1、第二章2022-12-102Contents细胞生存环境和代谢附着底物人工培养基1235体内、外细胞的差异和分化体外培养细胞的分型细胞相互关系细胞系（株）的建立87643组织培养细胞的生长和增殖过程2022-12-103 在个体发生过程中，细胞通过不断的生长和繁殖，数量增多，与此同时发生着分化。分化：及细胞在形态和功能上由一般发展到特殊的过程，由于分化的结果，形成了各种组织和器官。一、体内、外细胞的差异和分化一、体内、外细胞的差异和分化2022-12-104因模拟的培养条件与体内实际情况仍有很大差异，易发生以下变化：分化现象减少，形态和功能趋于单一，生存一定时间后衰退死亡或发生转化，变成有无限
2、生长能力的连续细胞系或恶性细胞系。如：腺细胞分泌机能丧失，肌细胞纤维细胞化。原因：细胞在人工培养以后，可能导致很多基因关闭，而导致分化 停止、功能丧失。可以利用这一点，来研究基因表达和调控。（一）差异（一）差异2022-12-105体外培养细胞分化能力并未完全丧失，只是因环境改变其分化表现和原体内不同。如：体内：成纤维细胞、骨细胞胶原 体外：成纤维细胞、上皮细胞、神经细胞、肿瘤细胞胶原。如何揭示细胞分化的条件，阐明分化调控的机制是主要的。（二）分化（二）分化2022-12-106据能否贴附在支持物上生长的性质，分：2、悬浮型(ES细胞，老鼠，初生培养；荧光，DAPI染色剂)1、贴附型(心肌细胞
3、，老鼠，初生培养)二、体外培养细胞的分型二、体外培养细胞的分型2022-12-107培养时能贴附在支持物上生长，大多数细胞呈贴附型生长。特点：1、分化现象变得不显著，易失去它们在体内时的原有特征。2、形态上常表现单一化的现象，并常反映其胚层起源，类似所谓“返祖”现象。如：起源于内、外胚层的细胞多呈上皮型。中胚层-呈成纤维细胞型。体外培养细胞的形态常表现有一般化的倾向。因此，判定细胞形态很难按体内细胞标准确定，仅大致分成以下几类：（一）贴附型（一）贴附型2022-12-108 与体内成纤维细胞的形态相似而得名。心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮（中胚层间充质起源）都呈此形态。成纤维细胞型1 1、成
4、纤维细胞型、成纤维细胞型2022-12-109 起源于内、外胚层细胞。如：皮肤表皮，消化管上皮、肝、胰、肺泡上皮等。上皮细胞型2 2、上皮细胞型、上皮细胞型2022-12-1010此型不稳定，有时难与其它细胞相区别。游走细胞型3 3、游走细胞型、游走细胞型2022-12-1011 除上述三型外，其它难以确定它们规律和形态的，统归为“多形细胞型”。如：神经组织的细胞。多型细胞型4 4、多形细胞型、多形细胞型2022-12-1012 培养细胞的形态受多种因素的影响，如：温度，二氧化碳，酸、碱、密度等。如：Hela细胞，本属上皮型，但过酸、过碱变成梭形。上皮细胞数量少时，呈星形或三角形。数量多时，呈
5、上皮型。它来源于美国的Helen Lane，她1951年死于子宫颈癌2022-12-1013培养时，不贴附与支持物上，而呈悬浮状态生长。如：某些癌细胞、白细胞。其优点：细胞生存空间大，容许长时间生长，能繁殖多量细胞，便于做细胞代谢研究。S180细胞（二）悬浮型（二）悬浮型2022-12-1014 体外培养细胞的生存空间和营养是有限的，当细胞增殖达到一定密度后，需要分离出一部分细胞和更新营养液。这一过程称“传代”。每次传代都要影响细胞生长过程。另外，体外生存期一般也不是无限的。（一）组织培养细胞生命期（二）组织培养细胞一代生长过程（三）细胞周期三、组织培养细胞的生长和增殖过程三、组织培养细胞的生
6、长和增殖过程2022-12-1015 培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。体内组织细胞的生存期与完整机体的死亡衰老基本相一致。大多生存一年左右，传3050代，相当150300个细胞周期，在全生存过程中大致经历以下三个阶段：1、第I期-原代培养期（初代培养期）从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，约14周。与体内细胞性状相似，适宜进行疫苗制备、药物测试、移植等。为保持二倍体体细胞性质，应在初代或传代后早期冰冻。（一）组织培养细胞生命期（一）组织培养细胞生命期2022-12-10162、第II 期-传代期 初代培养细胞一经传代后，便称做“细胞系”。此期，是生命期中持续时间最长、
7、细胞增殖旺盛，呈二倍体核型的细胞系称“二倍体细胞系”3、第III期-衰退期 细胞仍然生存，但不增殖或增殖很慢，细胞形态轮廓增强，最后衰退死亡。在细胞生命期阶段，少数情况下，在不明原因的影响，细胞可能发生自发转化。标志之一，是细胞获得不死性即持久性增殖能力，这样的细胞群体称“无限细胞系”。主要发生在II期，核型大多变成异倍体，转化后的细胞可能具有恶性性质，也可能仅有不死性而无恶性。（一）组织培养细胞生命期（一）组织培养细胞生命期2022-12-1017 初代培养 有限细胞系 无限细胞系接种培养第一次传代传代 传代间隔老化死亡转化指数细胞数量0 2 4 6 8 10 12 16 周 22 20 1
8、8 16 14 12 10 8 62022-12-1018 所有体外培养细胞，包括初代培养及各种细胞系，当生长达到一定密度后，都需做传代处理。传代的频率或间隔与接种数量、细胞生物学性状以及营养液的性质等有关。细胞的“一代”仅指从细胞接种到分离再培养时的一段时间。如：某一细胞系为第153代细胞，即指该细胞系已传代153次。它与细胞世代或倍增不同。在细胞一代中，细胞能倍增36次（二）组织培养细胞一代生长过程（二）组织培养细胞一代生长过程2022-12-1019细胞传一代后，一般要经过以下几个阶段：1、游离期（悬浮期）2、贴壁期3、潜伏期4、指数生长期5、停止期（二）组织培养细胞一代生长过程（二）组
9、织培养细胞一代生长过程来源：人体肾脏 形态：上皮细胞 生长特性：贴壁 注释：该细胞含腺病毒5 DNA 2022-12-10201、游离期（悬浮期）细胞接种后，在培养液中呈悬浮状态的阶段，细胞胞质回缩，胞体变成圆形。（二）组织培养细胞一代生长过程（二）组织培养细胞一代生长过程2022-12-10212、贴壁期：细胞附着于支持物上。原代细胞：24h内贴壁。连续细胞系：530分钟贴壁。单个细胞快于细胞团、组织块。贴壁与许多因素有关：培养基的酸度、污染，胶塞和培养器皿的清洁度，细胞本身的活性等等。血清中有许多促使细胞贴壁的冷析球蛋白（CIG）和纤粘素（FN）CIG与多聚赖氨酸联用，有利于细胞迅速贴壁。
10、贴壁后细胞变成放射延展细胞极性细胞再经过一个潜伏期阶段后，才进入生长期。细胞的贴壁和延展（二）组织培养细胞一代生长过程（二）组织培养细胞一代生长过程2022-12-10223、潜伏期：此时，细胞有生长活动，而无细胞分裂。原代细胞潜伏期：2496h 或更长。连续细胞系、肿瘤细胞潜伏期短：仅624h。潜伏期后，细胞分裂出现，并逐渐增多，进入指数生长期。（二）组织培养细胞一代生长过程（二）组织培养细胞一代生长过程2022-12-10234、指数生长期（对数生长期）此时期，细胞增殖旺盛，细胞数成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。此阶段可用细胞群体倍增时间、细胞分裂指数（MI）等来判断。MI：细胞群
11、中每1000个细胞中的分裂细0.20.5%，连续细胞系、肿瘤细胞的MI 可高达35%。持续35天，细胞数量增多，最后生长面积消失，细胞相互接触连接成片。此时，细胞由于相互接触而发生“接触抑制”。表现为细胞扩展运动停止。保证细胞不重叠生长。肿瘤细胞无接触抑制特征，能相互重叠，向三维空间发展，只要原因充分，细胞仍能分裂、增多。正常细胞生长汇合成单层时，细胞达到一定密度，细胞停止分裂，这种现象称“密度抑制”。导致细胞停止分裂。（二）组织培养细胞一代生长过程（二）组织培养细胞一代生长过程2022-12-10245、停止期：数量已达饱和，停止增殖，但仍有代谢活动，营养枯竭，代谢产物积累，PH降低，细胞会
12、中毒。通常，细胞长满瓶底80%时即传代，接种到23个新瓶中。（二）组织培养细胞一代生长过程（二）组织培养细胞一代生长过程2022-12-10252022-12-1026是指细胞每一次增殖所经历的全过程。每经过一个增殖周期，数量就增加一倍。据细胞周期不同时期的生化特点，可划分为四个连续 的时期：G1期（DNA合成前期）细胞间期 S 期（DNA合成期）主要是DNA的复制。G2期（DNA合成后期）M期（有丝分裂期）：完成染色体的分配。细胞完成一次细胞周期所需要的时间称为-“细胞周期时间”。（三）细胞周期（三）细胞周期2022-12-1027 S期：DNA合成期间期：是细胞代谢、DNA复制旺盛时期。G
13、1、G2：两个间隙 有丝分裂：细胞核及其染色体分裂。细胞分裂期：胞质分裂：细胞质分裂成两个子细胞。2022-12-1028有丝分裂过程2022-12-1029细胞生长的速度与细胞周期时间有关。正常细胞和肿瘤细胞相比较，细胞周期时间大致相接近的。如：人的正常肠上皮细胞的细胞周期时间是：13天。人的结肠癌细胞的细胞周期时间是：2.5天。急性白细胞的细胞周期时间是24天。正常白细胞的细胞周期时间是1天。所不同的是：正常细胞的增殖达到一定限度就停止了，而且增殖的细胞基本上相当于丢失的细胞数，总数始终保持相对恒定。肿瘤细胞是以持续的无限制增殖、永不停止。一般说来，哺乳动物的细胞周期为1030 h，其中间
14、期约10 h。（三）细胞周期（三）细胞周期2022-12-1030 在体外培养中，单个细胞也能生存和生长，有很大的独立性，但不是细胞永久存在的形式，不能长期生存，只有群体细胞才是细胞的基本存在形式。体外培养细胞间仍具有形态和功能的相互依存关系，细胞上仍有桥粒、缝隙连接，一旦两相邻细胞发生接触，便呈接触抑制现象，导致运动停止。四、细胞相互关系四、细胞相互关系2022-12-1031v无污染环境v温度v气体环境和氢离子浓度v基本营养物质v促生长因子、激素v渗透压五、细胞生存环境和代谢五、细胞生存环境和代谢2022-12-1032（一）无污染环境 无菌、无毒是保证细胞生存的首要条件。（二）温度：35
15、370C 39400C中1 h，有一定损伤，但仍可以恢复。41420C 中1 h，细胞严重损伤，但不致全部杀死，仍有可能恢复。430C时，很多细胞被杀死。温度00C：能抑制细胞代谢，并无伤害作用。40C数小时370C培养，细胞仍能生长。温度降至冰点以下，细胞可因胞质结冰而死亡。在培养液中加一定量保护剂（二甲基亚砜或甘油），封入安瓿中后，冻于液氮中，-1960C，能长期贮存，解冻后细胞复苏，仍能继续生长，细胞的生物性状不受任何影响，此为细胞保存的主要手段。五、细胞生存环境和代谢五、细胞生存环境和代谢2022-12-1033（三）气体环境和氢离子浓度（三）气体环境和氢离子浓度所需气体主要有O2，C
16、O2。1、O2：参与三羧酸循环，供能。缺O2，多数不能生长。一般，95%空气加5%CO2混合气体。O2 分压太高，对细胞也有毒害作用。2、CO2：既是细胞代谢产物，也是细胞所需成分，与维持培养液的PH有直接关系。大多数细胞PH7.27.4，但各种细胞对PH的要求也不完全相同。原代细胞一般对PH变动耐受性差，无限细胞系耐受性强。总的来说，细胞耐酸性比耐碱性大一些，在偏酸中更有利于生长。如：原代羊水细胞，PH6.8时最适。五、细胞生存环境和代谢五、细胞生存环境和代谢2022-12-1034细胞在生长过程中，不断释放CO2，培养液变酸，为维持培养液中PH的恒定，最常用的方法是加磷酸盐缓冲剂 其中，N
17、aHCO3 CO2能调节CO2的含量。NaHCO3+H2ONa+HCO3-+H2 ONa+H2CO3 +OH-Na+OH-+H2 O+CO2。CO2易于逸出，只适用于封闭式培养。开瓶培养时，需在5%CO2 气体环境中（CO2 培养箱）。为克服Na HCO3的缺点，也可用Hepes（羟乙基派嗪乙硫磺酸）它对细胞无毒性，是具有较强缓冲能力的氢离子缓冲剂。主要能稳定和抵抗快速PH变化。其最大优点：开瓶通气观察也能维持PH值。五、细胞生存环境和代谢五、细胞生存环境和代谢2022-12-1035（四）基本营养物质1、糖：葡萄糖、核糖、丙酮酸。2、12种基本氨基酸：精氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸
18、、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸、缬氨酸。谷氨酰胺：作为氮源、碳源，能促进各种氨基酸进入细胞。3、维生素：Vit A、D、E、K、B族、C。4、无机盐：Fe+、Zn+、Cu+。五、细胞生存环境和代谢五、细胞生存环境和代谢2022-12-1036（五）促生长因子、激素如：胰岛素-促进葡萄糖、氨基酸的吸收。氢化可的松-细胞粘着，增殖。（六）渗透压7.6个大气压（5776mmHg）=770KPa。五、细胞生存环境和代谢五、细胞生存环境和代谢2022-12-1037 半固体培养基按物理性状：液体培养基-最主要的。按来源分：天然培养基：合成培养基+血浆、血清、胎汁。合成培养基：据细胞所
19、需的严格配制。无血清培养基：增添促细胞生长因子。六、人工培养基六、人工培养基2022-12-1038 除少数悬浮型细胞外，绝大多数体外培养细胞需附着在适宜的底物上才能生长。细胞贴附底物生长的性质称“锚着依赖性”。原则上讲，凡对细胞无毒性的物质，都可用作底物。但不同的细胞对底物的要求各异，底物不合适，细胞生长不良。玻璃一次性塑料微载体饲细胞（也称滋养细胞）七、附着底物七、附着底物2022-12-1039（一）玻璃是最常用的培养底物，透明、便于观察、洗涤，能反复使用，质地以中性玻璃为上，适合于各种细胞附着生长。缺点：易破碎。（二）一次性塑料聚苯乙烯。经加工处理，表面具有亲水性，聚四氟乙烯。七、附着
20、底物七、附着底物2022-12-1040（三）微载体由聚苯乙烯和聚丙烯酰胺制成的小球体，附着面大，有利于大量繁殖细胞。天然葡萄糖聚合物（葡聚糖）作载体，直径 50 um或数百um不等，如：微载体培养系统。（四）饲细胞（也称滋养细胞）可用小鼠成纤维细胞或其它细胞长成单层后，再用大剂量射线照射，使细胞失去增殖力，但还存活，仍能进行代谢活动，可支持其它细胞生长。七、附着底物七、附着底物2022-12-1041（一）常用术语1、细胞培养：单个细胞在体外条件下的生长。2、组织或器官培养：是指组织、器官在体外的维持或生长，它们可以分化并保持原来的结构或功能。3、外植块：用于开始体外培养而切下的一小块组织或
21、器官。4、细胞系：原代培养物经首次传代成功后即成细胞系。如果细胞系不能继续传代或传代数有限-有限细胞系。如果细胞系可连续传代-连续细胞系，即已建成的细胞系。八、细胞系（株）的建立八、细胞系（株）的建立2022-12-10425、细胞一代时间：单个细胞两次连续分裂的时间间隔。6、再培养：单层细胞不经任何丢失而转移到新鲜培养基的过程。7、原代培养：从机体取得材料（细胞、组织或器官）在培养瓶内培养到第一次传代前，即为原代培养或初代培养。8、传代培养或传代：指将细胞从一个培养容器移植到另一培养容器中培养。八、细胞系（株）的建立八、细胞系（株）的建立2022-12-1043（二）建立细胞系（株）的要求
22、限于初代培养的细胞，只要供体均一，取材部位及组织种类等条件稳定，则无须多项鉴定。长期使用，特别是反复传代的细胞，有以下一些要求：1、组织来源2、细胞生物学检测3、培养条件和方法八、细胞系（株）的建立八、细胞系（株）的建立2022-12-10441、组织来源：所属物种（人或动物）、性别、年龄、所取的器官组织等。如系肿瘤组织，应说明临床和病理诊断、以及病理号。2、细胞生物学检测：如：细胞的一般形态、特异结构、细胞生长曲线、分裂指数、倍增指数、接种率等。如为肿瘤细胞，应力求说明细胞确系来源于肿瘤组织。3、培养条件和方法：指明使用的培养基、血清种类、用量以及细胞生存的适宜PH值。八、细胞系（株）的建立八、细胞系（株）的建立2022-12-1045
