1、重组重组DNA鉴定鉴定目的蛋白的表达目的蛋白的表达及功能的研究及功能的研究获得目的基因获得目的基因DNA重组重组DNA的结构及功能结构及功能vDNA分子是由两条反向平行的脱氧核苷酸长链盘绕而成的。vDNA分子中的脱氧核糖和磷酸交替连接，排在外侧，构成基本骨架，碱基排在内侧。v两条链的碱基通过氢键连接形成碱基对，其中A与T配对，G与C配对。v两个相邻脱氧核苷酸通过3-5磷酸二酯键连接。v起着贮存和传递遗传信息的作用。RNA的种类的种类Categoryv转运核糖核酸(transfer RNA,tRNA)v核蛋白体核糖核酸(ribosome RNA,rRNA)v信使核糖核酸(messenger RN
2、A,mRNA)v转运氨基酸v与蛋白质结合形成核蛋白体,起装配机的作用v翻译蛋白质的模板RNA的功能的功能FunctionmRNAmRNA的生物合成的生物合成mRNA BiosynthesismRNA Biosynthesisv真核生物的结构基因由内含子和外显子组成，内含子的序列较长，且不编码蛋白质。v真核生物DNA在转录过程中经剪接可将内含子部分去除，获得成熟的mRNA。v由于分子生物学研究的最终产物常常是蛋白质，因此我们需要获得可翻译的mRNA。vmRNA易降解，不易长期保存。v将mRNA逆转录成cDNA，利用cDNA来研究基因的功能。Trizol提取提取RNA原理原理vTrizol法提取细
3、胞总RNA是目前常用的提取方法。v细胞内大部分的RNA与蛋白质结合在一起，以核蛋白形式存在。vTrizol内含异硫氰酸胍和苯酚等物质。v异硫氢酸胍(GuSCN)是一种强的蛋白质变性剂，不仅能使细胞裂解，同时还能有效地抑制细胞内源性RNA酶的活性。v通过有机溶剂的分步抽提，最终可获得纯度较高的细胞总RNA。RNA提取注意事项提取注意事项 vTrizol试剂含有苯酚，具有毒性和刺激性，注意操作。如皮肤接触Trizol，请立即用大量水冲洗。vRNase污染的主要来源是操作过程中手和空气中的浮沉，注意随时勤换手套，样品尽可能盖严；尽量不要对着RNA样品呼气或说话。用0.01%的DEPC水浸泡过夜，然后
4、灭菌，烘干。溶液需用DEPC水配制。v细胞裂解必需充分且操作迅速。裂解不完全会降低最后得率，因为一部分RNA会残留在未裂解的细胞中。在清洗和裂解细胞时最好在低温下操作，防止在操作过程中释放的内源RNase降解了RNA。逆转录(Reverse Transcription)逆转录指遗传信息从逆转录指遗传信息从RNA流向流向DNA，是是RNA指导下的指导下的DNA合成过程，即以合成过程，即以RNA为为模板，四种模板，四种dNTP为原料，合成与为原料，合成与RNA互补的互补的DNA单链，单链，称为互补称为互补DNA(complementary DNA,cDNA)逆转录逆转录酶酶逆转录原理vcDNA合成
5、有两个关键因素，一是病毒RNA的质量，二是逆转录酶。v逆转录酶是一种多功能酶，它能在一定的条件下，以单链RNA为模板合成第一条cDNA链。v通过RNaseH活性水解RNA-DNA杂合分子中的RNA链。逆转录酶逆转录酶(reverse transcriptase)催化逆转录过程的酶称逆转录酶，催化逆转录过程的酶称逆转录酶，RNA病毒中都含有此酶。病毒中都含有此酶。具有三种酶活性：具有三种酶活性：v RNA指导的指导的DNA聚合酶聚合酶v RNA水解酶活性水解酶活性 v DNA指导的指导的DNA聚合酶聚合酶逆转录体系逆转录体系RNARNA模板模板 3UUAGGCCUGGAUAAGCGCCUGGA
6、5引物引物 5ATCCGGAC 逆转录酶逆转录酶酶活性依赖金属离子酶活性依赖金属离子底物底物逆转录过程中cDNA的合成依赖依赖RNA的的DNA聚合酶聚合酶核糖核酸酶核糖核酸酶H活力活力依赖依赖DNA的的DNA聚合酶聚合酶逆转录引物的选择逆转录引物的选择(Primer)vOligo(dT)(12-18个核苷酸组成），只有mRNA被逆转录v随机六聚寡核苷酸，所有RNA均被逆转录v基因特异性引物，仅产生需要的DNA逆转录的生物学意义v扩充了中心法则扩充了中心法则v有助于对病毒致癌机制的了解有助于对病毒致癌机制的了解v与真核细胞分裂和胚胎发育有关与真核细胞分裂和胚胎发育有关v逆转录酶是分子生物学重要工
7、具酶逆转录酶是分子生物学重要工具酶以DNA为模板，利用DNA聚合酶的特性体外扩增特定的基因片断，这种方法被称为DNA聚合酶链式反应。PCR 基因放大连琐反应PCR基本原理v利用高温可使DNA变性和低温可使DNA复性的特性，根据体内细胞分裂中DNA半保留复制机理，以特异性寡核苷酸为引物，DNA分子为模板，在DNA聚合酶和四种脱氧核苷酸存在的条件下体外合成新DNA分子的过程。v这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。PCRPCR技术的特点技术的特点v高度的敏感性v高度的特异性v操作简便、快速v适用样品的广泛性PCRPCR基本成分基本成分vtemp
8、latetemplatevprimersprimersvTaqTaq polymerase polymerasev1010PCR bufferPCR buffervdNTPsdNTPsvMgMg+PCR Primerswww.ncbi.nlm.nih.govPCR Primersv序列发现的时间和发现者v序列的生物体来源v序列的组织来源引物设计引物设计(Primer design)v引物长度（length）:2030bpv引物中四种碱基的分布应该是随机的v两引物间不能有互补序列，尤其是3端v引物的碱基顺序不应与非扩增区域由同源性v引物的3末端碱基一定要与模板DNA配对v可以在5末端加上限制性内
9、切酶位点或起始密码v解链温度(Tm)：两引物间相差不大于5v引物内部不能有大于3bp的反向重复序列或自身互补序列存在PCRPCR基本程序基本程序v预变性（Pre-denaturation)v变性(Denaturation)v退火(Annealing)v延伸(Elongation)v25-30 cycles5353Double stranded DNA templateRegion to be amplified5353Double stranded DNA templateDesign primers with this sequence informationIdentical to thi
10、s sequenceReverse complement of this sequence5353PCR CYCLE 1Double stranded DNA templatePrimersTaqTaq5533PCR CYCLE 1Denaturation950Cstrands separatePrimersTaqTaqTaq polymerase is thermostable3553PCR CYCLE 1Annealing550CPrimers bindTaqTaqForward primer anneals to lower strandReverse primer anneals to
11、 upper strand3553PCR CYCLE 1Annealing550CTaq binds to duplexTaqTaq3553PCR CYCLE 1Extension72oCTaq copies DNA stranddNTPSTaqTaqTaq synthesises DNA in the 5 to 3 direction3553PCR CYCLE 1Extension72oCTaq copies DNA strandTaqTaqTaq synthesises DNA in the 5 to 3 direction3553PCR CYCLE 1Extension72oCTaq c
12、opies DNA strandTaqTaqTaq synthesises DNA in the 5 to 3 direction35535353PCR CYCLE 1End cycle 1 PCR animationPCR反应v取无菌02ml PCR管一支，加入：v10PCR缓冲液 5lv氯化镁 4lv4种NTP混合液(10mmol/L)05lv3端引物(10mol/L)1lv5端引物(10mol/L)1lvTaq DNA多聚酶(5u/l)025lv三蒸水 3325lv模板cDNA 5lv盖紧盖子，离心数秒后置PCR仪上进行扩增。PCR循环为：95预变性2 min，95变性30 s、55复性
13、30 s、72延伸1 min，30个循环，最后72C延伸7 min。细胞裂解细胞裂解引物引物dNTPs二价金属离子二价金属离子DNA聚合酶聚合酶引物引物dNTPs二价金属离子二价金属离子逆转录酶逆转录酶RT-PCR的应用(application)v获得基因完整编码区序列v检测基因转录产物v半定量比较不同样品间mRNA水平v制备用于杂交的cDNA探针PCR技术在临床应用中的问题和对策 v在我国，前一个时期PCR应用相当混乱。从技术因素分析，常规PCR作为临床检验技术存在的最主要的问题是，扩增产物污染带来的假阳性。常规PCR只能定性不能定量，也影响了评价PCR检测结果的临床诊断意义。定量是PCR作
14、为临床检验技术发展的另一个重要目标。琼脂糖凝胶电泳基本原理基本原理v琼脂糖凝胶电泳是以琼脂糖作为固体支持物的一种电泳方法。v因为各种核酸分子的电荷及质量之比是相近的，在没有支持物的电场中，它们以相同的速度前进。v琼脂糖凝胶电泳具有分子筛效应，所以在适当浓度的琼脂糖凝胶中电泳，线性DNA分子在电场中的迁移率与其分子量的对数成反比，从而达到分离的目的。琼脂糖凝胶电泳（Agarose Gel Electrophoresis）分离的原理v使 TAE浸过凝胶表面v在阴极的加样孔加样（红正黑负）v分子筛作用v分子量越小，迁移速度越快琼脂糖凝胶的浓度与琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围分离范围Separati
15、on Range Vs.%Agarose琼脂糖凝胶浓度与分离效率上样上样v上样缓冲液v甘油可增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内v在电泳中形成肉眼可见的指示带，可预测核酸电泳的速度和位置v使样品呈色，使加样操作更方便vEDTA,SDS 可灭活限制性内切酶溴化乙锭溴化乙锭(EB)染色染色双螺旋双螺旋的碱基对之间的碱基对之间 分子越小分子越小,结合的结合的 越少越少,染色越淡染色越淡+注意事项v一定要等凝胶冷却至60时再入加溴化乙锭v切记DNA样品由负极往正极泳动(靠近加样 孔的一端为负)v加完样品后最好先观察一段时间v插电极或拔电极时必须将仪器电源关掉v不要使样品跑出凝胶琼脂
16、糖凝胶电泳应用琼脂糖凝胶电泳应用vPCR产物鉴定v酶切片段鉴定vDNA片段回收vDNA的定量分子克隆(molecular cloning)基因工程的核心v基因工程中所指的克隆，是在体外对DNA分子按照既定目的和方案进行人工重组，将重组分子导入合适细胞，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得该DNA分子得大量拷贝。这类克隆是在分子水平上操作的，故称为分子克隆。又被称为基因克隆或DNA克隆。分子克隆中常用的工具酶v限制性核酸内切酶vDNA连接酶vDNA聚合酶v末端转移酶v逆转录酶v碱性磷酸酶v核酸外切酶基因克隆的基本程序v外源基因或目的基因的获得v载体的构建或选择v连接v转化v阳性重组体的筛选与鉴定目的基
17、因v目的基因是指我们所要研究和应用的基因，也就是我们将要克隆或表达的基因。v获得目的基因是分子克隆过程中的第一步。体外扩增基因法(PCR and RT-PCR)人工合成基因法限制性内切酶直接分离法获得基因文库筛选法从cDNA文库中筛选RT-PCRvRNA 提取vRT-PCRExtract RNA from virus/cellsRNA载体(Vector)v载体是指能够携带外源基因转入受体细胞内进行扩增或诱导外源基因在受体细胞内表达的工具。载体应具备的条件v带有复制子v多克隆酶切位点v筛选标志v完整的转录单位（表达型载体）载体的分类v按功能分类：克隆载体和表达载体v按受体细胞分类：原核细胞载体和
18、真核细胞载体v按载体来源分类：质粒载体、嗜菌体、病毒、酵母人工染色体、粘粒pGEM-T Easy Vector绿色荧光蛋白载体绿色荧光蛋白载体酶切载体和目的基因酶切载体和目的基因(Enzyme restriction digest of DNA plasmid vector and target gene）目的基因与载体的连接（目的基因与载体的连接（ligation）v利用DNA连接酶把载体DNA和要克隆的目的DNA片段连接在一起，成为一个完整的重组分子，被称为连接反应。DNA 连接酶(DNA Ligase)v催化两个独立的DNA片段5-磷酸基团和3-羟基基团之间形成磷酸二酯键。连接方法连接方
19、法v粘性末端连接法：单酶连、双酶连v平齐末端连接法v同聚物接尾法v人工接头法vPCR产物与载体的连接：限制性酶切位点添加法、T/A克隆法单一酶切的粘性末端连接缺点v载体自连：载体DNA两端的粘性末端可以自身退火成环，产生载体-载体相连接的假阳性克隆。v双向插入：由于使用同一种内切酶，载体与插入片段的4个末端全为相同的粘性互补顺序，所以目的基因插入可以有两个方向。Bam H切割反应切割反应 GGATCC CCTAGGT4 DNA连接酶连接酶 15CGATCC GG CCTAG目的基因用目的基因用 Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCC
20、GGATCCG载体载体DNA用用Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG重组体重组体GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCG载体自连载体自连目的基因自连目的基因自连同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接不同限制酶切位点的连接（双酶连）不同限制酶切位点的连接（双酶连）GAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGAEco R切割位点切割位点GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTABg l切割位点切割位点AATTCGATCTAGAATTCGGATCTAAATT
21、CGATCTAGEcoR+BgL 双酶切双酶切Eco R+BgL 双酶切双酶切GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAT4 DNA连接酶连接酶 15C重组体重组体平端连接平端连接适用于：限制性内切酶切割产生的平端适用于：限制性内切酶切割产生的平端 粘端补齐或切平形成的平端粘端补齐或切平形成的平端目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶连接酶 15C重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自连自连同聚物加尾连接同聚物加尾连接v在末端转移酶在末端转移酶(terminal transferase)的作用下，在的作用下，在DNA片段片段末
22、端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。5 3 3 5 载体载体DNA5 3 3 5 目的基因目的基因限制酶或机械剪切限制酶或机械剪切限制酶限制酶 5 3 3 5 5 3 T(T)nT T(T)nT 3 5 5 3 3 5 5 3 A(A)nA A(A)nA 3 5 -核酸外切酶核酸外切酶-核酸外切酶核酸外切酶 末端转移酶末端转移酶+dATP末端转移酶末端转移酶+dTTPT(T)nT A(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA连接酶连接酶 15C重组体重组体人工接头人工接头(linker)连接连接在平端加上酶切位点，再用限制
23、酶切除产生粘性在平端加上酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。末端，而进行粘端连接。CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco REco REco REco RT/A克隆法v利用含有单个胸腺嘧啶（T）3-突出末端的线性化载体与带有单个腺苷酸（A）3-突出末端的PCR产物来进行克隆，这种方法被称为T/A克隆法。v此方法利用了Taq DNA聚合酶具有延伸酶的活性，即不依赖模板的方式将一个核苷酸添加到已完成延伸的PCR产物的3-末端。在四种核苷酸都存在的情况下，这个添加上去的核苷酸通常是A残基。重组分子导入受体细胞重组分子导入受体细胞v外源DNA分子与载体组成重组分子后，需
24、要导入受体细胞才能进行繁殖和表达，受体细胞系指被导入重组分子的细胞，又称宿主细胞。根据导入受体细胞的方式不同，可分为：v转化（transformation）：将重组DNA分子导入原核细胞的过程v转染（transfection）：将重组DNA分子导入真核细胞的过程v感染（infection）：噬菌体进入宿主细菌，病毒进入宿主细胞中繁殖的过程转化过程v制备感受态细胞（competent cell）：用物理或化学方法处理细胞，使其处于最适摄取和容忍外来DNA的生理状态，这种细胞称为感受态细胞。v将重组DNA分子和感受态细胞相混合，使DNA分子进入大肠杆菌细胞中。v转化细胞在含有抗生素的琼脂平板上生长
25、氯化钙法原理v细菌处于0氯化钙低渗溶液中，细胞膨胀成球形。v转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基鸟磷酸复合物粘附于细胞表面，经42 短时间热休克处理，促进细胞吸收DNA复合物。v在培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。v被转化的细菌中，重组基因得到表达，在选择性培养基平板上可筛选出所需的转化子。氯化钙法(Chemical transformation with Calcium Chloride)CaCl2方法的转化效率一般可达106-107转化子/g DNA。关键是(1)使用对数生长期的细菌 (2)低温操作 (3)手法温柔优点:简单、稳定、可重复性高。缺点:转化效率稍低，而且不能转
26、化大质粒(15Kb)电转法电转法(Transformation by Electroporation)重组DNA的筛选与鉴定v抗药性筛选法v蓝白筛选法vDNA限制性内切酶图谱分析vDNA序列测定法v核酸杂交法vPCR法抗生素筛选转化结果抗生素筛选转化结果Growth on agar plates(Amp+X-Gal)and selection for antibiotic resistant colonies重组重组DNADNA技术操作过程可形象归纳为技术操作过程可形象归纳为 小小 结结分分分离目的基因分离目的基因 切切限制酶切目的基因与载体限制酶切目的基因与载体接接拼接重组体拼接重组体 转转
27、转入受体菌转入受体菌 筛筛筛选重组体筛选重组体 重组重组DNA技术操作的主要步骤技术操作的主要步骤载体载体质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因组基因组DNA cDNA 人工合成人工合成PCR产物产物限制酶消化限制酶消化开环载体开环载体DNA目的基目的基因因连接酶连接酶重组体重组体转化转化体外包装，转染体外包装，转染带重组体的宿主带重组体的宿主筛选筛选表型筛选表型筛选酶切电泳鉴定酶切电泳鉴定菌落原位杂交菌落原位杂交克隆常见问题v转化后无克隆产生v白色菌落很少或者根本没有v实验组只有白色菌落v白色菌落中阳性克隆率低重组重组DNA的应用的应用v克隆基因的表达v探针
28、标记v基因组序列分析v基因的定点突变v基因打靶技术v转基因技术质粒提取及酶切鉴定实验目的及背景v质粒是独立于细菌染色体外的DNA分子，大小可为1kb到200kb。v大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环状的分子，以超螺旋形式存在。它是细菌内的共生型遗传因子。v其复制和遗传独立于细菌染色体，但复制和转录依赖于宿主编码的蛋白和酶。质粒类型v质粒按复制方式分为两种类型：松弛型质粒和 严紧型质粒1.松弛型质粒(relaxed plasmid)松弛型质粒的复制不需要质粒编码的功能蛋白，完全依赖于宿主提供的半衰期较长的酶。即使蛋白质合成受抑制，质粒的复制依然进行。2.严紧型质粒(stringent pla
29、smid)严紧型质粒复制需要一个质粒编码的蛋白，质粒的拷贝数不能通过用氯霉素等蛋白合成抑制剂来增加。v按功能分为3类：F质粒（即性质粒）R质粒（即抗药性质粒）Col质粒（即大肠杆菌素因子）质粒DNA的一般性质v环状超螺旋DNA分子v质粒可以转移v质粒的复制依赖宿主细胞的复制机器v质粒有相容性及不相容性v质粒能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细胞一些表型，是比病毒更简单的原始生命。Target Genes Carried by Plasmid1 plasmid1 cellRecombinant PlasmidTransformationTarget GeneRecombinationRestrict
30、ionEnzymeRestrictionEnzymeChromosomal DNATarget GenesDNA RecombinationTransformationHost CellsJuang RH(2004)BCbasics质粒的应用v大多数基因工程使用松弛型质粒。v严紧型质粒用来表达一些可使宿主细胞受毒害致死的基因。v质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值。质粒载体质粒载体(plasmid vectors)v是一独立的复制子v有筛选标记v具有酶切位点或多克隆位点v分子量小，拷贝数高v测序、亚克隆、表达、可重复
31、性高分离质粒DNA方法v从大肠杆菌中分离质粒DNA方法众多，目前常用的有：碱变性法；煮沸法；SDS法；羟基磷灰石层析法等v各方法分离是依据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成及结构等特点加以选择的，其中碱变性法既经济且收得率较高,提取的质粒DNA可用于酶切,连接与转化。质粒质粒DNA提取的提取的步骤v所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；DNA分离质粒DNA；培养单克隆细胞培养单克隆细胞Amplification and Screening of Target Gene11 cell line,1 colonyX100X1,000PlasmidDupl
32、icationBacteria DuplicationPlatingPick the colonycontaining target gene=100,000Juang RH(2004)BCbasics碱变性法基本原理v在pH 12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态。v将PH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒D
33、NA。质粒小量制备的问题与对策 v质粒DNA不能被限制酶所切割，这是由于：从细菌沉淀或从核酸沉淀中去除所有上清液时注意得不够。大多数情况下，用酚：氯仿对溶液进行抽提可以去除小量备物中的杂质。如果总是依然存在，可用离心柱层析注纯化DNA。DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应。重新沉淀DNA，让酒精充分挥发。DNA中残留有金属离子，可增加70%乙醇洗涤的次数。v出现无质粒DNA的现象，这可能是由于细菌中无质粒或核酸沉淀颗粒已同乙醇一起被弃去重组质粒的鉴定v琼脂糖凝胶电泳v限制性内切酶酶切v紫外分光光度计测定vDNA自动测序v核酸杂交法vPCR法质粒的琼脂糖凝胶电泳(Agarose Ge
34、l Electrophoresis)v在一定电场强度下，DNA分子的迁移取决于DNA分子本身的大小和构型。v相对分子质量不同的DNA片段泳动速度不一样。质粒DNA的形态不一，电泳时在凝胶中的迁移率不同。v因此，凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。v超螺旋的质粒DNA一般迁移最快、开环（缺口）质粒DNA迁移最慢，线化DNA位于两者之间。质粒的琼脂糖凝胶电泳限制性核酸内切酶v1970年发现的，是一类能识别和切割双链DNA分子内特定碱基顺序的核酸水解酶。被称为分子生物学的“手术刀”。v有三种类型的限制性内切酶，最常用的是型v识别顺序一般为4
35、-6个碱基的回文结构。如下：Palindrome,Restriction Enzyme,Sticky EndsGAATTCGAATTCGAATTCGAATTCSticky Ends(Cohesive Ends)EcoRIGet An Apple To The ClassGAATTCGAATTCJuang RH(2004)BCbasics限制性内切酶切割双链限制性内切酶切割双链DNA产生产生3种不同的切口种不同的切口v平头末端(blunt end)v5端突出的粘性末端v3端突出的粘性末端平头末端(blunt end)v在识别顺序的对称轴上，对双链DNA同时切割，产生平头末端(blunt end)
36、5-GG CC-3 Hae 5-GG CC-3 3-CC GG-5 3-CC GG-5 5端突出的粘性末端v在识别顺序的两个对称点切开DNA双链，产生带单链尾巴的粘性末端,从5端切割产生5端突出的粘性末端5-G AATTC-3 EcoR5-G AATTC-3 3-CTTAA G-5 3-CTTAA G-5 3端突出的粘性末端v在识别顺序的两个对称点切开DNA双链，产生带单链尾巴的粘性末端,从3端切割产生3端突出的粘性末端 5-CTGCA G-3 Pst 5-CTGCA G-3 3-G ACGTC-5 3-G ACGTC-5 用限制性内切酶切割质粒v质粒 4ulv去离子水 4ulv10 xbuf
37、fer 1ulvEcoR 0.5ulv离心混合后，37 1小时BufferPlasmidEcoR Water酶切反应注意事项v决不能用水稀释,以免变性失活。v预先加入除酶以外的所有其他试剂。v取酶立即放于冰上。分装小份避免反复冻融。v使用无菌的新吸头。v少加水,使体积最小,但保证酶液体积不超过总体积的10,否则酶液中的甘油会抑制酶活性。限制性核酸内切酶的应用v改造及组建质粒v组建基因组DNA物理图谱v基因组DNA同源性研究vDNA重组克隆及亚克隆vDNA杂交与顺序分析测序技术进展测序技术进展同位素标记到荧光标记同位素标记到荧光标记,平板电泳到毛细管电泳平板电泳到毛细管电泳多色荧光标记多色荧光标
38、记毛细管电泳毛细管电泳 单色荧光标记单色荧光标记平板电泳平板电泳同位素标记同位素标记平板电泳平板电泳A C G TA C GT测序图谱测序图谱T A TTG CAT TG TC TGCATTG T C TDideoxynucleotidesHPOOHOHHOOOCH2NH2NNNNSugarBasePhosphate35214H23-dideoxynucleotide monophosphate2-dideoxynucleotide monophosphatePhosphodiesterbondP R P R P R P R P R P ROH531 135A1 12 23456APO4 2-
39、H352 2HdideoxynuceotideddNTP Sangers Method:How Terminated Normal LinkingCan not reactJuang RH(2004)BCbasicsThe ddATP Reaction5TTATCG3AATAGCATGGTACTGATCTTACGCTAT55TTATCGTACCATGACTAGATGCGA5TTATCGTACCA5TTATCGTACCATGACTA5TTATCGTA5TTATCGTACCATGA5TTATCGTACCATGACTAGATGCGATA5TTATCGTACCATGACTAGAPol.5TTATCGT
40、ALet meThrough!Pol.5TTATCGTACCATGAOh comeon!Pol.5TTATCGTACCATGACTAGANotAgain!Pol.5TTATCGTACCATGACTAGATGCGATAAgggg.DNA自动测序自动测序vDNA自动测序是在Sanger法的基础上经过加工改进的。v将2,3-双脱氧三磷酸核苷酸(ddNTP)用不同的荧光标记，如用红色荧光标记ddTTP，蓝色荧光标记ddCTP，黄色荧光标记ddGTP，绿色荧光标记ddATP。v在测序PCR反应中，将荧光标记的ddNTP掺入到反应中，当某一ddNTP分子掺入到合成的DNA分子中时，该链延伸终止并且标记上相
41、应的荧光染料分子。v反应终止后，就会得到不同荧光标记的长短不同的DNA分子。v经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后电泳分离后，用荧光检测仪检测，收集的信号经过计算机分析后便可以得到DNA的核苷酸序列。测序反应(20l)v模板(template)：200-500ngv引物(primer)：5pmolvPremix(ddNTP,dNTP,Taq Polymerase):8lvH2Ov9520 s,5015 s,60 1min,25 cycles原始数据分析除文本文件外，DNA自动测序还提供测序图数据读取软件可以对原始数据进行处理，得到最终的测序结果影响测序结果的因素模板70%引物15%其它15%模板引物其
42、它DNA自动测序在医学上的应用自动测序在医学上的应用v基因组研究v疾病诊断v基因分型分子生物学中使用的杂交方法分子生物学中使用的杂交方法核酸分子杂交原理v核酸分子杂交技术是分子生物学领域中最常用的基本技术之一,其基本原理就是应用核酸链中碱基互补的原理（A-T，C-G），用已知的核酸（探针），通过杂交来检测样本中与探针同源的核酸序列。v根据杂交对象的不同可以分为DNA（模板）/DNA或RNA（探针）的杂交即Southern blotting；RNA（模板）/DNA或RNA（探针）杂交即Northern blotting。BBBBBBB用已知带标记的探针与固定用已知带标记的探针与固定于载体上的未知
43、模板杂交于载体上的未知模板杂交（或反之）（或反之）核酸分子杂交的必要条件v固相载体（液相杂交除外），常用的有硝酸固相载体（液相杂交除外），常用的有硝酸纤维素膜、尼龙膜、玻片、聚苯乙烯等。纤维素膜、尼龙膜、玻片、聚苯乙烯等。v带示踪物标记的探针，常用的有放射性同位带示踪物标记的探针，常用的有放射性同位素、地高辛（素、地高辛（Digoxigenin-11-dUTP)、生物、生物素（素（Biotin）等。）等。v经变性处理的待检模板。经变性处理的待检模板。v合适的杂交条件。合适的杂交条件。v示踪物检测系统。示踪物检测系统。探针标记v缺口移位法（缺口平移、缺口翻译）缺口移位法（缺口平移、缺口翻译）v末
44、端标记法末端标记法vPCR掺入法掺入法探针和模板的单链化v加热变性加热变性v碱变性碱变性标记示踪物的检测v放射性同位素的检测：感光胶片放射性同位素的检测：感光胶片v地高辛检测：地高辛检测：(Anti-Dig)Antibody-AP，底，底物为物为BCIP+NBTv生物素检测：生物素检测：Biotin-Streptavidin-APBCIP：5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-磷酸盐磷酸盐NBT；氯化四唑硝基蓝（氯化四唑氮蓝）；氯化四唑硝基蓝（氯化四唑氮蓝）标本v源于病人：血清源于病人：血清/血浆等血浆等v源于细胞：基因组源于细胞：基因组v源于培养物：细菌、病毒等源于培养物：细菌、病毒等v重组质粒
45、重组质粒v核酸扩增产物核酸扩增产物v其它其它Southern/Northern Blotting(Hybridization)Removeunboundprobeintact RNA or digested DNAHybridization探针模板杂交探针模板杂交地高辛标记法原理v将地高辛连接于dUTP第五位的嘌呤环上，形成Dig-dUTP。vDNA通过地高辛配基标记的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸（dUTP）随机插入结合而被标记。v杂交的靶DNA通过酶联免疫法与一个抗体复合物结合，接着在BCIP/NBT存在下，由酶催化反应，在杂交部位显色。DIG标记探针的标记探针的Southern blotting过
46、程示意图过程示意图杂交探针的标记：地高辛系统标杂交探针的标记：地高辛系统标记记 digoxigenin DIG dUTP-连接臂连接臂-甾醇半抗原甾醇半抗原 抗体抗体-显色酶交联复合物显色酶交联复合物斑点杂交试验斑点杂交试验0.01 l 0.1 l 1 l 100 50 40 30 20 10 5 2.5 1.25 0.625 ngbDNA技术技术捕捉添加子和标记添捕捉添加子和标记添加子与靶核酸杂交，加子与靶核酸杂交，并使靶结合于微孔并使靶结合于微孔前放大子与标记添前放大子与标记添加子杂交加子杂交加底物加底物 DioxitaneDioxitane 测量化学发光测量化学发光标记探针与放大子标记探
47、针与放大子杂交杂交放大子与前放大子放大子与前放大子杂交杂交加裂解缓冲液加裂解缓冲液靶核酸靶核酸Sample DNAEach spot contains known DNABiochipSchena(2000)Microarray Biochip Technology,p.A31Complementary DNA hybridizeSignal appearsBiochip Based on Hybridization Juang RH(2004)BCbasicsSouthern blot 应用v克隆基因的酶切图谱分析v基因组基因的定性及定量分析v基因突变分析v限制性片段长度多态性分析细胞转染细
48、胞转染v转染技术是指将外源分子如DNA，RNA等导入真核细胞的技术，它是研究基因表达调控，突变分析等的常规工具，随着功能研究的兴起，其应用越来越广泛。传统方法转染方法转染方法原理原理应用应用特点特点DEAE-右旋糖苷法右旋糖苷法带正电的 DEAE-右旋糖苷与核酸带负电的磷酸骨架相互作用形成的复合物被细胞内吞瞬时性转染相对简便、结果可重复但对细胞有一定的毒副作用 转染时需除血清磷酸钙法磷酸钙法磷酸钙 DNA 复合物吸附细胞膜被细胞内吞稳定转染瞬时性转染不适用于原代细胞操作简便但重复性差 有些细胞不适用电穿孔法电穿孔法高脉冲电压破坏细胞膜电位，DNA 通过膜上形成的小孔导入稳定转染瞬时性转染所有细
49、胞适用性广但细胞致死率高，DNA和细胞用量大，需根据不同细胞类型优化电穿孔实验条件阳离子性的脂质体法阳离子性的脂质体法（阳离子性与中性（阳离子性与中性脂质体混合物）脂质体混合物）带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物被细胞内吞稳定转染瞬时性转染所有细胞适用性广，转染效率高，重复性好但转染时需除血清 转染效果随细胞类型变化大 逆转录病毒介导法逆转录病毒介导法通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中稳定转染可用于难转染的细胞：原代细胞，体内细胞等但携带基因不能太大，操作复杂，耗时，需考虑安全因素Biolistic 颗粒传递法颗粒传递法将 DNA 用显微重金属颗粒沉淀，再将包被好的颗粒用弹道
50、装置投射入细胞，DNA 在胞内逐步释放，表达瞬时性转染可用于：人的表皮细胞，纤维原细胞，淋巴细胞系以及原代细胞显微注射法显微注射法用显微操作将 DNA 直接注入靶细胞核稳定转染瞬时性转染转染细胞数有限多用于工程改造或转基因动物的胚胎细胞转染技术Transfection细胞转染分类细胞转染分类瞬时性转染：外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。稳定转染：DNA整合到宿主细胞的染色体中或形成附加体。外源DNA整合到染色体中概率很小，大约1/104转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记反复筛
