1、小鼠肝组织RNA提取及 RT-PCR,RT-PCR,RT-PCR(reverse transcription PCR)由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA）称为“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合聚（逆转录酶）来完成。随后，DNA的另一条链通过RNA引物和依赖DNA的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶H降解，留下cDNA。 RT-PCR有时候也会指代实时PCR(real-time PCR).为了与逆转录PCR相区别，通常被写作定量PCR(quantitative PCR）或者QRT-PCR(qunatitative real-time PCR),
2、两步法,RT和PCR分开做，PCR取反转录反应产物的1/10进行，更为灵活而且严谨，但是灵敏度不如单管一步法高。 这种方法结果更加理想 ，条带特异性强，且无拖尾现象。,RNA模板,逆转录酶 （RNA指导的DNA聚合酶）,逆转录酶 （DNA指导的DNA聚合酶）,R Nase H （RNA酶 H),杂化双链,RNA DNA,单链DNA cDNA,双链cDNA,逆转录过程,PCR反应,1、组织中提取RNA 2、逆转录反应 3、 PCR反应,RNA提取实验原理,TRIZOL：异硫氰酸胍 + 苯酚,裂解细胞，RNA与蛋白质分离，将RNA释放到溶液中。,促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层。,R
3、NA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。,三、实验步骤,RNA提取 1、新鲜肝组织置EP管中，加200l Trizol充分研磨后，补加800l Trizol，枪头吹匀。 2、加入200l 氯仿，剧烈震荡15秒，4 12000g离心15min。 3、将上层水相移至洁净EP管中，加入500l异丙醇颠倒混匀。 4、4 12000g离心10min。 5、弃水相，EP管开盖干燥，溶于50l DEPC水中。,RT-PCR：RNA的反转录 + cDNA的PCR,RT-PCR操作步骤,5x Prime Script Buffer 2 l Pr
4、ime Script RT Enzyme Mix 0.5 l Oligo dT primer (50 m) 0.5 l Random 6 mers (100 m) 1 l 提取的RNA 0.5 l RNase Free 水 5.5 l 37 15min 85 5 sec,10 l,用于逆转录的引物,1、特异性引物：是特异性最好的引物，常用于以RNA为模板进行一步法检测。 2、随机引物：指的是多个任意的碱基连接而成的一套寡聚引物组，常见的是random（6），random（9），random（10），如果6 个碱基的随机序列，则是5-d（NNNNNN）-3，共有4 6 条引物。 3、Oligo dT:指的是多个T 碱基连接而成的寡聚引物，主要是针对真核生物具有Poly(A)尾 时设计的用于RT，,PCR 10x PCR Buffer 5 l dNTP 4 l 模板DNA 2 l 引物1 2 l 引物2 2 l Taq 酶 0.5 l H2O 34.5 l,50 l,94 5 min 94 30 sec 54 30 sec 72 30 sec 72 7 min,25 cycle,1%琼脂糖凝胶电泳,120V, 40min,紫外灯下观察结果,2ml loading buffer 10ml PCR产物 or Mark,混匀 上样10ml,
