1、蛋白质和氨基酸测定 学习目标 1.了解蛋白质和氨基酸的性质 2.明确蛋白质和氨基酸测定方法 2.掌握凯氏定氮法测定蛋白质的过程及注意事项 3.了解氨基酸的性质和测定方法蛋白质和氨基酸测定内容1.1.概述概述2.2.凯氏定氮法凯氏定氮法3.3.蛋白质的快速测定法蛋白质的快速测定法4.4.氨基酸总量的测定氨基酸总量的测定5.5.氨基酸的分离与测定氨基酸的分离与测定1.概述(1)蛋白质的生理功用及在食品中的作用（2）食品中的蛋白质含量（3）蛋白质系数（4）蛋白质水解（5）蛋白质测定方法 (6)氨基酸的测定与分离方法2.2.凯氏定氮法凯氏定氮法原理原理 样品与浓硫酸和催化剂一同加热样品与浓硫酸和催化剂
2、一同加热消化消化，使蛋白，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱然后加碱蒸馏蒸馏，使氨蒸出。用，使氨蒸出。用H3BO3吸收吸收后再以后再以标准标准HCl溶液溶液滴定滴定。根据标准酸消耗量可以计算。根据标准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量。出蛋白质的含量。食品中的蛋白质测定 原理、过程及试剂 消化蒸馏与吸收滴定 消化-浓硫酸、硫酸铜、硫酸钾 蒸馏-氢氧化钠 吸收-硼酸 滴定-盐酸、混合指示剂消化2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4 （NH4
3、）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O一定要用浓硫酸（一定要用浓硫酸（98%）蒸馏与吸收蒸馏与吸收消化液消化液+40%氢氧化钠加氢氧化钠加热蒸馏，放出氨气。热蒸馏，放出氨气。滴定用盐酸标准溶液滴定至终点.然后进行计算.微量凯氏定氮装置蛋白质测定蛋白质测定仪-消化、蒸馏吸收蛋白质测定蛋白质测定仪-滴定KDN型蛋白质测定蛋白质测定仪 QSY-型蛋白质测定仪型蛋白质测定仪 3.3.蛋白质的快速测定法蛋白质的快速测定法 传统的凯氏定氮法应用范围广，灵敏度高、传统的凯氏定氮法应用范围广，灵敏度高、准确，不要大仪器，但费时间，有环境污准确，不要大仪器，但费时间，有环境污染。染。新开发的：双缩脲法、新
4、开发的：双缩脲法、紫外分光光度法、紫外分光光度法、染料结合法、染料结合法、水杨酸比色法等。水杨酸比色法等。下面简单介绍双缩脲法下面简单介绍双缩脲法1.原理原理脲（尿素）脲（尿素）NH2CONH2 加热至加热至150160时，时，两分子缩和成双缩脲。两分子缩和成双缩脲。双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫色络和物，这双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫色络和物，这种反应叫双缩脲反应。（缩二脲反应）种反应叫双缩脲反应。（缩二脲反应）蛋白质分子中含有肽键蛋白质分子中含有肽键 CONH 与双缩脲结构与双缩脲结构相似。在同样条件下也有呈色反应，在一定条件下，相似。在同样条件下也有呈色反应，在一定条件下，其颜色深
5、浅与蛋白质含量成正比，可用分光光度计其颜色深浅与蛋白质含量成正比，可用分光光度计来测其吸光度，确定含量。（来测其吸光度，确定含量。（560nm）NH2CONHCONH2 +NH3NH2CONH2+NH2CONH2方法特点及应用范围方法特点及应用范围 本法灵敏度较低，但操作简单快速，故在本法灵敏度较低，但操作简单快速，故在生物化学领域中测定蛋白质含量时常用此生物化学领域中测定蛋白质含量时常用此法。本法亦适用于豆类、油料、米谷等作法。本法亦适用于豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等样品测定。物种子及肉类等样品测定。4.4.氨基酸总量的测定氨基酸总量的测定（一）甲醛滴定法（一）甲醛滴定法（二）茚三酮的
6、比色法（二）茚三酮的比色法（一）甲醛滴定法（一）甲醛滴定法1.1.原理：氨基酸本身有碱性原理：氨基酸本身有碱性 NHNH2 2 基，又基，又有有 酸性酸性 COOH COOH 基，成中性内盐，加入甲基，成中性内盐，加入甲醛溶液后，甲醛与醛溶液后，甲醛与 NHNH2 2 结合，碱性消结合，碱性消失，再用强碱来滴定失，再用强碱来滴定 COOH COOH 基。基。2 2适用范围：适用于发酵工业，如发酵液适用范围：适用于发酵工业，如发酵液中含氮量，其发酵过程中氮量减少情况及中含氮量，其发酵过程中氮量减少情况及食品中游离氨基酸的测定等。食品中游离氨基酸的测定等。3 3试剂：试剂：40%40%中性甲醛溶液
7、：以百里酚酞作指示剂，中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用氢氧化钠将用氢氧化钠将40%40%甲醛中和至蓝色。甲醛中和至蓝色。0.1%0.1%百里酚酞乙醇溶液，百里酚酞乙醇溶液，0.1%0.1%中性红中性红50%50%乙醇溶液，乙醇溶液，0.1 mol/L 0.1 mol/L 氢氧化钠标准溶液。氢氧化钠标准溶液。4 4操作：同时取两份样：操作：同时取两份样：一份中加中性红指示剂，用氢氧化钠直接一份中加中性红指示剂，用氢氧化钠直接滴，中和样液中其它酸性物质。滴，中和样液中其它酸性物质。另一份中加百里酚酞、中性甲醛用另一份中加百里酚酞、中性甲醛用NaOHNaOH 滴，滴，中和了样液中氨基酸的羧基与其
8、它酸性物中和了样液中氨基酸的羧基与其它酸性物质的总和。质的总和。二者之差可计算氨基酸含量二者之差可计算氨基酸含量（二）茚三酮的比色法（二）茚三酮的比色法 原理：氨基酸在一定条件下与茚三酮起反原理：氨基酸在一定条件下与茚三酮起反应，生成蓝紫色化合物，可比色定量。应，生成蓝紫色化合物，可比色定量。5.5.氨基酸的分离与测定氨基酸的分离与测定（一）薄层色谱法（一）薄层色谱法（二）氨基酸自动分析仪法（二）氨基酸自动分析仪法（三）气相色谱法（三）气相色谱法（四）高效液相色谱法（四）高效液相色谱法（一）薄层色谱法（一）薄层色谱法 原理：原理：取一定量经水解的样品溶液，滴在制好的薄取一定量经水解的样品溶液，
9、滴在制好的薄层板上，在溶剂系统中进行双向上行法展开，层板上，在溶剂系统中进行双向上行法展开，样样品各组分在薄层板上经过多次的被吸附、解吸、品各组分在薄层板上经过多次的被吸附、解吸、交换等作用，同一物质具有相同的交换等作用，同一物质具有相同的Rf值，不同成值，不同成分则有不同的分则有不同的Rf值，因而各种混合物可达到彼此值，因而各种混合物可达到彼此被分离的目的。然后用茚三酮显色，与标准氨基被分离的目的。然后用茚三酮显色，与标准氨基酸进行对比，鉴别各种氨基酸种类，从显色斑点酸进行对比，鉴别各种氨基酸种类，从显色斑点颜色的深浅可以大致确定其含量。颜色的深浅可以大致确定其含量。R Rf f=a/b=a/bab样点样点溶剂前沿溶剂前沿点样原点点样原点操作方法：操作方法：薄层板制备薄层板制备 样品液制备样品液制备 点样点样 展开展开 显色显色（二）氨基酸自动分析仪法（二）氨基酸自动分析仪法（三）气相色谱法（三）气相色谱法（四）高效液相色谱法（四）高效液相色谱法 本章小结 1、重、难点及适用范围 凯氏定氮法测定蛋白质的过程及注意事项 2、了解仪器法测定蛋白质及氨基酸的方法 3、下次课做实验-实验要求 4、作业
