用。4.3.3 4.3
18、.3 蜂王浆中蛋白质的含量蜂王浆中蛋白质的含量 蜂王浆先进行离心再进行抗生素脱除，蛋白蜂王浆先进行离心再进行抗生素脱除，蛋白质含量基本上没有多大变化。计算同质含量基本上没有多大变化。计算同4.1.24.1.2。蜂王浆中蛋白质总含量蜂王浆中蛋白质总含量%=16.39;%=16.39;离心后上清蛋白质含量离心后上清蛋白质含量%=2.29%=2.29；剩余蜂王浆的蛋白质含量剩余蜂王浆的蛋白质含量%=16.39%=16.392.29=14.10 2.29=14.10(达标达标)。4.3.4 4.3.4 蜂王浆中癸稀酸的含量蜂王浆中癸稀酸的含量 癸稀酸的出峰时间在癸稀酸的出峰时间在6.1min6.1mi
19、n左右，左图为蜂王浆吸附前的左右，左图为蜂王浆吸附前的液相色谱图，癸稀酸的峰面积液相色谱图，癸稀酸的峰面积A%=62.95A%=62.95；右图为蜂王浆吸附；右图为蜂王浆吸附后的液相色谱图，癸稀酸的峰面积后的液相色谱图，癸稀酸的峰面积A%=53.71A%=53.71，通过比较，我，通过比较，我们发现癸稀酸的量基本上没有多大变化，因此我们认为们发现癸稀酸的量基本上没有多大变化，因此我们认为MIPsMIPs脱除蜂王浆中抗生素对癸稀酸没有影响。脱除蜂王浆中抗生素对癸稀酸没有影响。4.3.5 4.3.5 结论结论 印迹法中用印迹法中用MIPsMIPs除蜂王浆中氟喹诺酮类抗除蜂王浆中氟喹诺酮类抗生素的效
20、果明显，而且对蜂王浆中的有效成分癸生素的效果明显，而且对蜂王浆中的有效成分癸烯酸和蛋白质都没有太大的影响。该聚合物具有烯酸和蛋白质都没有太大的影响。该聚合物具有热稳定性强、机械稳定性高、可以长期使用的优热稳定性强、机械稳定性高、可以长期使用的优点，可将其用作固相萃取剂，识别并分离富集食点，可将其用作固相萃取剂，识别并分离富集食品中的诺氟沙星。品中的诺氟沙星。五五 总结总结溶剂法：溶剂法：在取用在取用5 g5 g样品和本实验条件下，不能对抗样品和本实验条件下，不能对抗生素进行有效检测。生素进行有效检测。阴阳离子交换法：阴阳离子交换法：这两种方法对蜂王浆的有效成分蛋白质和癸这两种方法对蜂王浆的有效成分蛋白质和癸稀酸的影响各有侧重，因此我们不能用阴阳离子稀酸的影响各有侧重，因此我们不能用阴阳离子交换的方法脱除抗生素。交换的方法脱除抗生素。印迹法印迹法:用用MIPsMIPs除蜂王浆中氟喹诺酮类抗生素的效除蜂王浆中氟喹诺酮类抗生素的效果明显，而且对蜂王浆中的有效成分癸烯酸和蛋果明显，而且对蜂王浆中的有效成分癸烯酸和蛋白质都没有太大的影响。因此我们决定用印迹法白质都没有太大的影响。因此我们决定用印迹法脱除蜂王浆中的氟喹诺酮类抗生素。脱除蜂王浆中的氟喹诺酮类抗生素。The end!Thank you！
