1、 第十三章第十三章 PCRPCR基因扩增仪器基因扩增仪器(polymerase chain reaction Gene Amplifier)1内容提要内容提要1.PCR基因扩增仪的工作原理基因扩增仪的工作原理 PCR技术的原理及发展技术的原理及发展 PCR基因扩增仪的工作原理基因扩增仪的工作原理 2.PCR扩增仪的分类与结构扩增仪的分类与结构 定性定性PCR扩增仪扩增仪实时荧光定量实时荧光定量PCR扩增仪扩增仪 3.PCR扩增仪的性能指标、操作规程及常见故障的扩增仪的性能指标、操作规程及常见故障的排除排除 PCR扩增仪的性能指标扩增仪的性能指标PCR扩增仪的操作规程扩增仪的操作规程PCR扩增仪
2、常见故障的排除扩增仪常见故障的排除 4.PCR扩增仪的应用扩增仪的应用2第一节第一节 PCR基因扩增仪工作原理基因扩增仪工作原理 一、一、PCR技术的历史发展及原理技术的历史发展及原理 v聚合酶链反应聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)是一是一种种体外体外DNA扩增扩增技术。在它发明以前，对于检测对象浓技术。在它发明以前，对于检测对象浓度非常低的标本，人们没有办法用常规方法测定。度非常低的标本，人们没有办法用常规方法测定。1971年，年，Kleppe等人首次在文章中准确、客观地阐述等人首次在文章中准确、客观地阐述了了PCR方法。方法。1985年，美国年，美
3、国PE-Cetus公司的公司的Kary Mullis等人发明等人发明PCR技术。技术。它推动了现代医学由细胞水它推动了现代医学由细胞水平向分子水平、基因水平发展，是平向分子水平、基因水平发展，是DNA测序的基础，它测序的基础，它成为现代分子生物学发展过程中的一座里程碑。成为现代分子生物学发展过程中的一座里程碑。3PCR技术是在试管中技术是在试管中（体外）给（体外）给DNA的合的合成提供一种合适条件成提供一种合适条件-模板模板DNA、dNTP、寡核苷酸引物、寡核苷酸引物、DNA聚合酶、合适的缓冲聚合酶、合适的缓冲体系，及让体系，及让DNA变性、变性、复性及延伸的温度和复性及延伸的温度和时间，使时
4、间，使DNA能够体能够体外复制。外复制。Mullis等因等因此项技术获得此项技术获得1993年年诺贝尔奖。诺贝尔奖。4vPCR原理及其步骤原理及其步骤：加热使双链：加热使双链DNA解开解开螺旋，在退火温度条件下加入的引物同模螺旋，在退火温度条件下加入的引物同模板板DNA杂交，在杂交，在Taq DNA聚合酶、聚合酶、dNTPs、Mg2+和合适和合适pH缓冲液存在条件下延伸引物，缓冲液存在条件下延伸引物，重复重复“变性变性退火退火引物延伸引物延伸”过程至过程至25-40个循环，待测样本中的核酸拷贝数呈指个循环，待测样本中的核酸拷贝数呈指数级扩大。数级扩大。5其过程其过程1：加热变性：加热变性 加热
5、（通常加热（通常93左右）可将双链左右）可将双链DNA分为两条分为两条单链，称之为单链，称之为“变性变性”。因为连接碱基之间的氢键较弱，它们在高温下因为连接碱基之间的氢键较弱，它们在高温下断裂，而脱氧核糖和磷酸之间的共价键结合力较强，断裂，而脱氧核糖和磷酸之间的共价键结合力较强，在高温下保持不变。在高温下保持不变。6过程过程2 退火，引物与靶序列结合退火，引物与靶序列结合v引物是短的、人工合成的单链引物是短的、人工合成的单链DNA序列，有序列，有20-30个碱基，具有标记的个碱基，具有标记的5端，便于下一步检测。它们端，便于下一步检测。它们对于待扩增的靶核酸是特异的。对于待扩增的靶核酸是特异的
6、。PCR反应需有两条反应需有两条引物，每一条都与变性过程中产生的引物，每一条都与变性过程中产生的DNA单链互补。单链互补。v退火温度：通常在退火温度：通常在40-65进行，视引物的长度和进行，视引物的长度和碱基序列而定。这样保证了引物与靶序列退火结合碱基序列而定。这样保证了引物与靶序列退火结合的高度特异性。的高度特异性。注意：注意：PCR反应并不是复制整个反应并不是复制整个DNA链，而是复制链，而是复制某一段生物体特异的某一段生物体特异的100-600个碱基对的靶序列。个碱基对的靶序列。78过程过程3：延伸：延伸v一旦引物与互补一旦引物与互补DNA序列退火，温度即提高至近序列退火，温度即提高至
7、近72，Taq DNA聚合酶被用于复制聚合酶被用于复制DNA链。链。Taq DNA聚合酶是一种来源于嗜热水生菌（聚合酶是一种来源于嗜热水生菌（Thermus aquaticus）的重组的热稳定的）的重组的热稳定的DNA聚合酶，与一聚合酶，与一般聚合酶不同的是在高温状态仍具有活性。般聚合酶不同的是在高温状态仍具有活性。Taq DNA聚合酶在引物标记的地方开始合成。它使溶液聚合酶在引物标记的地方开始合成。它使溶液中自由的互补核苷酸（中自由的互补核苷酸（dNTPs）的掺入和结合，合）的掺入和结合，合成与目标成与目标DNA区域原始双链一样的新的双链区域原始双链一样的新的双链DNA分分子。子。延伸通常起
8、始于引物的延伸通常起始于引物的3端，从而使得单链变端，从而使得单链变为双链。为双链。Taq DNA聚合酶特定地从聚合酶特定地从5端到端到3端合成。端合成。因此，溶液中的自由的核苷酸仅加于引物的因此，溶液中的自由的核苷酸仅加于引物的3端，端，形成靶形成靶DNA序列的互补链。序列的互补链。91030次循环后靶序列扩增的数量次循环后靶序列扩增的数量-（10亿）亿）11二、二、PCR核酸扩增仪工作原理与控温方式核酸扩增仪工作原理与控温方式v在在PCR反应中需以变性、退火、延伸三种温度为一反应中需以变性、退火、延伸三种温度为一个循环，因此，设计个循环，因此，设计PCR基因扩增仪就要能精确控基因扩增仪就要
9、能精确控制温度，这对制温度，这对PCR反应十分关键。反应十分关键。vTaq DNA聚合酶的应用大大提高了聚合酶的应用大大提高了PCR的效率，无的效率，无需在需在PCR反应过程中反复加入新鲜酶。反应过程中反复加入新鲜酶。Taq DNA聚聚合酶酶促反应最适温度为合酶酶促反应最适温度为7075。v最早的最早的PCR是是利用大肠杆菌利用大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I I的的Klenow片段进行核酸扩增。问题是该酶不耐热，当样品置片段进行核酸扩增。问题是该酶不耐热，当样品置于高温于高温(9495)条件下时不可逆失活，故在退火条件下时不可逆失活，故在退火及延伸时，需再向反应液中加入新鲜酶以供扩增所及延伸时，
10、需再向反应液中加入新鲜酶以供扩增所需，相当繁琐。需，相当繁琐。12PCRPCR仪温度控制仪温度控制，有，有：水浴锅控温水浴锅控温 压缩机控温压缩机控温 半导体控温半导体控温 离心式空气加热控温离心式空气加热控温 PCR温度控制重要性：温度控制重要性：从从PCR反应基本原理可知，反应基本原理可知，基因扩增仪工作关键是温度基因扩增仪工作关键是温度控制控制。13水浴锅控温水浴锅控温v以不同温度的以不同温度的水浴锅水浴锅串联成一个控温体系。串联成一个控温体系。v样品与水直接无缝接触，控温准确，温度均样品与水直接无缝接触，控温准确，温度均一性好，无边缘效应。一性好，无边缘效应。v体积大，自动化程度不高，
11、需人为干预，更体积大，自动化程度不高，需人为干预，更换水浴锅时控温不稳定。换水浴锅时控温不稳定。14压缩机控温压缩机控温v由由压缩机压缩机自动控温，金属导热，控温较水浴锅方便，自动控温，金属导热，控温较水浴锅方便，一台机器便可完成整个一台机器便可完成整个PCR流程。但流程。但 压缩机故障率压缩机故障率高，边缘效应及温度高，边缘效应及温度overshooting现象严重。现象严重。vovershooting：升温过程中，由于一些加热元件，升温过程中，由于一些加热元件，比如半导体、金属块比如半导体、金属块本身会积蓄能量本身会积蓄能量，虽然温度探，虽然温度探头探测温度到达了设定温度，但这些积蓄的能量
12、仍头探测温度到达了设定温度，但这些积蓄的能量仍然会传给然会传给PCR体系，造成体系，造成实际的温度高于设定的温实际的温度高于设定的温度的现象度的现象。15半导体控温半导体控温v由由半导体半导体自动控温，金属导热，控温方便，自动控温，金属导热，控温方便，体积小，相对稳定性好。体积小，相对稳定性好。v缺点：仍缺点：仍有边缘效应有边缘效应，温度均一性尚有欠缺，温度均一性尚有欠缺，各孔扩增效率可能不一致，也存在温度各孔扩增效率可能不一致，也存在温度overshooting现象。现象。16离心式空气加热控温离心式空气加热控温v由金属由金属线圈加热线圈加热，采用，采用空气空气作为导热媒介，作为导热媒介，温
13、度均一性好，各孔扩增效率高度一致温度均一性好，各孔扩增效率高度一致v满足荧光定量满足荧光定量PCR的高要求，直接发展为离的高要求，直接发展为离心式的定量心式的定量PCR仪。仪。17第二节第二节 PCR扩增仪的分类与结构扩增仪的分类与结构一、一、PCRPCR扩增仪的种类扩增仪的种类 普通普通PCRPCR扩增仪扩增仪 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR扩增仪扩增仪 梯度梯度PCRPCR仪仪 原位原位PCRPCR仪仪 18一、一、普通定性普通定性PCR扩增仪扩增仪v特点特点 变温快、时间准、温度均一，目变温快、时间准、温度均一，目前国内仍有应用。仪器一般由三个不同前国内仍有应用。仪器一般由三个不同
14、温度的水浴槽和机械臂组成，采用半导温度的水浴槽和机械臂组成，采用半导体传感技术、电子技术和计算机技术进体传感技术、电子技术和计算机技术进行水浴温度的测量、显示和控制，并经行水浴温度的测量、显示和控制，并经计算机控制由机械臂完成样品在每个水计算机控制由机械臂完成样品在每个水浴槽的置放以及槽间的移动。浴槽的置放以及槽间的移动。19v1水浴式水浴式PCR仪仪 一般由三个不同温度的水浴槽一般由三个不同温度的水浴槽和机械臂组成，采用半导体传感技术、电子技术和机械臂组成，采用半导体传感技术、电子技术和计算机技术进行水浴温度的测量、显示和控制，和计算机技术进行水浴温度的测量、显示和控制，并经计算机控制由机械
15、臂完成样品在每个水浴槽并经计算机控制由机械臂完成样品在每个水浴槽的置放以及槽间的移动。此类的置放以及槽间的移动。此类PCR仪体积较大，仪体积较大，但变温快、时间准、温度均一，目前国内应用较但变温快、时间准、温度均一，目前国内应用较少。少。v2 2、变温金属块式、变温金属块式PCRPCR仪仪：中心是由铝块或不锈钢：中心是由铝块或不锈钢制成的热槽，上有不同数目甚至不同规格的凹孔，制成的热槽，上有不同数目甚至不同规格的凹孔，用来放置样品管。一般用来放置样品管。一般通过半导体加热和冷却，通过半导体加热和冷却，并由微机控制恒温和冷热处理过程并由微机控制恒温和冷热处理过程。装置比较牢。装置比较牢固耐用，温
16、度变换平稳，有利于保持固耐用，温度变换平稳，有利于保持Taq DNATaq DNA聚合聚合酶的活性。酶的活性。20v3、变温气流式、变温气流式PCR仪仪 这类仪器由机壳、热源、这类仪器由机壳、热源、冷空气泵、控制器及辅助元件等组成。热源由电阻冷空气泵、控制器及辅助元件等组成。热源由电阻元件和吹风机组成，形成热空气枪借空气作为热传元件和吹风机组成，形成热空气枪借空气作为热传播媒介，由大功率风扇及制冷设备提供外部冷空气播媒介，由大功率风扇及制冷设备提供外部冷空气制冷，精确的温度传感器构成不同的温度循环。该制冷，精确的温度传感器构成不同的温度循环。该仪器不用金属精密加工，成本较低；整个系统没有仪器不
17、用金属精密加工，成本较低；整个系统没有液体流动及制冷剂，安全程度高。液体流动及制冷剂，安全程度高。PCR仪配上微机仪配上微机和软件，可灵活编程。和软件，可灵活编程。21v4梯度梯度PCR仪仪 由普通由普通PCR仪衍生出的具温度梯仪衍生出的具温度梯度功能的度功能的PCR核酸扩增仪。使用梯度核酸扩增仪。使用梯度PCR仪，多仪，多种变性温度和延伸温度可在一台扩增仪上同时完种变性温度和延伸温度可在一台扩增仪上同时完成，既节省实验时间、提高实验效率，又节约实成，既节省实验时间、提高实验效率，又节约实验成本。验成本。PCR反应能否成功，退火温度是关键，反应能否成功，退火温度是关键，虽然有各种各样的虽然有各
18、种各样的PCR引物设计软件或者经验公引物设计软件或者经验公式计算最合适的退火温度，可是模板中碱基的组式计算最合适的退火温度，可是模板中碱基的组合千变万化，经验公式得到的数据不一定都合适。合千变万化，经验公式得到的数据不一定都合适。梯度梯度PCR仪每个孔的温度可以在指定范围内按照仪每个孔的温度可以在指定范围内按照梯度设置，根据扩增结果，一步就可以摸索出最梯度设置，根据扩增结果，一步就可以摸索出最适反应条件。适反应条件。22v5原位原位PCR仪仪 即即在细胞内进行在细胞内进行PCR扩增扩增，而，而组织细胞的形态不被破坏，它是原位杂交与组织细胞的形态不被破坏，它是原位杂交与PCR技术的结合。以往手工
19、方法操作复杂，扩增效果技术的结合。以往手工方法操作复杂，扩增效果及实验结果重复性均不理想。原位及实验结果重复性均不理想。原位PCR仪以其创仪以其创新的设计，比较好地解决了这些问题。新的设计，比较好地解决了这些问题。v原位原位PCR仪与普通仪与普通PCR仪的区别在于，其样品基仪的区别在于，其样品基座上有若干平行的铝槽，每条铝槽内可垂直放置座上有若干平行的铝槽，每条铝槽内可垂直放置一张载玻片，每张载玻片面均与铝槽紧密接触，一张载玻片，每张载玻片面均与铝槽紧密接触，温度传导极佳，控温很精确。目前也有在普通温度传导极佳，控温很精确。目前也有在普通PCR仪上增加原位仪上增加原位PCR模块的，就可以进行原
20、位模块的，就可以进行原位PCR扩增。不少厂家的扩增。不少厂家的PCR仪都可以提供原位适仪都可以提供原位适配器，配有支持原位配器，配有支持原位PCR模块的模块的PCR仪可以一机仪可以一机两用，比较经济。两用，比较经济。23（二）（二）实时荧光定量实时荧光定量PCR扩增仪扩增仪v荧光实时定量荧光实时定量PCR技术技术（real-time quantitative PCR,RQ-PCR）是在是在PCR反应体系中加入特异反应体系中加入特异性的荧光染料或探针，荧光信号的变化真实地反性的荧光染料或探针，荧光信号的变化真实地反映了体系中模板的增加，通过检测荧光信号，从映了体系中模板的增加，通过检测荧光信号，
21、从而实时监测整个而实时监测整个PCR反应过程，最后通过标准曲反应过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。线对未知模板进行定量分析。v定量定量PCR仪通常由两部分组成，即仪通常由两部分组成，即PCR系统和荧系统和荧光检测系统。目前的主流是多色多通道检测，通光检测系统。目前的主流是多色多通道检测，通道及适用荧光素越多，仪器的适用范围就越宽。道及适用荧光素越多，仪器的适用范围就越宽。24TaqMan实时荧光定量实时荧光定量PCR原理原理25261、金属板式实时定量、金属板式实时定量PCR仪仪v 即传统的即传统的9696孔板式定量孔板式定量PCRPCR仪，由第三代的半导体仪，由第三代的半导体PC
22、RPCR仪发展而来。在原有仪发展而来。在原有PCRPCR仪的基础上，增加荧光仪的基础上，增加荧光激发和检测模块，升级为荧光定量激发和检测模块，升级为荧光定量PCRPCR仪。仪。v ABI 7500ABI 7500型荧光定量型荧光定量PCRPCR仪的激发光源为卤钨仪的激发光源为卤钨灯，与灯，与5 5色滤光镜配合，可同时激发色滤光镜配合，可同时激发9696个样品；个样品；v检测器为超低温检测器为超低温CCDCCD成像系统，可同时多点多色检成像系统，可同时多点多色检测，能有效分辨测，能有效分辨FAM/SYBR GreenIFAM/SYBR GreenI、VIC/JOEVIC/JOE、NED/TAMR
23、A/Cy3NED/TAMRA/Cy3等多种荧光染料。等多种荧光染料。v随机配置的定量随机配置的定量PCRPCR引物和探针设计软件引物和探针设计软件Primer Primer ExpressExpress可以设计定量可以设计定量PCRPCR所需的所需的TaqManTaqMan探针。探针。27v各型号均有实时动态和终点读板各型号均有实时动态和终点读板(Plate Read)两种两种模式，实时动态模式能动态显示模式，实时动态模式能动态显示PCR扩增曲线的生扩增曲线的生成，成，定量线性范围大于定量线性范围大于9个数量级，区分个数量级，区分5000和和10000个拷贝的个拷贝的DNA模板可信度可达模板可
24、信度可达99.7%，用于，用于定量定量DNA或或RNA拷贝数。拷贝数。v终点读板模式可用于点突变检测、单核苷酸多态性终点读板模式可用于点突变检测、单核苷酸多态性(SNP)分析、基因型鉴定等。分析、基因型鉴定等。v增强的增强的7900型在型在96孔模块的基础上可更换孔模块的基础上可更换384孔模孔模块，大大增强仪器高通量处理数据的能力。该类仪块，大大增强仪器高通量处理数据的能力。该类仪器还可作为普通器还可作为普通PCR仪使用，有的甚至带梯度功能，仪使用，有的甚至带梯度功能，可容纳的样本量大，无需特殊耗材。可容纳的样本量大，无需特殊耗材。v缺点缺点 温度均一性欠佳，有边缘效应，标准曲线的温度均一性
25、欠佳，有边缘效应，标准曲线的反应条件难以做到与样品完全一致。反应条件难以做到与样品完全一致。28ABI 7500荧光定量荧光定量PCR仪仪 MJ公司公司Chromo 4荧光定量荧光定量PCR仪仪 Bio-rad公司公司iCycler荧光定量荧光定量PCR仪仪 292、离心式实时定量、离心式实时定量PCR仪仪v它为满足定量它为满足定量PCR对温度的高要求而设计，克服了孔板式对温度的高要求而设计，克服了孔板式PCR仪固有的温度均一性较差的问题。仪固有的温度均一性较差的问题。v它的扩增样品槽被设计为离心转子的模样，借助空气加热，它的扩增样品槽被设计为离心转子的模样，借助空气加热，以空气为加热介质，实
26、现与反应体系无缝接触，以空气为加热介质，实现与反应体系无缝接触，加热均匀，加热均匀，接触面积大。转子在腔内旋转，每个孔均等位，使每个样接触面积大。转子在腔内旋转，每个孔均等位，使每个样品孔间的温度差小于品孔间的温度差小于0.01，保障了标准曲线和样品之，保障了标准曲线和样品之间反应条件的一致性。间反应条件的一致性。v仪器激发光源大多采用使用寿命较长的发光二极管仪器激发光源大多采用使用寿命较长的发光二极管(light-emitting diode，LED)冷光源，冷光源，运行前无需预热，无需校运行前无需预热，无需校正。由于样品置于转子上可移动，所以仪器使用同一个激正。由于样品置于转子上可移动，所
27、以仪器使用同一个激发光源和检测器，随时检测旋转到跟前的样品，有效减少发光源和检测器，随时检测旋转到跟前的样品，有效减少系统误差，定量线性范围可达系统误差，定量线性范围可达10个数量级。个数量级。v但这类仪器离心转子小，可容纳样品量少，有的需用特殊但这类仪器离心转子小，可容纳样品量少，有的需用特殊毛细管作样品管，增加了使用成本，毛细管作样品管，增加了使用成本，也不带梯度功能。也不带梯度功能。30Rotor-Gene 3000荧光定量荧光定量PCR仪仪 Light CycleTM荧光定量荧光定量PCR仪仪 31Light CycleTM荧光定量荧光定量PCR仪结构示意图仪结构示意图 323、各孔独
28、立控温的定量、各孔独立控温的定量PCR仪仪v 这种定量这种定量PCR仪仪设计非常独到，不同样品槽分别设计非常独到，不同样品槽分别拥有独立的智能升降温模块，各孔独立控温，适合拥有独立的智能升降温模块，各孔独立控温，适合多指标快速检测，但目前在国内应用尚少。多指标快速检测，但目前在国内应用尚少。v 仪器有仪器有16个样品槽，每个温控模块控制一个样品个样品槽，每个温控模块控制一个样品槽，可以在同一台定量槽，可以在同一台定量PCR仪上分别进行不同条件仪上分别进行不同条件的定量的定量PCR反应，随时利用空置的样品槽开始其他反应，随时利用空置的样品槽开始其他定量反应，使用效率非常高。定量反应，使用效率非常
29、高。v 升降温速度高达升降温速度高达10s，控温精度也高。每个，控温精度也高。每个模块独立控制的激发光源和检测器直接与反应管壁模块独立控制的激发光源和检测器直接与反应管壁接触，保证荧光激发和检测不受外界干扰。接触，保证荧光激发和检测不受外界干扰。v33v该仪器整合成该仪器整合成4通道光学检测系统，能有效分辨通道光学检测系统，能有效分辨FAM/SYBR Green I、Tet/Cy3、Texas Red和和Cy5等多种荧光染料，可对同一样品进行多靶点分析，等多种荧光染料，可对同一样品进行多靶点分析，同时检测四种荧光信号。同时检测四种荧光信号。v可使用可使用Taqman探针、分子信标、探针、分子信
30、标、Amplifluor引物引物等多种检测方法，定量线性范围可达等多种检测方法，定量线性范围可达9个数量级。个数量级。v其软件允许一台仪器同时操作六个样品模块，既满其软件允许一台仪器同时操作六个样品模块，既满足高速批量要求，又能灵活运用，还可实现任意梯足高速批量要求，又能灵活运用，还可实现任意梯度反应。度反应。v不足不足 上样不如传统方法方便，需要独特的扁平反上样不如传统方法方便，需要独特的扁平反应管，成本高。应管，成本高。34SmartCycler荧光定量荧光定量PCR仪仪 35第三节第三节 PCR扩增仪的性能指标、扩增仪的性能指标、操作规程及常见故障的排除操作规程及常见故障的排除 一、一、
31、PCR扩增仪的性能指标扩增仪的性能指标 （一）温度控制（一）温度控制 它是它是PCR反应能否成功的关键。包括：反应能否成功的关键。包括：1、温度的准确性温度的准确性：指样品孔温度与设定温度的一致指样品孔温度与设定温度的一致性。性。PCR是一个指数级扩增的过程，不论是变性、退是一个指数级扩增的过程，不论是变性、退火还是延伸都需要准确控制温度，尤其是退火温度。火还是延伸都需要准确控制温度，尤其是退火温度。扩增过程中退火温度的细微变化会被放大，直接影响扩增过程中退火温度的细微变化会被放大，直接影响结果。结果。v 对对PCR扩增仪而言温度控制就意味着质量扩增仪而言温度控制就意味着质量。362、温度的均
32、一性温度的均一性：是指样品孔间的温度差异，关系到不同样品孔之间反是指样品孔间的温度差异，关系到不同样品孔之间反应结果的一致性。应结果的一致性。实验过程中有这样的情况：用同样实验过程中有这样的情况：用同样的样品，同样的的样品，同样的PCR反应程序，最后的结果差异非常反应程序，最后的结果差异非常明显，这就可能是因为不同样品孔的温度不均一性所明显，这就可能是因为不同样品孔的温度不均一性所致。如果致。如果PCR仪的温度均一性不佳，会影响实验结果，仪的温度均一性不佳，会影响实验结果，尤其是最外周的样品孔，即位置尤其是最外周的样品孔，即位置“边缘效应边缘效应”影响结影响结果重复性。果重复性。上图为同一个标
33、本重复测定上图为同一个标本重复测定96次的扩增曲线均一性例子次的扩增曲线均一性例子373、升降温的速度升降温的速度：v升降温速度快，可以提高工作效率，提高升降温速度快，可以提高工作效率，提高PCR反应反应特异性，降低非特异性特异性，降低非特异性。所以目前。所以目前PCR扩增仪的温扩增仪的温控方式已经从以前相对稳定耐用的压缩机转向了升控方式已经从以前相对稳定耐用的压缩机转向了升降温速度更快的半导体。降温速度更快的半导体。v此外，制作承托样品管的基座模块材料的导热性也此外，制作承托样品管的基座模块材料的导热性也影响升降温速度。例如，有升降温速度高达影响升降温速度。例如，有升降温速度高达5s的银质镀
34、金基座，还有升降温速度可达的银质镀金基座，还有升降温速度可达6s和和4.5s的银质模块。的银质模块。v由于样品管与基座接触的紧密性、基座的导热性、由于样品管与基座接触的紧密性、基座的导热性、邻近样品管的相互影响都会影响样品的实际升降温邻近样品管的相互影响都会影响样品的实际升降温速度速度。所以仪器的升降温速度和样品管中样品的升所以仪器的升降温速度和样品管中样品的升降温速度并非一回事。降温速度并非一回事。38v目前目前PCR仪一般都具有模块温控模式仪一般都具有模块温控模式(block-control)和反应管温控模式和反应管温控模式(tube-control)。前者，前者，是仪器控制承载样品的金属
35、基座温度，它由探测是仪器控制承载样品的金属基座温度，它由探测器直接探测基座，器直接探测基座，该模式适用于长时间的静态孵该模式适用于长时间的静态孵育，如连接、酶切、去磷酸化等。育，如连接、酶切、去磷酸化等。后者，后者，是仪器是仪器对对样品管内或样品管内或PCR板孔内样品液的温度来进行控板孔内样品液的温度来进行控制制，由计算机在反应管温控模式下根据探测器所，由计算机在反应管温控模式下根据探测器所探测到的温控模块的温度计算出探测到的温控模块的温度计算出。后者一般更准。后者一般更准确确，因为反应管温控模式精确的算法能自动补偿，因为反应管温控模式精确的算法能自动补偿时间，确保反应混合物按照程序设定的时间
36、维持时间，确保反应混合物按照程序设定的时间维持预设温度，适合各种类型的反应管。预设温度，适合各种类型的反应管。394、不同模式下的相同温度特性不同模式下的相同温度特性：v主要针对梯度主要针对梯度PCR仪而言。现在的仪而言。现在的PCR仪已可以仪已可以进行不同功能模式的转换。带梯度功能的进行不同功能模式的转换。带梯度功能的PCR仪，仪，不仅考虑梯度模式下不同梯度管间温度的均一性不仅考虑梯度模式下不同梯度管间温度的均一性和准确性，还考虑仪器在梯度模式和标准模式下和准确性，还考虑仪器在梯度模式和标准模式下是否具有同样的温度特性。否则可能导致在梯度是否具有同样的温度特性。否则可能导致在梯度模式下得到最
37、佳反应条件，并以此条件在标准模模式下得到最佳反应条件，并以此条件在标准模式下单独做，但结果却不如人意。式下单独做，但结果却不如人意。v现在已能以同样的温度变化速率到达所有设定的现在已能以同样的温度变化速率到达所有设定的梯度温度，因而在梯度模式下具有恒定的温度，梯度温度，因而在梯度模式下具有恒定的温度，保证在梯度模式和标准模式下相同的温度特性。保证在梯度模式和标准模式下相同的温度特性。405、热盖温度、热盖温度v目前的目前的PCR仪都带有仪都带有热盖热盖，可使样本管顶部，可使样本管顶部温度达到温度达到105左右（控制温度一般为左右（控制温度一般为30110 ），避免蒸发的反应液凝集于管），避免蒸
38、发的反应液凝集于管盖而改变盖而改变PCR反应体积，无需再向反应管内反应体积，无需再向反应管内添加石蜡油，减少了后续实验的麻烦。添加石蜡油，减少了后续实验的麻烦。41（二）荧光检（二）荧光检测测v1Ct值重复性误差值重复性误差 在荧光定量在荧光定量PCR技术中，有一个很重要技术中，有一个很重要的概念的概念-Ct值值（cycle threshold），），其含义是，每个反应管其含义是，每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。模板的内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。模板的Ct值与它的起始拷贝数的对数存在线性关系值与它的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，起始拷贝数越
39、多，Ct值越小，因此，值越小，因此，Ct值重复性误差对核酸定量的可靠性和正值重复性误差对核酸定量的可靠性和正确性十分重要，一般要求确性十分重要，一般要求CV2.5%。v2荧光检测范围荧光检测范围 由于由于PCR是一个指数级扩增的过程，不同是一个指数级扩增的过程，不同的起始拷贝数经过几十个循环后，其荧光差别十分巨大，因的起始拷贝数经过几十个循环后，其荧光差别十分巨大，因此，荧光检测范围一般要求达到此，荧光检测范围一般要求达到1011010DNA(RNA)copy/ml，这是荧光仪的重要指标。，这是荧光仪的重要指标。v3仪器检测通道数量仪器检测通道数量 复合复合PCR实验已成为一种流行趋势，实验已
40、成为一种流行趋势，它能节省试剂和时间，在短时间内获得结果，因此要求仪器它能节省试剂和时间，在短时间内获得结果，因此要求仪器具备多通道检测能力。目前以具备多通道检测能力。目前以4通道检测的居多，部分仪器通道检测的居多，部分仪器具有具有6个检测通道。个检测通道。42（三）其他（三）其他 1样品基座容量和样品数样品基座容量和样品数 多数多数PCR仪配备了可更仪配备了可更换的多样化样品基座，以匹配不同规格的样品管换的多样化样品基座，以匹配不同规格的样品管(0.2、0.5ml PCR管；管；8、12联排管；联排管；96孔微孔板孔微孔板等等)，常用，常用0.2ml96孔。有的孔。有的PCR仪，同一个样品仪
41、，同一个样品基座有不同规格的样品孔，无需更换基座即可分别基座有不同规格的样品孔，无需更换基座即可分别使用不同规格的样品管，但不同反应管不能同时使使用不同规格的样品管，但不同反应管不能同时使用，因高度不同，热盖不能使用。用，因高度不同，热盖不能使用。2软件功能软件功能 新型的新型的PCR仪都常规使用优质配套软仪都常规使用优质配套软件，此类软件易学易用，还具有实时信息显示、记件，此类软件易学易用，还具有实时信息显示、记忆存储多个程序，及自动倒计时、自动断电保护等忆存储多个程序，及自动倒计时、自动断电保护等功能。功能。43二、二、PCR扩增仪的操作程序扩增仪的操作程序v普通普通PCR扩增仪扩增仪 操
42、作非常简便，接通电源，仪器操作非常简便，接通电源，仪器自检，设置温度程序或调出储存的程序运行即可。自检，设置温度程序或调出储存的程序运行即可。v定量定量PCR扩增仪扩增仪 操作和普通操作和普通PCR仪基本相同。仪基本相同。注注意：意：v1、仪器工作过程中不要试图打开机器，以免损坏、仪器工作过程中不要试图打开机器，以免损坏仪器。仪器。v 2、开始时先开仪器，再开电脑；结束时先关仪器，、开始时先开仪器，再开电脑；结束时先关仪器，再关电脑。再关电脑。44 三、三、PCR扩增仪常见故障及其排除扩增仪常见故障及其排除v 1荧光染料污染样品孔荧光染料污染样品孔 应用洁净的样品管及做空白对照。应用洁净的样品
43、管及做空白对照。v 2PCR管融化管融化 检查温度传感器出问题或是热盖出问题。检查温度传感器出问题或是热盖出问题。v 3个别孔扩增效率差异很大个别孔扩增效率差异很大 检查半导体模块是否出现出现坏点；半导检查半导体模块是否出现出现坏点；半导体加热的仪器使用久了会出现这种故障。体加热的仪器使用久了会出现这种故障。v 4荧光强度减弱或不稳定荧光强度减弱或不稳定 检查、檫拭或换滤光片，排除滤光片发霉或检查、檫拭或换滤光片，排除滤光片发霉或有水汽等影响；或换光源（以卤钨灯为光源的易损耗）；或调节检测元有水汽等影响；或换光源（以卤钨灯为光源的易损耗）；或调节检测元件灵敏度。件灵敏度。v 5仪器工作时出现噪
44、声仪器工作时出现噪声 检查检查PCR管是否放合适（对于空气加热的仪管是否放合适（对于空气加热的仪器）或看风扇是否松动。器）或看风扇是否松动。v 6仪器采集荧光时有不正常的噪声仪器采集荧光时有不正常的噪声 常见于某些光纤传导信号的定量常见于某些光纤传导信号的定量PCR仪，请厂家工程师维修。仪，请厂家工程师维修。v 7机器搬动后不能正常工作或不能正常采集荧光信号机器搬动后不能正常工作或不能正常采集荧光信号 检查光路系统，检查光路系统，平常避免自行搬动仪器。平常避免自行搬动仪器。v上述问题的解决一般需请工程师检修。上述问题的解决一般需请工程师检修。v8.PCR反应假阴性反应假阴性 其原因很多，其原因很多，PCR仪控温不准是主要原因。要经常仪控温不准是主要原因。要经常用电子温控器校准温度。用电子温控器校准温度。45第四节第四节 PCR扩增仪的应用扩增仪的应用 一、感染性疾病的分子诊一、感染性疾病的分子诊治治和研究和研究二、遗传性疾病的分子诊二、遗传性疾病的分子诊治治和研究和研究三、恶性肿瘤的分子诊三、恶性肿瘤的分子诊治治和研究和研究四、在移植配型上的应用四、在移植配型上的应用五、在法医学上的应用五、在法医学上的应用六、在分子生物学其他领域的应用六、在分子生物学其他领域的应用 七、在食品卫生安全中的应用七、在食品卫生安全中的应用4647
