1、1专题2 微生物的培养与应用课题课题1 微生物的实验室培养微生物的实验室培养2 了解有关培养基的基础知识，进行无了解有关培养基的基础知识，进行无菌技术的操作，进行微生物的培养。菌技术的操作，进行微生物的培养。一、课题目标：一、课题目标：掌握掌握培养基的制备培养基的制备、高压蒸气灭菌高压蒸气灭菌和和平板划线法平板划线法等基本操作技术，熟练、规范等基本操作技术，熟练、规范地进行无菌操作，成功地培养微生物。地进行无菌操作，成功地培养微生物。无菌技术的操作。无菌技术的操作。二、课题重点和难点：二、课题重点和难点：三、技能目标：三、技能目标：3课题背景课题背景微生物研究和应用的前提：微生物研究和应用的前
2、提：如何获得纯净培养物？如何获得纯净培养物？防止杂菌入侵，获得纯净的培养物防止杂菌入侵，获得纯净的培养物合适的营养和环境条件合适的营养和环境条件确保其他微生物无法混入确保其他微生物无法混入45细菌：细菌：单细胞不分枝单细胞不分枝 ，染料，染料后显微镜可见后显微镜可见6细胞壁：成分肽聚糖；细胞壁：成分肽聚糖；细胞膜；细胞膜；拟核：无染色体、无拟核：无染色体、无核膜、无核仁核膜、无核仁 质粒：小型环状质粒：小型环状DNADNA细胞器：只有核糖体细胞器：只有核糖体 2】、细菌的构造789SARS病毒、病毒、禽流感病毒禽流感病毒朊病毒（蛋白质病毒）1011举例举例3：真菌：真菌酵母菌酵母菌青霉菌青霉菌
3、青霉素青霉素12一一 基础知识基础知识1.概念：概念：人们按照人们按照微生物微生物对营养物质的不同需求，配对营养物质的不同需求，配制出供其制出供其生长繁殖的营养基质生长繁殖的营养基质。2.类型：类型：按物理性质划分：按物理性质划分：按化学成分划分：按化学成分划分：按用途划分：按用途划分：（一）培养基（一）培养基13固体培养基固体培养基液体培养基液体培养基有有 无无 凝固剂琼脂凝固剂琼脂分离分离 鉴定鉴定工业工业 生产生产（1 1）按物理性质划分：）按物理性质划分：14单个单个或少数菌体或少数菌体2.2.特征：特征：大小、形状、光泽度、颜色、透明度等。大小、形状、光泽度、颜色、透明度等。3.3.
4、意义：意义：1.1.定义：定义：鉴定菌种鉴定菌种的重要依据的重要依据固体固体培养基上培养基上大量繁殖大量繁殖子细胞群体子细胞群体菌落菌落15天然培养基天然培养基合成培养基合成培养基化学成分不恒定的化学成分不恒定的天然有机物天然有机物如：牛肉膏蛋白胨培养基、马铃薯培养基如：牛肉膏蛋白胨培养基、马铃薯培养基化学成分完全了解化学成分完全了解的物质配制而成的培养基的物质配制而成的培养基如：高氏如：高氏1 1号培养基、查氏培养基。用于号培养基、查氏培养基。用于分类和鉴定分类和鉴定（2 2）按化学成分划分：）按化学成分划分：16基础培养基基础培养基鉴别培养基鉴别培养基含有一般微生物生长繁殖所需的含有一般微
5、生物生长繁殖所需的基本营养物质基本营养物质将某种类微生物从混杂的微生物群体中将某种类微生物从混杂的微生物群体中分离分离出来出来用于用于鉴别鉴别不同类型微生物的培养基不同类型微生物的培养基选择培养基选择培养基（3 3）按用途划分：）按用途划分：17183.基本成分：基本成分：碳源、氮源、水、无机盐碳源、氮源、水、无机盐碳源碳源无机碳源：无机碳源：有机碳源：有机碳源：COCO2 2、COCO3 32 2-、HCOHCO3 3-牛肉膏、蛋白胨等牛肉膏、蛋白胨等自养微生物自养微生物异养微生物异养微生物氮源氮源无机氮源：无机氮源：有机氮源：有机氮源：NHNH4 4、NO3NO3-牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、
6、尿素牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等等注：含注：含C C、H H、O O、N N的有机物是异养型微生物的的有机物是异养型微生物的碳源、氮源、能源碳源、氮源、能源194.配制原则配制原则(1)目的明确：目的明确：(2)营养全面、浓度适宜、比例恰当营养全面、浓度适宜、比例恰当(3)适宜的适宜的pHpH值：值：有机碳源有机碳源异养型：异养型：根据微生物的根据微生物的种类、培养目的种类、培养目的选择原料选择原料自养型：自养型：不加碳源不加碳源加入缓冲剂加入缓冲剂细菌偏碱，真菌偏酸细菌偏碱，真菌偏酸（COCO2 2碳源）碳源）生产生产科研科研微生物生长不可缺少的微量有机物微生物生长不可缺少的微量有机物如：
7、维生素、氨基酸、碱基等如：维生素、氨基酸、碱基等 (4)特殊营养：特殊营养：20蛋白胨蛋白胨:动物蛋白初步消化的产物，富含有机氮化合物，动物蛋白初步消化的产物，富含有机氮化合物，也含有一些维生素和糖类。主要提供也含有一些维生素和糖类。主要提供氮源和维生素氮源和维生素。牛肉膏：牛肉膏：新鲜牛肉经过剔除脂肪、消化、过滤、浓缩而新鲜牛肉经过剔除脂肪、消化、过滤、浓缩而成，含有多肽类、氨基酸类、核苷酸类、有机酸类、矿物成，含有多肽类、氨基酸类、核苷酸类、有机酸类、矿物质类及维生素类的水溶性物质。提供质类及维生素类的水溶性物质。提供碳源、氮源、能源、碳源、氮源、能源、磷酸盐和维生素磷酸盐和维生素。21（
8、二）无菌技术（二）无菌技术防止外来杂菌的污染防止外来杂菌的污染1.哪里需要无菌？哪里需要无菌？2.如何控制无菌？如何控制无菌？无菌的意义：无菌的意义：22（1 1）实验操作的）实验操作的空间、操作者的衣着和手空间、操作者的衣着和手，进行，进行清洁和消毒清洁和消毒。（2 2）培养的）培养的器皿、接种用具和培养基器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。等器具进行灭菌。（3 3）为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在）为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火酒精灯火焰附近焰附近进行。进行。（4 4）实验操作时应避免已经）实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具灭菌处理的材料用具与周围的物品
9、与周围的物品相接触。相接触。1.无菌的范围无菌的范围23（1 1）消毒）消毒（2 2）灭菌）灭菌概念概念较为温和较为温和理化方法理化方法杀死杀死部分部分有害微生物有害微生物(不包括芽孢和孢子不包括芽孢和孢子)强烈强烈的理化因素的理化因素杀死杀死所有所有的微生物的微生物包括芽孢和孢子包括芽孢和孢子常用方法常用方法煮沸消毒法煮沸消毒法巴氏消毒法巴氏消毒法化学药剂消毒法化学药剂消毒法紫外线消毒法紫外线消毒法灼烧灭菌法灼烧灭菌法干热灭菌干热灭菌高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌适用对象适用对象操作空间、液体、双手等操作空间、液体、双手等接种环、接种针、玻璃接种环、接种针、玻璃器皿，培养基等器皿，培养基等2.无菌
10、的方法无菌的方法24芽孢：在某些细菌生长的一定阶段，细胞内形芽孢：在某些细菌生长的一定阶段，细胞内形成一个圆形、椭圆形或柱形的，抗逆性强的休眠成一个圆形、椭圆形或柱形的，抗逆性强的休眠体。体。孢子：真菌所产生的一种有繁殖或休眠作用的孢子：真菌所产生的一种有繁殖或休眠作用的细胞，能直接发育成新个体。细胞，能直接发育成新个体。25接种室内空气、接种接种室内空气、接种箱、超净工作台箱、超净工作台用紫外线照射用紫外线照射30min30min紫外线消毒紫外线消毒实验者的手臂、实验实验者的手臂、实验台等台等酒精、氯气、石炭酒精、氯气、石炭酸、煤酚皂溶液酸、煤酚皂溶液化学药剂消毒化学药剂消毒牛奶等不宜高温消
11、毒牛奶等不宜高温消毒灭菌的灭菌的70 75,30min；80,15min巴氏消毒巴氏消毒日常食物、罐装食品日常食物、罐装食品100,56min煮沸消毒法煮沸消毒法适用范围适用范围条件条件方法方法（1 1）消毒）消毒26151530min30min100kPa100kPa，121 121 培养基、实验培养基、实验器材器材高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌1 12h2h干热灭菌箱干热灭菌箱（160160170 170 ）耐高温需干燥耐高温需干燥的物品（玻璃的物品（玻璃器皿等）器皿等）干热灭菌干热灭菌烧红烧红酒精灯火焰充分酒精灯火焰充分燃烧层灼烧燃烧层灼烧接种的工具、接种的工具、试管口、瓶口试管口、瓶口灼烧灭
12、菌灼烧灭菌灭菌时间灭菌时间所需条件所需条件适用对象适用对象灭菌方法灭菌方法灼烧灭菌灼烧灭菌干热灭菌箱干热灭菌箱高压蒸汽灭菌锅高压蒸汽灭菌锅（2 2）灭菌）灭菌27请你判断以下材料或用具是否需要消毒或请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1 1）培养细菌用的培养基与培养皿培养细菌用的培养基与培养皿（2 2）玻棒、试管、烧瓶和吸管玻棒、试管、烧瓶和吸管（3 3）实验操作者的双手实验操作者的双手28微生物实验室培养的基本操作程序微生物实验室培养的基本操作程序1.1.器具的灭菌器具的灭菌2.2.培养基的配制培养基的配制3.3.培养基的
13、灭菌培养基的灭菌4.4.倒平板倒平板5.5.微生物接种微生物接种6.6.恒温箱中培养恒温箱中培养7.7.菌种的保存菌种的保存291.概念：概念：人们按照人们按照微生物微生物对营养物质的不同需求，配对营养物质的不同需求，配制出供其制出供其生长繁殖的营养基质生长繁殖的营养基质。2.类型：类型：按物理性质划分：按物理性质划分：（一）培养基（一）培养基30固体培养基固体培养基液体培养基液体培养基有有 无无 凝固剂琼脂凝固剂琼脂分离分离 鉴定鉴定工业工业 生产生产（1 1）按物理性质划分：）按物理性质划分：31接种室内空气、接种接种室内空气、接种箱、超净工作台箱、超净工作台用紫外线照射用紫外线照射30m
14、in30min紫外线消毒紫外线消毒实验者的手臂、实验实验者的手臂、实验台等台等酒精、氯气、石炭酒精、氯气、石炭酸、煤酚皂溶液酸、煤酚皂溶液化学药剂消毒化学药剂消毒牛奶等不宜高温消毒牛奶等不宜高温消毒灭菌的灭菌的70 75,30min；80,15min巴氏消毒巴氏消毒日常食物、罐装食品日常食物、罐装食品100,56min煮沸消毒法煮沸消毒法适用范围适用范围条件条件方法方法（1 1）消毒）消毒32151530min30min100kPa100kPa，121 121 培养基、实验培养基、实验器材器材高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌1 12h2h干热灭菌箱干热灭菌箱（160160170 170 ）耐高温需干燥
15、耐高温需干燥的物品（玻璃的物品（玻璃器皿等）器皿等）干热灭菌干热灭菌烧红烧红酒精灯火焰充分酒精灯火焰充分燃烧层灼烧燃烧层灼烧接种的工具、接种的工具、试管口、瓶口试管口、瓶口灼烧灭菌灼烧灭菌灭菌时间灭菌时间所需条件所需条件适用对象适用对象灭菌方法灭菌方法灼烧灭菌灼烧灭菌干热灭菌箱干热灭菌箱高压蒸汽灭菌锅高压蒸汽灭菌锅（2 2）灭菌）灭菌33大肠杆菌的纯化培养：大肠杆菌的纯化培养：（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基二二 实验操作实验操作（二）纯化大肠杆菌（二）纯化大肠杆菌341000ml1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的配方牛肉膏蛋白胨培养基的配方H2O 定容至定容至1
16、000mlNacl 5g蛋白胨蛋白胨 10g牛肉膏牛肉膏 5g琼脂琼脂20.0g1.1.计算：计算：培养基用量培养基用量依配方计算各成分的用量依配方计算各成分的用量2.2.称量：称量：3.3.溶化：溶化：牛肉膏黏稠，用称量纸称取牛肉膏黏稠，用称量纸称取牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加盖牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加盖牛肉膏、称量纸牛肉膏、称量纸 、少量水加热溶解、少量水加热溶解 取纸取纸蛋白胨、蛋白胨、NaClNaCl琼脂、搅拌琼脂、搅拌 补水定容补水定容4.4.调调pHpH、分装、封口：、分装、封口：5.5.灭菌：灭菌：6.6.倒平板：倒平板：加棉塞、包牛皮纸、橡皮筋勒紧加棉塞、包牛皮纸、橡皮
17、筋勒紧（一）制备培养基（一）制备培养基培养基高压蒸汽灭菌，培养皿干热灭菌培养基高压蒸汽灭菌，培养皿干热灭菌35计算计算称量称量溶化溶化调节调节pHpH灭菌灭菌倒平板倒平板（一）制备培养基（一）制备培养基1.1.将培养皿放在将培养皿放在火焰旁火焰旁的桌面上，右手拿的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拨出棉塞。装有培养基的锥形瓶，左手拨出棉塞。123 42.2.右手拿锥形瓶，使瓶口迅速右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰通过火焰。3.3.用左手将培养皿打开用左手将培养皿打开一条一条稍大于瓶口的稍大于瓶口的缝隙缝隙，右手将锥形瓶中的培养基，右手将锥形瓶中的培养基(约约101020mL)20mL)倒入
18、培养皿，左手倒入培养皿，左手立即盖上立即盖上皿盖。皿盖。4.4.等待平板等待平板冷却凝固冷却凝固（约需（约需5 5 10min10min）。）。然后，将平板然后，将平板倒过来倒过来放置，使皿盖在下，放置，使皿盖在下，皿底在上。皿底在上。361.1.培养基灭菌后，需要冷却到培养基灭菌后，需要冷却到5050左右时，才能用左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉温答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉温度下降到刚刚不烫手即可。度下降到刚刚不烫手即可。2.2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？为什么需要
19、使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。373.3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？平板冷凝后，为什么要将平板倒置？4.4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？培养微生物吗？为什么？答：答：防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染 避免培养基中水分过快蒸发。避免培养基中水分过快蒸发。答：最好不要用这个平板培养微生物。答：最好不要用这个平板培养微生物。防
20、止空气中的微生物可能在皿盖与皿底之防止空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。间的培养基上滋生。38无菌检查：将灭菌的培养基放入无菌检查：将灭菌的培养基放入3737的温室中的温室中培养培养24244848小时，观察是否有菌落存在以确定小时，观察是否有菌落存在以确定是否被污染或灭菌是否彻底。是否被污染或灭菌是否彻底。5.5.怎么确定所倒平板未被杂菌污染？怎么确定所倒平板未被杂菌污染？39单个单个或少数菌体或少数菌体1.1.定义：定义：固体固体培养基上培养基上大量繁殖大量繁殖子细胞群体子细胞群体（肉眼可见）（肉眼可见）菌落菌落2.2.特征：特征：大小、形状、光泽度、颜色、透明度等。大小、
21、形状、光泽度、颜色、透明度等。（二）纯化大肠杆菌（二）纯化大肠杆菌40单个细胞单个细胞单个菌落单个菌落（二）纯化大肠杆菌（二）纯化大肠杆菌从混杂的微生物群体中获得只含某一种微生物的过程。从混杂的微生物群体中获得只含某一种微生物的过程。何为分离纯化？何为分离纯化？如何纯化？如何纯化？接种接种常见常见方法方法平板划线法平板划线法操作操作核心核心防止杂菌污染，防止杂菌污染，保持培养物纯度保持培养物纯度如何分散成单个细胞？如何分散成单个细胞？稀释涂布平板法稀释涂布平板法斜面接种斜面接种穿刺接种穿刺接种微生物群微生物群分散分散411.1.平板划线法：平板划线法：分区划线法分区划线法连续划线法连续划线法（
22、1 1）概念与原理：）概念与原理：聚集的菌群聚集的菌群连续划线连续划线稀释分散稀释分散单个细胞单个细胞菌落菌落生长繁殖生长繁殖42(2)“平板划线平板划线”实验操作实验操作43第一区划线第一区划线灭菌接种环灭菌接种环第二区划线第二区划线灭菌接种环灭菌接种环第三区划线第三区划线灭菌接种环灭菌接种环灭菌接种环灭菌接种环44（1）为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接）为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时种环？在划线操作结束时,仍然需要灼烧接种环吗？为什么？仍然需要灼烧接种环吗？为什么？杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污
23、染环境和感染操作者和感染操作者接种结束后接种结束后杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线的菌杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端，从而种直接来源上次划线的末端，从而使每次划线使每次划线时菌种数目逐渐减少时菌种数目逐渐减少，直至得到单个细胞，直至得到单个细胞每次划线前每次划线前杀死接种环上原有微生物杀死接种环上原有微生物取菌种前取菌种前目的目的灼烧时期灼烧时期45（2）在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后）在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？再进行划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。答：以免接种环温度太高，杀死菌种。（3）在作第二次以及其后的划线操作时，
24、为什）在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？么总是从上一次划线的末端开始划线？答：线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一答：线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。463 3个划线平板个划线平板1 1个不划线平板个不划线平板（重复实验）（重复实验）（空白对照）（空白对照）（3 3）培养）培养放入放入3737恒温箱中培养恒温箱中培养12h12h24h24h4
25、72.2.稀释涂布平板法稀释涂布平板法菌液的梯度稀释：菌液的梯度稀释：涂布平板操作：涂布平板操作：(1)(1)概念与原理：概念与原理：聚集的微生物聚集的微生物单个细胞单个细胞菌液梯度稀释菌液梯度稀释菌落菌落涂布平板涂布平板(2)(2)操作：操作：生长繁殖生长繁殖48系列梯度稀释系列梯度稀释操作操作9mL9mL无菌水无菌水9mL9mL无菌水无菌水9mL9mL无菌水无菌水9mL9mL无菌水无菌水9mL9mL无菌水无菌水9mL9mL无菌水无菌水注意：注意：移液管需要经过移液管需要经过灭菌灭菌；试管口和移液管离；试管口和移液管离火焰火焰1 12cm2cm处。处。49涂布平板涂布平板操作：操作：50(1
26、)涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？步应如何进行无菌操作？答：应从操作的各个细节保证答：应从操作的各个细节保证“无菌无菌”。例如例如:酒精灯与培养皿的距离要合适酒精灯与培养皿的距离要合适 吸管头不要接触任何其他物体吸管头不要接触任何其他物体 吸管要在酒精灯火焰周围等等吸管要在酒精灯火焰周围等等51各梯度分别涂布各梯度分别涂布3个平板个平板1 1个不涂布作空白对照个不涂布作空白对照稀稀释释10103 3倍倍稀稀释释10104 4倍倍稀稀
27、释释10105 5倍倍放入放入3737恒温箱中培养恒温箱中培养12h12h24h24h（3 3）培养）培养521.1.临时保藏：临时保藏：试管固体斜面培养基上试管固体斜面培养基上442.2.长期保存：长期保存：菌种易被污染、变异菌种易被污染、变异甘油管藏甘油管藏1ml1ml甘油甘油1ml1ml菌液菌液2020三三 菌种的保存菌种的保存3 36 6个月，转移培养个月，转移培养53四四 成果评价成果评价如果未接种的培养基在恒温箱中保温如果未接种的培养基在恒温箱中保温1 12d2d后无后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。需要重新制备。（二
28、）接种操作是否符合无菌要求（二）接种操作是否符合无菌要求如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求。则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求。（一）培养基的制作是否合格（一）培养基的制作是否合格54（三）是否进行了及时细致的观察与记录（三）是否进行了及时细致的观察与记录培养培养12h12h与与24h24h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，及时观察记录的同学会发现这一点，并能不同，及时观察记录的同学会发现这一点，并能观察到其他一些细微的变化。观察到其他一些细微的变化。55
