1、第六章第六章 个别细胞和组织的培养个别细胞和组织的培养类型：类型：正常细胞培养正常细胞培养肿瘤细胞培养肿瘤细胞培养第一节第一节 正常细胞培养正常细胞培养v正常细胞，在体外培养时都正常细胞，在体外培养时都不易生长，建不易生长，建立细胞系更难。立细胞系更难。v正常细胞难培养的正常细胞难培养的原因是它们是分化的细原因是它们是分化的细胞，对体外生存条件要求严格胞，对体外生存条件要求严格.v但只要一切条件适当仍有培养成功可能。但只要一切条件适当仍有培养成功可能。一、上皮细胞类培养一、上皮细胞类培养v上皮细胞可来源于外、内、中三个胚层；上皮细胞可来源于外、内、中三个胚层；v培养中只有源于外和内胚层的细胞能
2、反映出上培养中只有源于外和内胚层的细胞能反映出上皮细胞的特征，细胞呈膜状生长的特点。皮细胞的特征，细胞呈膜状生长的特点。v上皮细胞培养有三个难点：上皮细胞培养有三个难点：需求特殊底物，如在底物上涂有胶原底层则需求特殊底物，如在底物上涂有胶原底层则利于细胞生长；利于细胞生长；需求特殊培养基；需求特殊培养基；与上皮细胞相邻的成纤维细胞常与上皮细胞与上皮细胞相邻的成纤维细胞常与上皮细胞同时混杂生长，并常压过上皮细胞。同时混杂生长，并常压过上皮细胞。v纯化和延长上皮细胞生存期纯化和延长上皮细胞生存期是上皮细胞培养是上皮细胞培养的关键之一。的关键之一。(一一)表皮细胞培养表皮细胞培养1特点特点：v在有胶
3、原的底物上易生长在有胶原的底物上易生长；v把人或小鼠表皮细胞培养在以把人或小鼠表皮细胞培养在以3T3 细胞为饲养层细胞为饲养层(用射线照射用射线照射后后)上时，细胞易生长并可发生一定程度的分化现象。上时，细胞易生长并可发生一定程度的分化现象。v降低降低pH、Ca2+的含量和温度等，均利于表皮细胞生长。的含量和温度等，均利于表皮细胞生长。v向培养基中加氢化可的松向培养基中加氢化可的松(10 g/m1)、10-6M的异丙基肾上的异丙基肾上腺素腺素(Isoproterenol)和和10 ng/m1 促表皮生长因子促表皮生长因子(EGF)能能促表皮细胞生长。促表皮细胞生长。v【饲细胞【饲细胞】饲细胞饲
4、细胞(Feeder Cells)也称滋养也称滋养细胞，是一层经过射线照射或丝裂霉素伤害处理细胞，是一层经过射线照射或丝裂霉素伤害处理的、用作克隆细胞附着底物的细胞层。的、用作克隆细胞附着底物的细胞层。v饲细胞作用：饲细胞作用：v有同化营养液的能力有同化营养液的能力。v饲细胞能促克隆细胞的生长，利于克隆的形成饲细胞能促克隆细胞的生长，利于克隆的形成。克隆形成后饲细胞渐死亡，换液时清除。克隆形成后饲细胞渐死亡，换液时清除。饲细胞的制备：饲细胞的制备：(1)取原代培养的取原代培养的人或动物胚胎成纤维细胞人或动物胚胎成纤维细胞，90%汇合时制成细胞悬液，再按汇合时制成细胞悬液，再按103 细胞细胞/毫
5、升重新接毫升重新接种培养；种培养；(2)在细胞半汇合时，准备在细胞半汇合时，准备0.25g/ml 的丝裂霉素，的丝裂霉素，按按2ug/105 细胞的量加入到培养瓶中过夜；或用细胞的量加入到培养瓶中过夜；或用射线单次照射，剂量射线单次照射，剂量3050 戈瑞戈瑞(Gy)；(3)细胞经上述处理后，细胞经上述处理后，Hanks 液漂洗两次、更换培液漂洗两次、更换培养液、再培养养液、再培养24 小时，胰蛋白酶消化细胞制成悬小时，胰蛋白酶消化细胞制成悬液，按液，按5104/ml接种入新培养基中；接种入新培养基中；(4)48 小时后，即可用于细胞克隆之用。小时后，即可用于细胞克隆之用。2表皮细胞培养程序：
6、表皮细胞培养程序：(1)取材取材：取外科植皮或手术残余皮肤小块，以角化层薄者为佳，：取外科植皮或手术残余皮肤小块，以角化层薄者为佳，早产流产儿皮肤更好，切成早产流产儿皮肤更好，切成0.5 1cm2小块；小块；(2)EDTA 处理处理：先置入：先置入0.02 EDTA 中室温置中室温置5 分钟。分钟。(3)冷消化冷消化：换入：换入0.25%胰蛋白酶中，置胰蛋白酶中，置4过夜；过夜；(4)分离：分离：取出皮块，用血管钳或镊子把表皮与真皮层分开；取出皮块，用血管钳或镊子把表皮与真皮层分开；(5)温消化：温消化：取出表皮单独处理；用剪刀剪成更小的块后，取出表皮单独处理；用剪刀剪成更小的块后，置入新的置
7、入新的0.25胰蛋白酶中，胰蛋白酶中，37再消化再消化30 60 分钟；分钟；(6)制细胞悬液：制细胞悬液：用吸管轻轻反复吹打，使成细胞悬液；用吸管轻轻反复吹打，使成细胞悬液；(7)加培养液：加培养液：通过通过80 目不锈钢纱网滤过后，低速离心，吸目不锈钢纱网滤过后，低速离心，吸上清，直接加入上清，直接加入Eagle 液和液和20小牛血清小牛血清.(8)培养：培养：接种入碟皿中，接种入碟皿中，CO2 温箱培养。温箱培养。v注意事项：注意事项：冷消化目的在于使表皮和真皮结冷消化目的在于使表皮和真皮结合松散；合松散；如冷消化后分离下来的表皮膜自身如冷消化后分离下来的表皮膜自身也已松散，此时亦可直接
8、置入也已松散，此时亦可直接置入PBS 中用吸管中用吸管吹打制备细胞悬液；不再经过第二次消化。吹打制备细胞悬液；不再经过第二次消化。(二二)胃上皮细胞培养胃上皮细胞培养v适于胃上皮细胞生长的条件是：适于胃上皮细胞生长的条件是：胶原酶和透明质酸酶消化法并用消化细胞；胶原酶和透明质酸酶消化法并用消化细胞；应用胶原底物培养；应用胶原底物培养；制备含有特定成分的培养基；制备含有特定成分的培养基；v培养程序：培养程序：(1)取材取材：取胃溃疡或胃癌手术切除胃标本远端：取胃溃疡或胃癌手术切除胃标本远端非病非病变区变区粘膜少许；粘膜少许；(2)清洗清洗：用含庆大霉素：用含庆大霉素(400g/m1)和两性霉素和
9、两性霉素(2g/m1 的的Hanks)液漂洗后，用钝器剥离下粘膜，液漂洗后，用钝器剥离下粘膜，剪成剪成1mm大小；大小；(3)消化消化：在：在I 型胶原酶型胶原酶和和透明质酸酶透明质酸酶中，于中，于37中消中消化化80 分钟；分钟；(4)离心离心：收集细胞悬液，：收集细胞悬液，800 转转/分离心后，分离心后，Hanks 液漂洗两次；液漂洗两次；(5)接种接种：末次离心后加入含有：末次离心后加入含有1 2胎牛胎牛血清的完全培养基血清的完全培养基，接种入不同孔数的培养，接种入不同孔数的培养板中；接种量依不同实验目的而定。板中；接种量依不同实验目的而定。v细胞接种后一般在细胞接种后一般在16 小时
10、内贴壁，细胞呈小时内贴壁，细胞呈多角形，成岛状或片状生长，以后逐渐联接多角形，成岛状或片状生长，以后逐渐联接成片。初代培养可维持成片。初代培养可维持2 3 周，第一周末周，第一周末达高峰，最后逐渐衰退剥落。达高峰，最后逐渐衰退剥落。(三三)肝细胞培养肝细胞培养v肝脏具有取材方便和易于生长的优点，能获肝脏具有取材方便和易于生长的优点，能获得典型上皮细胞培养。得典型上皮细胞培养。1初代组织块培养：初代组织块培养：v肝组织做组织块培养效果很好。取新鲜肝脏，肝组织做组织块培养效果很好。取新鲜肝脏，先剥除被膜和血管等纤维成分，用刀或剪刀先剥除被膜和血管等纤维成分，用刀或剪刀把肝剪成把肝剪成1mm3 左右
11、的小块，采用贴壁培养左右的小块，采用贴壁培养法。肝组织易于贴壁，生长力好，一般次日法。肝组织易于贴壁，生长力好，一般次日即可出现生长晕。即可出现生长晕。2初代消化法培养：初代消化法培养：(1)把肝组织切成把肝组织切成2 4 立方毫米的小块，用不合钙镁立方毫米的小块，用不合钙镁的的BSS 液洗两次；液洗两次；(2)移入移入1:1 的的0.1胰蛋白酶和胰蛋白酶和0.1胶原酶胶原酶(都用无钙都用无钙镁镁BSS 配制配制)中，中，4冷消化冷消化10 12 小时后，通过小时后，通过250 微米和微米和64 微米尼龙网或不锈钢纱网滤过微米尼龙网或不锈钢纱网滤过(用纱布用纱布滤过亦可滤过亦可)；(3)收集细
12、胞、收集细胞、BSS 液洗液洗1 2 次、计数、接种培养；次、计数、接种培养；3肝脏灌流法：肝脏灌流法：v需用全肝，以较小动物如小鼠和大鼠为好需用全肝，以较小动物如小鼠和大鼠为好。(1)无菌解剖动物，取出肝脏，先用无菌解剖动物，取出肝脏，先用BSS 洗除血污；洗除血污；(2)取取5ml 注射器一支，吸取消化液后，把注射器一支，吸取消化液后，把注射器头轻轻插入肝注射器头轻轻插入肝管中管中，用线绳结扎牢固，以防消化液漏出，轻轻把消化液注，用线绳结扎牢固，以防消化液漏出，轻轻把消化液注入胆管系统，并不时轻柔压肝脏，以便消化液进入肝小叶中；入胆管系统，并不时轻柔压肝脏，以便消化液进入肝小叶中；消化液在
13、肝内停留消化液在肝内停留20 30 分后，在吸出消化液的同时并轻柔分后，在吸出消化液的同时并轻柔压肝脏，以使肝细胞脱落和消化液吸出；压肝脏，以使肝细胞脱落和消化液吸出；(3)待吸净消化液后，注入离心管中，低待吸净消化液后，注入离心管中，低速离心分离，用速离心分离，用RPMI 1640 培养基培培养基培养养(较其它培养基为好较其它培养基为好)，能获得较纯的，能获得较纯的肝上皮细胞和获较好的效果。肝上皮细胞和获较好的效果。(四四)内皮细胞培养内皮细胞培养v应用材料：应用材料：人脐带脐静脉、动物大动脉等，人脐带脐静脉、动物大动脉等，用灌流消化法获取细胞最为简便。用灌流消化法获取细胞最为简便。(1)取
14、产后的新鲜脐带；如不立即培养可保存取产后的新鲜脐带；如不立即培养可保存于于4中，但不宜超过中，但不宜超过12 小时；小时；无菌剪取无菌剪取长长10 15 厘米一段厘米一段。其它如胚胎和幼体动物的大血管，亦可用其它如胚胎和幼体动物的大血管，亦可用于培养；于培养；(2)先用三通注射器吸先用三通注射器吸温温PBS 液注入脐带的脐液注入脐带的脐静脉中，洗除残血静脉中，洗除残血；注入口处宜用线绳结；注入口处宜用线绳结扎，以防液体返流；扎，以防液体返流；(3)用血管钳夹紧脐带一端，从另端向脐静脉中用血管钳夹紧脐带一端，从另端向脐静脉中徐徐注入最终浓度为徐徐注入最终浓度为0.1的胶原酶的胶原酶，待末端，待末
15、端出现液体后结扎之，令充满血管，注入口亦出现液体后结扎之，令充满血管，注入口亦应结扎，以防液体返流，应结扎，以防液体返流，消化消化3 10 分钟分钟；(4)吸出含有内皮细胞的消化液，注入离心管中吸出含有内皮细胞的消化液，注入离心管中；为获取更多细胞，可再注入温为获取更多细胞，可再注入温PBS 冲洗冲洗2 3 次彻底清除干净残余细胞，一并注入离心管次彻底清除干净残余细胞，一并注入离心管中离心；中离心；(5)吸除上清，加吸除上清，加1640 培养液，制成细胞悬液，培养液，制成细胞悬液，接种入瓶皿中培养接种入瓶皿中培养，顺利时，顺利时2 3 天内细胞即天内细胞即可长成单层。可长成单层。v人脐带易于获
16、得，培养效果好；细胞生长后，人脐带易于获得，培养效果好；细胞生长后，一般传一般传6 7 代后即衰退，难以长期维持。代后即衰退，难以长期维持。用兔血管内皮细胞培养较好，可传用兔血管内皮细胞培养较好，可传10 30 代；代；v不同部位血管内皮细胞生物学性状不同，对不同部位血管内皮细胞生物学性状不同，对各种作用因素反应亦有很大差别。各种作用因素反应亦有很大差别。(五五)毛细血管内皮细胞培养毛细血管内皮细胞培养v毛细血管细小，结构简单，内皮细胞外有较毛细血管细小，结构简单，内皮细胞外有较多的结缔组织，进行分离培养有很大困难。多的结缔组织，进行分离培养有很大困难。v近年毛细血管培养已获成功；近年毛细血管
17、培养已获成功；v利用人的小儿包皮、人脾脏、牛肾上腺、癌利用人的小儿包皮、人脾脏、牛肾上腺、癌组织组织(如卵巢癌如卵巢癌)等均可；等均可；1材料：材料：v肿瘤条件培养基制备肿瘤条件培养基制备(1)取取C3H 小鼠的小鼠的S-180 实体肉瘤组织实体肉瘤组织；(2)胰蛋白酶消化胰蛋白酶消化，Dulbecco 改良改良Eagle 氏氏培养液培养液15m1(含含10小牛血清小牛血清)种到培养种到培养瓶中培养；瓶中培养；(3)在细胞生长接近完全汇合时，收集培养液制成条件培养基；在细胞生长接近完全汇合时，收集培养液制成条件培养基；再用含再用含10小牛血清的新培养液后，也每隔两天收集一次，小牛血清的新培养液
18、后，也每隔两天收集一次，可获多量条件培养基；可获多量条件培养基；(4)4000 转分离心后，再通过转分离心后，再通过0.22m 微孔滤膜滤过，微孔滤膜滤过，-20冻存备用冻存备用(临用前融解临用前融解)。v凝胶底层制备凝胶底层制备(1)取取60 mm Falcon 产培养皿，加产培养皿，加1%Difco 产明胶产明胶(用不合钙用不合钙和镁的和镁的Hanks 液配制液配制)，铺盖瓶底，形成薄层；，铺盖瓶底，形成薄层；(2)置置4过夜；用前再用少许培养液冲洗一次。过夜；用前再用少许培养液冲洗一次。2初代培养初代培养(1)取材取材：取新鲜牛肾上腺数个，先用：取新鲜牛肾上腺数个，先用Hanks 液洗除
19、血污；液洗除血污；(2)消化：消化：剥除被膜，分离出皮质，切成剥除被膜，分离出皮质，切成l mm3 小块，加小块，加0.5胶原酶室温中消化胶原酶室温中消化1 小时；每小时；每隔隔10 分钟用吸管吹打悬液令消化充分；分钟用吸管吹打悬液令消化充分；(3)过滤：过滤：通过不锈钢纱网滤过，网眼要求只允通过不锈钢纱网滤过，网眼要求只允许能通过小于许能通过小于110 微米长的毛细血管小段；微米长的毛细血管小段；(4)离心：离心：650 rpm，4，离心，离心7 分钟后，弃掉分钟后，弃掉上清胶原酶；上清胶原酶；(5)再离心：再离心：沉淀物用培养液重悬并离心，再重悬，再沉淀物用培养液重悬并离心，再重悬，再离心
20、，共两次；离心，共两次；(6)制细胞悬液：制细胞悬液：末次沉淀物仍用含末次沉淀物仍用含10小牛血清的小牛血清的Dulbecco 改良改良Eag1e 氏培养液重悬后，稍吹打；氏培养液重悬后，稍吹打；(7)接种：接种：接种入铺有明胶底层的培养皿中，接种入铺有明胶底层的培养皿中，37培养；培养；在培养头在培养头1 3 小时中，毛细血管小段和内皮细胞最小时中，毛细血管小段和内皮细胞最先贴附于底物上，而肾上腺细胞和成纤维细胞却仍先贴附于底物上，而肾上腺细胞和成纤维细胞却仍在培养液中漂浮；在培养液中漂浮；(8)换液：换液：吸除培养液，再吸除培养液，再加入肿瘤条件培养液加入肿瘤条件培养液；每两；每两天换液一
21、次。毛细血管小段一般成自天换液一次。毛细血管小段一般成自1 4 个内皮细个内皮细胞，胞，v以后每个小段在底物上慢慢展成特殊形态的细胞岛，以后每个小段在底物上慢慢展成特殊形态的细胞岛，能持续能持续2 5 天。天。3毛细血管内皮细胞分离培养：毛细血管内皮细胞分离培养：(1)初代培养初代培养2 3 天后，镜下确认几个毛细血天后，镜下确认几个毛细血管内皮细胞岛，在培养皿背面，用不脱色笔管内皮细胞岛，在培养皿背面，用不脱色笔划圈圈起；划圈圈起；(2)镜下检查，如圈内残有非内皮细胞时，可用镜下检查，如圈内残有非内皮细胞时，可用显微细针在倒置显微镜下挑除；用细胞解剖显微细针在倒置显微镜下挑除；用细胞解剖器也
22、可，宜在净化台无菌气流中、打开培养器也可，宜在净化台无菌气流中、打开培养皿盖进行，但时间不宜过长皿盖进行，但时间不宜过长(15 20 分钟分钟)；圈外非内皮细胞可用无菌胶刮刮除；圈外非内皮细胞可用无菌胶刮刮除；(3)用培养液漂洗两次，以去除漂浮细胞；用培养液漂洗两次，以去除漂浮细胞；(4)剩余内皮细胞岛如小剩余内皮细胞岛如小(5 20 个细胞个细胞)而少时，生长而少时，生长增殖常变得缓慢或完全不生长，此时需加入增殖常变得缓慢或完全不生长，此时需加入3T3等等饲细胞；饲细胞接种量为饲细胞；饲细胞接种量为4000 细胞细胞cm2；(5)当内皮细胞充满所有饲细胞空间后，用胰蛋白酶消当内皮细胞充满所有
23、饲细胞空间后，用胰蛋白酶消化、离心、加入肿瘤条件培养基；化、离心、加入肿瘤条件培养基；(6)接种入明胶底物皿中继续培养接种入明胶底物皿中继续培养(饲细胞死亡被淘汰饲细胞死亡被淘汰)，细胞增殖生长汇合后，按细胞增殖生长汇合后，按1:5 传代。传代。二、结缔组织类细胞培养二、结缔组织类细胞培养(一一)成纤维细胞培养成纤维细胞培养v包括人在内的各种成纤维细胞都很容易培养，包括人在内的各种成纤维细胞都很容易培养，也是其它组织培养时的副产物，极易获得。也是其它组织培养时的副产物，极易获得。v用人或动物胚体为好；动物可用小鼠或鸡胚，用人或动物胚体为好；动物可用小鼠或鸡胚，去头和内脏，剪成小碎块后，用胰蛋白
24、酶消去头和内脏，剪成小碎块后，用胰蛋白酶消化法培养；如为人胚，可取皮肤培养。幼儿化法培养；如为人胚，可取皮肤培养。幼儿包皮是培养成纤维细胞的很好对象。包皮是培养成纤维细胞的很好对象。小鼠成纤维细胞培养条件v12.514.5d胎龄的小鼠胎儿分离效果最好；胎龄的小鼠胎儿分离效果最好；v最佳培养基为最佳培养基为DMEM添加添加15%小牛血清；小牛血清；v第第3代细胞增殖最旺盛；代细胞增殖最旺盛；v室温条件下，室温条件下，0.125%胰蛋白酶消化时间以胰蛋白酶消化时间以810min为宜。为宜。v在培养在培养ES细胞时，应选择第细胞时，应选择第35代的小鼠成代的小鼠成纤维细胞作为饲养层细胞。纤维细胞作为
25、饲养层细胞。小鼠成纤维细胞；小鼠成纤维细胞；细胞来源：细胞来源：swiss小鼠胚胎小鼠胚胎(二二)巨噬细胞培养巨噬细胞培养v巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。v巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。但巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。但属不繁殖型细胞群，难以长期生存，好的条件下仅属不繁殖型细胞群，难以长期生存，好的条件下仅能生活能生活2 3周，因之多用作初代培养周，因之多用作初代培养。v巨噬细胞也能建成无限细胞系；大多来自小鼠，如巨噬细胞也能建成无限细胞系；
26、大多来自小鼠，如P388D-1、J774A1、RAW309、Cr.1 等。等。1培养技术要点：培养技术要点：v来源和取材来源和取材 巨噬细胞可来源于人胸水、腹巨噬细胞可来源于人胸水、腹水、血和透析液等材料。水、血和透析液等材料。v实验多从动物血液、肺、脾和胸腹腔获取，实验多从动物血液、肺、脾和胸腹腔获取，其中以从动物腹腔取材最常用。用其中以从动物腹腔取材最常用。用40g 的的PHA 注入腹腔中，能产生注入腹腔中，能产生6 8106 个细个细胞，而且无刺激性，效果较好。胞，而且无刺激性，效果较好。2培养方法：培养方法：v培养巨噬细胞可用各种方法和各种来源获取细胞，其培养巨噬细胞可用各种方法和各种
27、来源获取细胞，其中以小鼠腹腔取材法最为实用。人的材料除来源不同中以小鼠腹腔取材法最为实用。人的材料除来源不同外，培养方法大同小异。外，培养方法大同小异。v程序程序(1)实验前三天，向每只小鼠腹腔内注入无菌硫基乙酸实验前三天，向每只小鼠腹腔内注入无菌硫基乙酸肉汤肉汤1ml(勿注入肠内勿注入肠内)；(2)引颈杀死动物；手提鼠尾将全鼠浸入引颈杀死动物；手提鼠尾将全鼠浸入70酒精中酒精中3 5 秒；秒；(3)置动物于解剖台上，用针头固定四肢，双手持镊撕置动物于解剖台上，用针头固定四肢，双手持镊撕开皮肤拉向两侧，暴露出腹膜，但勿伤及腹膜壁；开皮肤拉向两侧，暴露出腹膜，但勿伤及腹膜壁；(4)再用再用70酒
28、精擦洗腹膜壁后，用注射器吸酒精擦洗腹膜壁后，用注射器吸10ml Eag1e 液注入腹腔中，同时从两侧用手指揉压腹膜液注入腹腔中，同时从两侧用手指揉压腹膜壁，令液体在腹腔内充分流动；壁，令液体在腹腔内充分流动；(5)用针头轻轻挑起腹壁，使动物体微倾向一侧，使用针头轻轻挑起腹壁，使动物体微倾向一侧，使腹腔中液体集于针头下吸取入针管内；腹腔中液体集于针头下吸取入针管内；(6)小心拔出针头，把液体注入离心管中，小心拔出针头，把液体注入离心管中，(4)离离心心10 分钟后，去上清，加分钟后，去上清，加10 ml Eagle 培养基；培养基；(7)计数细胞，每只小鼠可产生计数细胞，每只小鼠可产生20 30
29、106 细胞，细胞，其中其中90为巨噬细胞；为巨噬细胞；(8)为获取为获取3105 个贴附细胞平方厘米，需接种个贴附细胞平方厘米，需接种2.5106m1；(9)为纯化培养细胞，去除其它白细胞，接种数小时为纯化培养细胞，去除其它白细胞，接种数小时后，去除培养液，用后，去除培养液，用Eagle 液冲洗液冲洗1 2 次后，再次后，再加新加新Eagle 培养液置培养液置37 CO2 温箱中培养。温箱中培养。三、肌组织细胞培养三、肌组织细胞培养v以心肌和骨骼肌培养较为实用。以心肌和骨骼肌培养较为实用。(一一)骨骼肌细胞培养骨骼肌细胞培养v动物胚或幼体的动物胚或幼体的大腿肌组织为最好的培养材料大腿肌组织为
30、最好的培养材料。取。取材常用生后材常用生后1 2 天的乳鼠天的乳鼠(Wistar 大鼠更好大鼠更好)。(1)取材取材：杀死动物，无菌取大腿肌组织，切成杀死动物，无菌取大腿肌组织，切成0.3 0.5 厘米小块；厘米小块；(2)消化消化：用不含钙镁离子的用不含钙镁离子的Hanks 液配的液配的0.25胰胰蛋白酶消化，无菌纱网或纱布滤过，合成培养基加蛋白酶消化，无菌纱网或纱布滤过，合成培养基加10小牛小牛(或马或马)血清培养，血清培养，为促进分化可加为促进分化可加1 的的胎汁；胎汁；(3)接种：接种：细胞接种量为细胞接种量为2106/皿；接种在胶原或明皿；接种在胶原或明胶的底物上能促进细胞分化。胶的
31、底物上能促进细胞分化。v明胶制备比较简单，常用明胶制备比较简单，常用Hanks 液配的液配的0.01明明胶。胶。v生长特点：生长特点：细胞生长开始呈纺锤形，培养细胞生长开始呈纺锤形，培养50 52 小时后将出现融合形成肌细胞状多核纤维。数日小时后将出现融合形成肌细胞状多核纤维。数日后融合停止，此时能观察到横纹。一般在融合后后融合停止，此时能观察到横纹。一般在融合后二三天内能见到收缩现象；因收缩运动有时可导二三天内能见到收缩现象；因收缩运动有时可导致细胞从底物脱离。致细胞从底物脱离。(二)心肌细胞培养v最常用材料：最常用材料：v鸡胚心肌、小鼠、大鼠以及人胎儿心肌等都鸡胚心肌、小鼠、大鼠以及人胎儿
32、心肌等都可应用可应用。v心肌是比较容易培养和生长的组织，可应用心肌是比较容易培养和生长的组织，可应用多种方法进行培养，如多种方法进行培养，如悬滴培养、组织块培悬滴培养、组织块培养和消化培养法养和消化培养法等，主要取等，主要取心室肌心室肌培养，均培养，均能获得良好的生长效果。能获得良好的生长效果。v程序程序(1)选新鲜受精鸡卵，置温箱中孵育选新鲜受精鸡卵，置温箱中孵育(温箱中放有水槽，以维持温箱中放有水槽，以维持箱内湿度箱内湿度)；每日翻动一次；每日翻动一次(180 度度)，孵育，孵育9 12 天；天；(2)取鸡胎；取鸡胎；(3)用眼科剪剪开胸腔，剥出心脏，置入皿中用用眼科剪剪开胸腔，剥出心脏，
33、置入皿中用Hanks 液漂洗液漂洗1 2 次；次；(4)小心剪除大的动静脉，保留心室肌；用小心剪除大的动静脉，保留心室肌；用组织块或消化培养组织块或消化培养法均可法均可。初代培养的鸡胚心肌呈纺锤形，。初代培养的鸡胚心肌呈纺锤形，v纯化及生长特点：纯化及生长特点：常杂有成纤维细胞和内皮细胞；常杂有成纤维细胞和内皮细胞；心肌细胞心肌细胞亦较其它成分贴壁慢，可反复贴壁法排除其它细胞成分。在亦较其它成分贴壁慢，可反复贴壁法排除其它细胞成分。在培养成功时，相差显微镜下可观察到横纹；一周后便可出现培养成功时，相差显微镜下可观察到横纹；一周后便可出现节律性收缩现象。节律性收缩现象。乳鼠心肌细胞原代培养乳鼠心
34、肌细胞原代培养四、神经组织细胞培养四、神经组织细胞培养v神经组织主要由两种神经细胞神经组织主要由两种神经细胞(神经元和神经胶神经元和神经胶质细胞）组成。质细胞）组成。v神经元为高度分化的细胞，在组织发生晚期已神经元为高度分化的细胞，在组织发生晚期已失掉增殖能力，对生存条件要求高，失掉增殖能力，对生存条件要求高，只有在适只有在适宜情况下，如接种在胶原底层上，或在加入神宜情况下，如接种在胶原底层上，或在加入神经生长因子经生长因子(NGF)和胶质细胞因子时，才能生和胶质细胞因子时，才能生存，并可能出现一定程度的分化现象，如长出存，并可能出现一定程度的分化现象，如长出突起等，但却难使之增殖；突起等，但
35、却难使之增殖；即使培养胚胎组织即使培养胚胎组织情况也是如此。情况也是如此。v神经胶质细胞为较易培养成分，它分少突、神经胶质细胞为较易培养成分，它分少突、星形和小胶质三种星形和小胶质三种。神经胶质细胞与神经元神经胶质细胞与神经元有共存关系。有共存关系。人脑胶质瘤细胞人脑胶质瘤细胞大鼠大鼠c6胶质细胞胶质细胞v(一一)初代培养初代培养 神经元能发生一定分化现象，如生长突起，神经元能发生一定分化现象，如生长突起，但因无增殖能力，最后衰退死亡；但神经胶但因无增殖能力，最后衰退死亡；但神经胶质尤以星形细胞能继续生存和分裂增殖。质尤以星形细胞能继续生存和分裂增殖。v(二二)传代培养传代培养 神经胶质细胞是
36、神经组织中比较容易培养的神经胶质细胞是神经组织中比较容易培养的成分。不仅能获得生长的胶质细胞并可形成成分。不仅能获得生长的胶质细胞并可形成能传代的二倍体细胞系。能传代的二倍体细胞系。(三三)培养方法培养方法v人脑组织可用于神经胶质细胞培养，培养组织来自人脑组织可用于神经胶质细胞培养，培养组织来自手术室无菌取脑髓灰质或白质均可用于培养，手术室无菌取脑髓灰质或白质均可用于培养，1程序：程序：(1)细胞悬液制备：细胞悬液制备：获取脑组织后，先仔细剥除脑膜获取脑组织后，先仔细剥除脑膜和血管等纤维成分，置入和血管等纤维成分，置入Hanks 液中漂洗液中漂洗1 2 次次后，置于后，置于30 50倍的倍的H
37、anks 液中；脑组织比较柔液中；脑组织比较柔软，反复吹打即可制备成细胞悬液；软，反复吹打即可制备成细胞悬液；(2)排除脂肪成分和其它碎块排除脂肪成分和其它碎块：把悬液注入离心管中，：把悬液注入离心管中，在室温直立在室温直立5 10 分钟后，细胞或细胞团块自然下分钟后，细胞或细胞团块自然下沉，脂肪等杂物易漂浮于悬液表层，吸除上清，如沉，脂肪等杂物易漂浮于悬液表层，吸除上清，如此反复二三次可获较多的细胞成分；此反复二三次可获较多的细胞成分；(3)滤过、计数、接种：滤过、计数、接种：向末次沉降物中加入适向末次沉降物中加入适量营养液，通过纱网或纱布滤过，计数细胞量营养液，通过纱网或纱布滤过，计数细胞
38、并调整好细胞密度，接种入培养瓶或皿中，并调整好细胞密度，接种入培养瓶或皿中，置置5C02 温箱中培养；温箱中培养；(4)传代：传代：细胞生长汇合后，可用细胞生长汇合后，可用0.25胰蛋白胰蛋白酶消化法做传代处理。酶消化法做传代处理。2生长特点：生长特点：v接种后初期，细胞可能出现飘浮不贴壁现象，接种后初期，细胞可能出现飘浮不贴壁现象，贴壁后在短期内也可能不见细胞分裂现象；贴壁后在短期内也可能不见细胞分裂现象；细胞适应环境过程较长，然而一旦生长后，细胞适应环境过程较长，然而一旦生长后，即能进入较旺盛的增殖状态。即能进入较旺盛的增殖状态。v生长开始常杂有巨噬细胞、成纤维细胞和上生长开始常杂有巨噬细
39、胞、成纤维细胞和上皮细胞等，传二、三代后，这些成分即消失，皮细胞等，传二、三代后，这些成分即消失，逐渐形成均一的星形胶质细胞，一般形成连逐渐形成均一的星形胶质细胞，一般形成连接不甚紧密的单层细胞接不甚紧密的单层细胞第二节第二节 肿瘤细胞培养肿瘤细胞培养v肿瘤细胞在组织培养中占有核心的位置，首肿瘤细胞在组织培养中占有核心的位置，首先癌细胞是比较容易培养的细胞，当前建立先癌细胞是比较容易培养的细胞，当前建立的细胞系中癌细胞系是最多的。的细胞系中癌细胞系是最多的。v肿瘤细胞培养是研究癌变机理、抗癌药检测、肿瘤细胞培养是研究癌变机理、抗癌药检测、癌分子生物学极其重要的手段。癌分子生物学极其重要的手段。
40、培养方法培养方法v肿瘤细胞培养成功关键在于：取材、成纤维细胞肿瘤细胞培养成功关键在于：取材、成纤维细胞的排除、选用适宜的培养液和培养底物等几个方的排除、选用适宜的培养液和培养底物等几个方面。面。v初代培养应用组织块和消化培养法均可。初代培养应用组织块和消化培养法均可。一、要点一、要点1取材：取材：v人肿瘤细胞来自外科手术或活检瘤组织。取材时人肿瘤细胞来自外科手术或活检瘤组织。取材时尽量避免用退变组织，要尽量避免用退变组织，要挑选活力较好的部位。挑选活力较好的部位。癌性转移淋巴结或胸腹水是好的培养材料。癌性转移淋巴结或胸腹水是好的培养材料。2培养基：培养基：v肿瘤细胞对培养基的要求不如正常细胞严
41、格，一肿瘤细胞对培养基的要求不如正常细胞严格，一般常用的般常用的RPMI l640、DMEM、Mc-Coy5A 等培等培养基等皆可用于肿瘤细胞培养。肿瘤细胞对血清养基等皆可用于肿瘤细胞培养。肿瘤细胞对血清的需求比正常细胞低，正常细胞培养不加血清不的需求比正常细胞低，正常细胞培养不加血清不能生长，肿瘤细胞在低血清培养基中也能生长。能生长，肿瘤细胞在低血清培养基中也能生长。肿瘤细胞对培养环境适应性较大。肿瘤细胞对培养环境适应性较大。v培养肿瘤细胞仍需加血清和相关生长因子培养更培养肿瘤细胞仍需加血清和相关生长因子培养更易成功。易成功。3成纤维细胞的排除：成纤维细胞的排除：v成纤维细胞常与肿瘤细胞同时
42、混杂生长，致成纤维细胞常与肿瘤细胞同时混杂生长，致难以纯化肿瘤细胞。而且成纤维细胞常比肿难以纯化肿瘤细胞。而且成纤维细胞常比肿瘤细胞生长得快，最终能压制肿瘤细胞的生瘤细胞生长得快，最终能压制肿瘤细胞的生长。因此排除成纤维细胞成为肿瘤细胞培养长。因此排除成纤维细胞成为肿瘤细胞培养中的关键。中的关键。成纤维细胞排除法1机械刮除法：机械刮除法：v是用不锈钢丝末端插有橡胶刮头是用不锈钢丝末端插有橡胶刮头(用胶塞剪成三角形插以不用胶塞剪成三角形插以不锈钢丝锈钢丝)，或裹少许脱脂棉制成，装入试管中高压灭菌后备，或裹少许脱脂棉制成，装入试管中高压灭菌后备用用(也可用特制电热烧灼器刮除也可用特制电热烧灼器刮除
43、)。刮除程序为：。刮除程序为：(1)标记：镜下观察，用不脱色笔在培养瓶皿的背面圈下生长标记：镜下观察，用不脱色笔在培养瓶皿的背面圈下生长肿瘤细胞的部位；肿瘤细胞的部位；(2)刮除：弃掉培养液，把无菌胶刮伸入瓶皿中，肉眼或显微刮除：弃掉培养液，把无菌胶刮伸入瓶皿中，肉眼或显微镜窥视下，刮除无标记空间；镜窥视下，刮除无标记空间；(3)用用Hanks 液冲洗一两次，洗除被刮掉的细胞；液冲洗一两次，洗除被刮掉的细胞；(5)注入培养液继续培养，如发现仍有成纤维细胞残留，可重注入培养液继续培养，如发现仍有成纤维细胞残留，可重复刮除至完全除掉为止。复刮除至完全除掉为止。2反复贴壁法：反复贴壁法：v根据肿瘤细
44、胞比成纤维细胞贴壁速度慢的特点，根据肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁速度慢的特点，并结合使用不加血清的营养液，并结合使用不加血清的营养液，(1)细胞生长达一定数量后，倒出旧培养液，用胰酶细胞生长达一定数量后，倒出旧培养液，用胰酶消化后，消化后，Hanks 冲洗冲洗2 次，加入不含血清的培养次，加入不含血清的培养液，吹打制成细胞悬液；液，吹打制成细胞悬液；(2)编号为编号为A、B、C 三个培养瓶；首先把悬液接种三个培养瓶；首先把悬液接种入入A 培养瓶中，置温箱中静止培养培养瓶中，置温箱中静止培养520 分钟后，分钟后，轻轻倾斜培养瓶，让液体集中瓶角后慢慢吸出全轻轻倾斜培养瓶，让液体集中瓶角后慢慢吸出全部
45、培养液，再接种入部培养液，再接种入B 培养瓶中后；向培养瓶中后；向A 瓶中补瓶中补充少许完全培养液置温箱中继续培养；充少许完全培养液置温箱中继续培养；(3)B瓶中细胞瓶中细胞520 分钟后，按处理分钟后，按处理A 的方法，把的方法，把培养液注入培养液注入C 培养瓶中；再向培养瓶中；再向B 瓶中补加完全培瓶中补加完全培养基。养基。v当三个瓶内都含有培养液后，均在温箱中继当三个瓶内都含有培养液后，均在温箱中继续培养。如操作成功，次日观察可见续培养。如操作成功，次日观察可见A 瓶主瓶主要为成纤维细胞，要为成纤维细胞，B 瓶两类细胞相杂，瓶两类细胞相杂，C 瓶瓶可能主要为癌细胞。必要时可反复处理多次，
46、可能主要为癌细胞。必要时可反复处理多次，直至癌细胞纯化为止。直至癌细胞纯化为止。3消化排除法：消化排除法：(1)先是用先是用0.5胰蛋白酶和胰蛋白酶和0.02EDTA(1:1)混合液漂洗培养细胞一次，然后再换成新的混合液漂洗培养细胞一次，然后再换成新的混合液继续消化，并在倒置显微镜下窥视和混合液继续消化，并在倒置显微镜下窥视和不时摇动培养瓶，到半数细胞脱落下来后，不时摇动培养瓶，到半数细胞脱落下来后，便立即停止消化；便立即停止消化；(2)把消化液吸入离心管中，离心去上清，吸把消化液吸入离心管中，离心去上清，吸入另瓶中，加培养液置温箱中培养；向原瓶入另瓶中，加培养液置温箱中培养；向原瓶内也补加新
47、的培养液继续培养。用此法处理内也补加新的培养液继续培养。用此法处理后，后，成纤维细胞比肿瘤细胞易先脱落成纤维细胞比肿瘤细胞易先脱落，经过，经过几次反复处理，可能把成纤维细胞除净。几次反复处理，可能把成纤维细胞除净。4胶原酶消化法：胶原酶消化法：v本法是本法是利用成纤维细胞对胶原酶较为敏感利用成纤维细胞对胶原酶较为敏感的特点的特点，通过消化进行选择。，通过消化进行选择。(1)可用可用05mgml 的胶原酶消化处理，边的胶原酶消化处理，边消化边在倒置显微镜下窥视，当发现成纤消化边在倒置显微镜下窥视，当发现成纤维细胞被除掉后，即终止消化；维细胞被除掉后，即终止消化；(2)用用Hanks 洗涤处理一次
48、后，更换新培养洗涤处理一次后，更换新培养液，继续培养，可获纯净肿瘤细胞。如成液，继续培养，可获纯净肿瘤细胞。如成纤维细胞末被除净，可再次重复。纤维细胞末被除净，可再次重复。5其它方法：其它方法：v有人发现有人发现聚丙烯酰胺有抑制成纤维细胞生长的作聚丙烯酰胺有抑制成纤维细胞生长的作用用；也有人用聚蔗糖制备成比重；也有人用聚蔗糖制备成比重1.025 1.085 的的密度梯度离心液，加入细胞悬液后，在密度梯度离心液，加入细胞悬液后，在23中中800g 离心离心10 分钟。在比重分钟。在比重1.025 1.050 层为成层为成纤维细胞，在比重纤维细胞，在比重1.065 1.085 层为上皮细胞，层为上
49、皮细胞，再经过分离进行培养。最近也有人应用特殊化学再经过分离进行培养。最近也有人应用特殊化学物如物如SOD 抑制成纤维细胞生长的方法。抑制成纤维细胞生长的方法。v选用上述任何一种方法，都需进行试验，取得必选用上述任何一种方法，都需进行试验，取得必要经验，找出适合的条件，才能获得好的效果。要经验，找出适合的条件，才能获得好的效果。二、提高肿瘤细胞培养存活率和生长率措施二、提高肿瘤细胞培养存活率和生长率措施1适宜底物：适宜底物：v如：把经过纯化的细胞接种在不同的底物上，如鼠如：把经过纯化的细胞接种在不同的底物上，如鼠尾胶原底层、饲细胞层等。尾胶原底层、饲细胞层等。2生长因子：生长因子：v应用促细胞
50、生长因子，向培养液中增加一种或几种应用促细胞生长因子，向培养液中增加一种或几种促细胞生长因子。根据细胞种类不同选用不同的促促细胞生长因子。根据细胞种类不同选用不同的促生长物，常用有胰岛素、氢化可的松、雌激素以及生长物，常用有胰岛素、氢化可的松、雌激素以及其它生长因子。其它生长因子。3动物体媒介培养：动物体媒介培养：v为提高肿瘤细胞对体外培养环境的适应力和增加有为提高肿瘤细胞对体外培养环境的适应力和增加有活力癌细胞活力癌细胞(干细胞干细胞)的数量，可采用动物体转嫁接的数量，可采用动物体转嫁接种成瘤后，再从动物体内取出进行培养，能提高体种成瘤后，再从动物体内取出进行培养，能提高体外培养的成功率。受
