1、专题5 DNA和蛋白质技术 课题1 DNA的粗提取与鉴定,栏目链接,栏目链接,DNA的提取是现代生物技术进行中药鉴别的最关键步骤。总DNA的有效提取要求材料中的DNA尽可能少地降解。但用于生药真实性鉴别的药材在干燥、加工、贮藏等过程中均造成了DNA不同程度的降解，一般DNA的含量也比较低。药材中次生代谢产物含量较高，会干扰提取。另外也可能有微生物引起的外源DNA的污染。DNA的质量将直接关系到实验的成败。不同的研究目的对DNA的纯度和量的要求不尽相同。,栏目链接,请思考： 1DNA是怎样提取的？ 2DNA是怎样进行鉴定的？,栏目链接,栏目链接,1DNA的粗提取 (1)基本思路：利用DNA与_、
2、_和_等在物理和化学性质方面的_，提取DNA，去除其他成分。 (2)方法和原理： DNA和_等其他成分在不同浓度的_溶液中溶解度不同，利用这一特点选择适当的_就能使DNA充分溶解，而使_沉淀，或者相反，以达到分离目的。,一、DNA的粗提取和鉴定,RNA,蛋白质,脂质,差异,蛋白质,NaCl,盐浓度,杂质,栏目链接,DNA不溶于_，但是某些_则可溶于其中。 _能水解蛋白质，但是对_没有影响。 大多数蛋白质不能忍受_的高温而发生变性，而DNA在_以上才会变性。 _能瓦解细胞膜，但对DNA无影响。,酒精,蛋白质,蛋白酶,DNA,6080 ,80 ,洗涤剂,栏目链接,2DNA的鉴定 在沸水浴的条件下，
3、DNA遇_会被染成蓝色。,二苯胺,栏目链接,二、实验设计,1选取实验材料 选用_的生物组织，成功的可能性更大。 2破碎细胞，获取含DNA的滤液 动物细胞的破碎比较容易，例如，在鸡血细胞液中加入一定量的_，同时_，过滤后收集滤液即可。如果是植物细胞，需要先用_溶解_。,DNA含量较高,蒸馏水,用玻璃棒搅拌,洗涤剂,细胞膜,栏目链接,3去除滤液中杂质 (1)方案一：通过控制_的浓度去除_。 (2)方案二：直接向滤液中加入_，反应1015 min，_中的_能够分解蛋白质。 (3)方案三：将滤液放在_的恒温水浴箱中保温1015 min，注意严格控制温度范围，使_沉淀析出而_分子还未变性，可以将DNA与
4、蛋白质分离。,NaCl溶液,杂质,嫩肉粉,嫩肉粉,木瓜蛋白酶,6075 ,蛋白质,DNA,栏目链接,4DNA的进一步提纯 利用DNA不溶于冷却的_这一原理，可从_中析出较纯净的DNA，此时DNA的状态为_。 5DNA的析出与鉴定 (1)DNA的析出：DNA的析出用的是与滤液体积相等的、_的_溶液。,95%酒精,滤液,白色丝状物,冷却,酒精,栏目链接,(2)DNA鉴定：鉴定DNA时在试管中先加入物质的量浓度为_的NaCl溶液5 mL。两支试管中其中一支加入DNA丝状物，各加入二苯胺_。 在沸水浴的条件下，DNA遇_会被染成蓝色，因此_可以作为鉴定DNA的试剂。,2 mol/L,4 mL,二苯胺,
5、二苯胺,栏目链接,三、操作提示,(1)以血液为实验材料时，每100 mL血液中需要加入3 g_，防止_。 (2)加入洗涤剂后，动作要_、_，否则容易产生大量的_，不利于后续步骤的操作。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免_，导致DNA分子不能形成_。 (3)鉴定DNA用的染色剂_试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。,柠檬酸钠,血液凝固,轻缓,柔和,泡沫,加剧DNA分子的断裂,絮状沉淀,二苯胺,栏目链接,栏目链接,一、DNA粗提取的原理 1DNA溶解度,栏目链接,栏目链接,栏目链接,2.DNA与蛋白质对蛋白酶、高温、洗涤剂的耐受性的区别,栏目链接,盐析和高温对DNA活性的影响不同 盐析过
6、程DNA的空间结构不变，没有变性，只是溶解度降低。 高温使DNA和蛋白质变性时破坏的键不同。DNA变性时，氢键被破坏，而蛋白质变性时往往破坏二硫键，因此降温时DNA能复性，而蛋白质不能。,特 别 提 醒,例1 DNA在NaCl溶液中的溶解度有两重性，随NaCl溶液浓度的变化而变化，则下图所示能反映DNA的溶解度与NaCl溶液浓度之间关系的是( ),栏目链接,栏目链接,解析：DNA在0.14 mol/L NaCl溶液中溶解度最低。 答案：C,栏目链接,变式 训练,1蛋白酶能将蛋白质水解而使染色质中的DNA分离出来，下列药品可达到上述同一目的的是( ) A蒸馏水 BNaCl溶液 CNaOH溶液 D
7、盐酸,栏目链接,变式 训练,解析：DNA在0.14 mol/L的NaCl溶液中溶解度最低，蛋白质可溶，从而把DNA和蛋白质分开。 答案：B,栏目链接,二、DNA的粗提取和鉴定的实验过程的分析,栏目链接,栏目链接,栏目链接,栏目链接,栏目链接,2实验过程中的几点注意事项 (1)实验中两次加入蒸馏水的目的不同： 第一次的目的是使鸡血细胞吸水涨破，加水后必须充分搅拌，不应少于5 min，使血细胞充分吸水涨破。 第二次的目的是为了稀释NaCl溶液，使DNA逐渐析出。 (2)实验中三次加NaCl溶液的目的： 第一次加入NaCl溶液后必须充分搅拌，加速染色质中DNA与蛋白质分离，使DNA充分游离并溶解在N
8、aCl溶液中。,栏目链接,第二次加入NaCl溶液的目的是使DNA溶解。 第三次(即DNA鉴定环节)中加NaCl溶液的目的是溶解DNA。 (3)实验中六次搅拌的目的：,栏目链接,栏目链接,哺乳动物成熟的红细胞不含细胞核，无DNA分子，不能作为提取DNA的实验材料若选取肝脏细胞或植物细胞，由于肝组织含较多蛋白质纤维，植物组织有胞间连丝和细胞壁，则必须充分研磨。 过滤时不能用滤纸代替纱布，否则会因DNA被吸附到滤纸上，而导致DNA大量损失。,特 别 提 醒,栏目链接,栏目链接,相关试剂的作用辨析： a柠檬酸钠：作为抗凝剂，防止血液凝固。 b洗涤剂：能够瓦解细胞膜，释放内含物DNA。 c食盐：可以加速
9、核蛋白解体，游离出DNA分子。,特 别 提 醒,栏目链接,例2 (双选)下表是关于DNA粗提取与鉴定实验中所使用的材料、操作及其作用的表述，正确的是( ),栏目链接,栏目链接,解析：在DNA粗提取与鉴定实验中，柠檬酸钠可以防止血液凝固；鸡血中加入蒸馏水可以使细胞膜和核膜破裂；DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，在0.14 mol/L NaCl溶液中的溶解度最低，有利于DNA析出；DNA不溶于酒精，可以获得较纯的DNA；DNA遇二苯胺(水浴加热)产生蓝色反应。 答案：AC,栏目链接,2下列关于DNA的粗提取和鉴定的有关说法，正确的是( ) ADNA在NaCl溶液中的溶解度随NaCl溶液浓
10、度的增大而增大 B溶有DNA的NaCl溶液中加入4 mL二苯胺试剂即变蓝色,变 式 训 练,栏目链接,CDNA粗提取和鉴定时，选材最好用鸡血而不用猪血 D提取洋葱的DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，食盐有利于DNA从细胞中释放出来,变 式 训 练,栏目链接,解析：从DNA在NaCl溶液中的溶解度曲线可知，NaCl溶液在低于0.14 mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐下降，0.14 mol/L时溶解度最低，当NaCl溶液浓度继续增加时，DNA的溶解度逐渐增加。A项只注重一段范围内的变化，不够全面。二苯胺试剂使用时需要水浴加热才能出现实验现象。猪的成熟红细胞没有细胞核，无DNA，故,变 式 训 练,栏目链接,不能用于本实验。而提取洋葱的DNA时，食盐的作用是溶解释放出的DNA，洗涤剂的作用才是使DNA从细胞中释放出来。 答案：C,变 式 训 练,栏目链接,
