1、临床免疫学检验临床免疫学检验固相膜免疫分析技术固相膜免疫分析技术固相膜免疫分析技术固相膜免疫分析技术概述：概述：随着免疫学技术和相关生物化学技术的随着免疫学技术和相关生物化学技术的发展，检测方法上派生出了多种类型的固相发展，检测方法上派生出了多种类型的固相膜免疫膜免疫快速检测快速检测试验。该类试验的最大特点试验。该类试验的最大特点是不需要大型设备，对检测人员稍加培训即是不需要大型设备，对检测人员稍加培训即能掌握操作要求和判定标准。能掌握操作要求和判定标准。固相膜免疫分析技术：固相膜免疫分析技术：是以微孔膜作为固相载体，利用液体可以流过是以微孔膜作为固相载体，利用液体可以流过微孔膜也可通过毛细管
2、作用在膜上向前移行的特性，微孔膜也可通过毛细管作用在膜上向前移行的特性，以酶标记或者各种有色颗粒（如彩色胶乳、胶体金、以酶标记或者各种有色颗粒（如彩色胶乳、胶体金、或胶体硒等）标记抗原或抗体作为标记物，通过抗或胶体硒等）标记抗原或抗体作为标记物，通过抗原抗体反应进行抗原或抗体检测的快速检验方法。原抗体反应进行抗原或抗体检测的快速检验方法。常用的固相膜常用的固相膜玻璃纤维素玻璃纤维素(fiberglass)膜膜尼龙尼龙(nylon)膜膜聚偏氟乙稀聚偏氟乙稀(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜膜硝酸纤维素硝酸纤维素（nitrocellulose，NC）膜膜固相膜的特点固相
3、膜的特点多孔性多孔性 滤纸滤纸 毛细管作用毛细管作用非共价键高度吸附抗体或抗原非共价键高度吸附抗体或抗原 高度敏感性高度敏感性易于漂洗易于漂洗 操作简便操作简便固相膜的技术要求固相膜的技术要求孔径：穿流法的膜一般选择孔径：穿流法的膜一般选择0.4m0.4m左右；横流左右；横流法的膜可选择法的膜可选择5m5m10m10m流速：孔径和分布结构影响膜的流动速率，孔流速：孔径和分布结构影响膜的流动速率，孔径大，流速快。以径大，流速快。以ml/cm2/minml/cm2/min表示表示蛋白质结合力：吸附力很强，以蛋白质结合力：吸附力很强，以g/cmg/cm2 2表示表示均一性均一性 优质的膜具有良好的均
4、一性。优质的膜具有良好的均一性。固相固相NC膜膜固相膜免疫测定的特点固相膜免疫测定的特点优点优点不足之处不足之处简便，快速简便，快速敏感度略低，价格略高（与敏感度略低，价格略高（与ELISAELISA比）比）单份测定单份测定精密度较差，质控困难精密度较差，质控困难保存期长（优质试剂）保存期长（优质试剂）稳定性较差（普通试剂）稳定性较差（普通试剂）可测定物范围广（主要为定性试验）可测定物范围广（主要为定性试验）不易制备定量、半定量试剂不易制备定量、半定量试剂感染性疾病的诊断感染性疾病的诊断妊娠、排卵的诊断妊娠、排卵的诊断肿瘤标志肿瘤标志心肌标志心肌标志滥用药物滥用药物固相微孔膜测定种类固相微孔膜
5、测定种类 斑点金免疫渗滤试验斑点金免疫渗滤试验(dot immunogold filtration assay,DIGFA)斑点金免疫层析试验斑点金免疫层析试验（dot immunogold chromatographic assay,DICA）斑点斑点ELISA(dot enzyme linked immunosorbent assay,Dot-ELISA)酶联免疫斑点试验酶联免疫斑点试验(enzyme linked immunospot,ELISPOT)免疫印迹法免疫印迹法(immunoblotting test,IBT)放射免疫沉淀试验放射免疫沉淀试验(radioimmunoprecip
6、itation assay,RIPA)常用的标志物常用的标志物o酶和有色微粒子酶和有色微粒子o彩色胶乳彩色胶乳o荧光素荧光素o胶体金和胶体硒等胶体金和胶体硒等o其中以胶体金和荧光素最为常用胶体金免疫技术胶体金免疫技术（免疫金标记技术或金免疫技术）o 胶体金免疫技术（胶体金免疫技术（colloidal gold immunoassay）是以胶体金作为标记物（示踪剂或显色剂），是以胶体金作为标记物（示踪剂或显色剂），应用于抗原抗体反应的一种标记免疫测定技术。应用于抗原抗体反应的一种标记免疫测定技术。o 1971年由年由Faulk和和Taylor始创，最初用于免疫电始创，最初用于免疫电镜技术。镜技术
7、。o 目前得以广泛应用。目前得以广泛应用。胶体金免疫技术胶体金免疫技术 o 金免疫测定技术：斑点免疫金金免疫测定技术：斑点免疫金渗滤渗滤试验试验 斑点免疫金斑点免疫金层析层析试验试验o 金免疫组织化学染色技术：金免疫组织化学染色技术：金免疫金免疫电镜电镜染色技术染色技术 金（银）免疫金（银）免疫光镜光镜染色技术染色技术 胶体金与免疫金的制备胶体金与免疫金的制备o 1.胶体金的特性及制备胶体金的特性及制备o 2.免疫金的制备免疫金的制备 胶体金与免疫金的制备胶体金与免疫金的制备o 1.胶体金的特性及制备胶体金的特性及制备胶体金的结构胶体金的结构 胶体金特性胶体金特性胶体金的制备胶体金的制备 胶体
8、金鉴定胶体金鉴定 和保存和保存注意事项注意事项 胶体金的结构胶体金的结构o 胶体金（胶体金（colloidal gold）也称金）也称金溶胶（溶胶（gold solution），是由），是由金金盐盐被还原成被还原成金原子金原子后形成的金后形成的金颗粒悬液。颗粒悬液。o 胶体金颗粒由一个基础金核（胶体金颗粒由一个基础金核（原子金原子金Au）及包围在外）及包围在外的双离子层构成，紧连在金核表面的是内层的双离子层构成，紧连在金核表面的是内层负离子负离子（AuC12），外层离子层），外层离子层H+则分散在胶体间溶液中则分散在胶体间溶液中o 金颗粒间金颗粒间静电静电相互排斥而悬浮形成一种稳定的胶体状态。
9、相互排斥而悬浮形成一种稳定的胶体状态。o 胶体金颗粒的基础金核并非是理想的圆球核，较小的胶体胶体金颗粒的基础金核并非是理想的圆球核，较小的胶体金颗粒基本是圆球形的，较大的胶体金颗粒（一般指大于金颗粒基本是圆球形的，较大的胶体金颗粒（一般指大于30nm以上的）多呈椭圆形。在电子显微镜下可观察胶体以上的）多呈椭圆形。在电子显微镜下可观察胶体金的颗粒形态金的颗粒形态。胶体金特性胶体金特性o（1）胶体金一般性质：）胶体金一般性质：胶体金颗粒大小多在胶体金颗粒大小多在1100nm，微小金颗，微小金颗粒稳定地、均匀地、呈单一分散状态悬浮在液粒稳定地、均匀地、呈单一分散状态悬浮在液体中，成为胶体金溶液。胶体
10、金因而具有胶体体中，成为胶体金溶液。胶体金因而具有胶体的多种特性，特别是对电解质的敏感性的多种特性，特别是对电解质的敏感性。（2）呈色性和光吸收性：对同一种物质的水溶胶金颗粒来）呈色性和光吸收性：对同一种物质的水溶胶金颗粒来说，粒子大小不同，颜色亦不同：说，粒子大小不同，颜色亦不同：o 胶体金颗粒在胶体金颗粒在520nm之间，吸收波长之间，吸收波长520nm，呈，呈葡萄酒红色。葡萄酒红色。o 胶体金颗粒胶体金颗粒2040nm之间吸收波长之间吸收波长530nm，液体为，液体为深红色，深红色，60nm的金溶液主要吸收波长的金溶液主要吸收波长600nm，金溶，金溶液呈兰紫色，若离心去掉较大的金颗粒，
11、溶胶呈红色。液呈兰紫色，若离心去掉较大的金颗粒，溶胶呈红色。o 根据这一特点，用肉眼观察胶体金的颜色或吸收峰波长根据这一特点，用肉眼观察胶体金的颜色或吸收峰波长大小可粗略估计金颗粒的大小。大小可粗略估计金颗粒的大小。呈色和光吸收性呈色和光吸收性粒子大小不同，光吸收性不同，颜色亦不同：粒子大小不同，光吸收性不同，颜色亦不同：o 1020nm，吸收峰，吸收峰530nm，呈橙色。，呈橙色。o 2080nm，吸收峰，吸收峰600nm，呈紫红色。，呈紫红色。o 根据这一特点，可用肉眼观察胶体金的颜色或吸收峰波根据这一特点，可用肉眼观察胶体金的颜色或吸收峰波长大小可粗略估计金颗粒的大小。长大小可粗略估计金
12、颗粒的大小。稳定性稳定性o 稳定稳定:颗粒做布朗运动不易受重力影响而下沉颗粒做布朗运动不易受重力影响而下沉.o 又不稳定又不稳定:自身因素与外部因素自身因素与外部因素.o 自身因素自身因素:相互碰撞而合并为较大颗粒而下沉。相互碰撞而合并为较大颗粒而下沉。o 外部因素外部因素:电解质、浓度、温度、稳定剂。电解质、浓度、温度、稳定剂。胶体金的制备胶体金的制备 制备原理制备原理 o 向一定浓度的向一定浓度的氯金酸氯金酸溶液内加入一定量的溶液内加入一定量的还原还原剂剂，使金离子变成金原子，形成金颗粒悬液。，使金离子变成金原子，形成金颗粒悬液。o 常用的还原剂：白磷、硼氢化钠、抗坏血酸、常用的还原剂：白
13、磷、硼氢化钠、抗坏血酸、柠檬酸钠柠檬酸钠、鞣酸等。、鞣酸等。技术要点技术要点p 最常用的制备方法为柠檬酸三钠还原法最常用的制备方法为柠檬酸三钠还原法柠檬酸盐还原法：柠檬酸盐还原法：先配制先配制HAuCl4HAuCl4水溶液，加热至沸水溶液，加热至沸搅动下准确加入一定量的柠檬酸三钠水溶液搅动下准确加入一定量的柠檬酸三钠水溶液继续加热煮沸一定时间。此时可观察到淡黄色的氯金继续加热煮沸一定时间。此时可观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸钠加入后很快便灰色，继而转成黑色，酸水溶液在柠檬酸钠加入后很快便灰色，继而转成黑色，随后逐渐稳成红色随后逐渐稳成红色冷却至室温后用蒸馏水恢复至原体积冷却至室温后用蒸馏水
14、恢复至原体积 四种粒径胶体金的制备及特性四种粒径胶体金的制备及特性鉴定和保存鉴定和保存o 指标：粒径大小，均一度，有无凝集指标：粒径大小，均一度，有无凝集o 粗略：日光；分光光度计粗略：日光；分光光度计o 电镜：统计胶体金的平均粒径。电镜：统计胶体金的平均粒径。良好的胶体金应该是清亮透明的。良好的胶体金应该是清亮透明的。若混浊或表面有漂浮物，提示有较多的凝集若混浊或表面有漂浮物，提示有较多的凝集颗粒。颗粒。胶胶 体体 金（金（1560 nm）优优 质质劣劣 质质o 室温、避光、无尘、洁净器皿：室温、避光、无尘、洁净器皿：3个月。个月。加入少许防腐剂（如加入少许防腐剂（如0.02NaN3）可有利
15、）可有利于保存。于保存。o 4,半年。半年。o-20-20o 尽快标记 鉴定和保存鉴定和保存注意事项注意事项 o（1）氯金酸易潮解，应干燥、避光保存。）氯金酸易潮解，应干燥、避光保存。o（2）氯金酸对金属有强烈的腐蚀性，因此在配制氯金）氯金酸对金属有强烈的腐蚀性，因此在配制氯金酸水溶液时，不应使用金属药匙称量氯金酸。酸水溶液时，不应使用金属药匙称量氯金酸。o（3）用于制备胶体金的蒸馏水应是双蒸馏水或三蒸馏）用于制备胶体金的蒸馏水应是双蒸馏水或三蒸馏水，或者是高质量的去离子水。水，或者是高质量的去离子水。o（4）用以制备胶体金的玻璃容器必须是绝对清洁的，）用以制备胶体金的玻璃容器必须是绝对清洁的
16、，用前应先经酸洗并用蒸馏水冲净。最好是经硅化处理的，用前应先经酸洗并用蒸馏水冲净。最好是经硅化处理的，硅化方法可用硅化方法可用5二氯甲硅烷的氯仿溶液浸泡数分钟，二氯甲硅烷的氯仿溶液浸泡数分钟，用蒸馏水冲净后干燥备用。用蒸馏水冲净后干燥备用。免疫金的制备免疫金的制备o 概念：免疫金（概念：免疫金（immunogold）是指胶体是指胶体金与金与Ag或或Ab的结合物的结合物,有时称之为金探针。有时称之为金探针。o 原理：原理：不明，物理吸附，靠静电力相互吸引而牢固结不明，物理吸附，靠静电力相互吸引而牢固结合。不影响蛋白质的生物活性。合。不影响蛋白质的生物活性。目前多认为：o 当溶液的当溶液的pH值等
17、于或略高于蛋白质的值等于或略高于蛋白质的PI时，时，蛋白质分子的表面张力最大，易于吸附在金蛋白质分子的表面张力最大，易于吸附在金颗粒的表面。颗粒的表面。o 由于蛋白质分子牢固地结合在金的表面，形由于蛋白质分子牢固地结合在金的表面，形成一个蛋白层，阻止了胶体金颗粒的相互接成一个蛋白层，阻止了胶体金颗粒的相互接触，从而使金溶胶处于稳定状态触，从而使金溶胶处于稳定状态。技术要点技术要点(1)胶体金溶液的胶体金溶液的pH值调整：调节至值调整：调节至PI或偏碱。或偏碱。(2)蛋白质最适标记量的确定：系列稀释蛋白，加一蛋白质最适标记量的确定：系列稀释蛋白，加一定量胶体金，定量胶体金，NaCl,以红色保持不
18、变而蛋白含量最以红色保持不变而蛋白含量最低的一管为最适标记量。低的一管为最适标记量。(3)标记过程；搅拌、加一定量稳定剂（标记过程；搅拌、加一定量稳定剂（BSA/PEG）。）。(4)标记物纯化标记物纯化:超速离心法、超速离心法、凝胶过滤法。凝胶过滤法。免疫金的保存免疫金的保存 免疫金复合物最终用稀释液配制成工作浓度保存。稀释免疫金复合物最终用稀释液配制成工作浓度保存。稀释液通、常是加入含稳定剂的缓冲液。缓冲溶液常用中性液通、常是加入含稳定剂的缓冲液。缓冲溶液常用中性的的PBS或或Tris缓冲液。缓冲液。PEG和和BSA是最常用的稳定剂。是最常用的稳定剂。稳定剂有两大作用：为保护胶体金的稳定性，
19、使之便稳定剂有两大作用：为保护胶体金的稳定性，使之便于长期保存；为防止或减少免疫金复合物的非特异性于长期保存；为防止或减少免疫金复合物的非特异性吸附反应。吸附反应。胶体金免疫测定技术胶体金免疫测定技术一、斑点金免疫渗滤试验一、斑点金免疫渗滤试验(dot immunogold filtration assay DIGFA)二、斑点金免疫层析试验二、斑点金免疫层析试验(dot immunogold chromatographic assay DICA)一、一、双抗体夹心法为例：双抗体夹心法为例：o 将将Ab点加在固相载体点加在固相载体NC膜上膜上(。o 当滴加在膜上的标本液体渗滤过膜时，标本中含当
20、滴加在膜上的标本液体渗滤过膜时，标本中含Ag被膜上被膜上Ab捕获。捕获。o 其后加入的其后加入的免疫金免疫金与已结合在膜上的与已结合在膜上的Ag相结合。相结合。o 因胶体金本身呈红色，阳性反应即在膜中央显示红因胶体金本身呈红色，阳性反应即在膜中央显示红色斑点色斑点主要由渗滤装置、胶体金标记物、洗涤液、抗原参照品或抗主要由渗滤装置、胶体金标记物、洗涤液、抗原参照品或抗体阳性对照品四部分组成。其中渗滤装置是由塑料小盒、吸体阳性对照品四部分组成。其中渗滤装置是由塑料小盒、吸水垫料和已点加抗原或抗体的硝酸纤维素膜片三部分组成。水垫料和已点加抗原或抗体的硝酸纤维素膜片三部分组成。试剂盒一般都设有质控点，
21、质控点的大小或形状都不同于检试剂盒一般都设有质控点，质控点的大小或形状都不同于检测点，有的用大小点区分、有的用点横线区分，有的用横竖测点，有的用大小点区分、有的用点横线区分，有的用横竖线区分线区分（二）方法类型（二）方法类型o 1双抗体夹心法双抗体夹心法 o 2间接法间接法DIGFA双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原AB操作：加样操作：加样A；加加金标记物金标记物；洗涤洗涤B，观察观察阳性阴性间接法测抗体间接法测抗体阳性阴性固相膜固相膜固相固相抗原抗原待测待测抗体抗体金标二抗人金标二抗人人人IgGIgG快速检测（渗滤法）原理图快速检测（渗滤法）原理图二、二、斑点金免疫层析试验斑点金免疫层析试
22、验（dot immunogold chromatographic assay)原理：原理：o 滴加在膜一端的标本受膜的毛细管作用向另一滴加在膜一端的标本受膜的毛细管作用向另一端移动，端移动，犹如层析一般，犹如层析一般，被分析物与固定于载被分析物与固定于载体膜上某一区域的体膜上某一区域的AbAb或或AgAg结合，无关物则越过结合，无关物则越过该区域而被分离，然后通过胶体金的呈色条带该区域而被分离，然后通过胶体金的呈色条带来判定实验结果来判定实验结果。试纸条组成结构试纸条组成结构测试线测试线 （T线）线）控制线（控制线（C线）线）胶体金垫胶体金垫吸水滤纸吸水滤纸样品垫样品垫NC膜（硝酸纤维素膜）膜
23、（硝酸纤维素膜）层析方向层析方向PVC底板底板有有4 4个组分：、吸水纸（样品垫）。、玻璃纤维膜个组分：、吸水纸（样品垫）。、玻璃纤维膜（胶体金垫胶体金垫）。）。膜上吸附膜上吸附着干燥的金标抗体（流动带）。、硝酸纤维素膜，膜上包被着抗原或抗体条着干燥的金标抗体（流动带）。、硝酸纤维素膜，膜上包被着抗原或抗体条带和能与标记物直接起反应的质控物条带（检测带）。、吸水纸。以上各组带和能与标记物直接起反应的质控物条带（检测带）。、吸水纸。以上各组份首尾互相衔接。份首尾互相衔接。o 斑点金免疫层析斑点金免疫层析：以以NCNC膜为载体，结合膜为载体，结合抗原抗原抗体反应抗体反应、金标技术金标技术与蛋白质与
24、蛋白质层析层析技术的快技术的快速固相膜免疫分析技术。速固相膜免疫分析技术。DIGFA 穿流（穿流（flow through）DICA 横流（横流（lateral flow）(二二)方法类型方法类型 o 1.1.双抗体夹心法双抗体夹心法o 2.2.竞争法竞争法/抑制法抑制法 o 3.3.间接法间接法 1.Goldtestcontrol 结果观察结果观察 阳性阳性阴性阴性无无效效Goldtestcontrol2.2.竞争法测抗原竞争法测抗原标准抗原标准抗原Goldtestcontrol标本标本阴性结果阴性结果Goldtestcontrol结果观察结果观察 阳性阳性阴性阴性无效无效3.3.间接法测抗
25、体间接法测抗体o 待测血清标本中含有大量的非特异性待测血清标本中含有大量的非特异性IgG，o 降低了试验敏感性降低了试验敏感性.o 为消除其影响，间接法常设计成：为消除其影响，间接法常设计成：反流免疫反流免疫层析法层析法。o 与特异性与特异性IgG竞争结合金标抗人竞争结合金标抗人IgG，缺点：缺点：间接法间接法(反流免疫层析反流免疫层析)？AGoldB观察窗EFMarkerCTCT非特异性抗体非特异性抗体待测抗体待测抗体金标抗体金标抗体羊抗兔羊抗兔IgG 胶体金免疫组化技术胶体金免疫组化技术o 一、免疫金一、免疫金电镜电镜染色技术染色技术o 二、免疫金（银）二、免疫金（银）光镜光镜染色技术染色
26、技术免疫金电镜染色技术免疫金电镜染色技术 金标记物与待检标本的相应蛋白质发生结合反应金标记物与待检标本的相应蛋白质发生结合反应,由于胶体金颗粒具有由于胶体金颗粒具有高电子密度高电子密度的特性。的特性。原理原理 电镜电镜下观察，在金标蛋白结合处可见黑褐色颗粒，下观察，在金标蛋白结合处可见黑褐色颗粒，从而对细胞膜上或胞内蛋白质进行从而对细胞膜上或胞内蛋白质进行定性与定位定性与定位。原理：原理：金标记物与镍网上待检金标记物与镍网上待检Ag/AbAg/Ab发生结合反应发生结合反应 结合的金标蛋白黑褐色颗粒结合的金标蛋白黑褐色颗粒(电镜下电镜下)胶体金颗粒胶体金颗粒的的高电子密度的特性高电子密度的特性对
27、细胞膜上或细胞内的对细胞膜上或细胞内的Ag/AAg/Ab进行定性与定位进行定性与定位 原理原理 通过免疫反应，沉积在抗原位置的通过免疫反应，沉积在抗原位置的胶体金颗粒起胶体金颗粒起着一种催化剂作用着一种催化剂作用，用还原剂将银离子，用还原剂将银离子(Ag+)(Ag+)还原成银还原成银原子原子(Ag)(Ag)，被还原的，被还原的AgAg围绕金颗粒形成一个围绕金颗粒形成一个“银壳银壳”，“银壳银壳”一旦形成本身亦具有催化作用一旦形成本身亦具有催化作用，从而使更多，从而使更多银离子还原并促使银离子还原并促使“银壳银壳”越长越大越长越大“，最终使抗原，最终使抗原位置得到清楚放大。位置得到清楚放大。免疫
28、金（银）光镜染色技术免疫金（银）光镜染色技术 原理：原理：免疫反应免疫反应 胶体金颗粒胶体金颗粒(CG)沉积在沉积在Ag位置位置 CG 催化催化，对苯二酚还原剂，对苯二酚还原剂 银离子银离子(Ag+)还原成还原成 银原子银原子(Ag)银原子围绕金颗粒形成一个银原子围绕金颗粒形成一个“银壳银壳”“银壳银壳”催化催化，还原还原更多银离更多银离子子 “银壳银壳”越长越大越长越大,抗原位置得到清楚放大抗原位置得到清楚放大小结小结1 1 金免疫测定技术金免疫测定技术 斑点金免疫渗滤试验：原理、技术类型、技术要点斑点金免疫渗滤试验：原理、技术类型、技术要点 斑点金免疫层析试验：原理、技术类型、技术要点斑点
29、金免疫层析试验：原理、技术类型、技术要点2 2金免疫组织化学技术金免疫组织化学技术 免疫金免疫金(银银)光镜染色技术光镜染色技术 免疫金电镜染色技术免疫金电镜染色技术3 3 临床应用及评价：优点与缺点临床应用及评价：优点与缺点影响固相膜免疫试验的主要因素影响固相膜免疫试验的主要因素o 影响因素：试剂影响因素：试剂o试剂的选择：试剂的选择：注意试剂的注册号、批号、有效期和检注意试剂的注册号、批号、有效期和检验合格证等；不同批号的试剂不能混用；不能使用过期的验合格证等；不同批号的试剂不能混用；不能使用过期的试剂。试剂。o试剂的准备：试剂的准备：试剂在开封前应检查是否漏液、漏气；试剂在开封前应检查是
30、否漏液、漏气；使用前要在室温（使用前要在室温（18182525）下平衡）下平衡20min20min30min30min。影响固相膜免疫试验的主要因素影响固相膜免疫试验的主要因素o 影响因素：影响因素：标本标本o标本处理：标本处理：临床检测的标本有痰液、尿液、粪便、棉临床检测的标本有痰液、尿液、粪便、棉拭子、血清和血浆等。检测前，需进行相应的前处理，如拭子、血清和血浆等。检测前，需进行相应的前处理，如痰液或粪便，需用缓冲液或生理盐水稀释后，低速离心，痰液或粪便，需用缓冲液或生理盐水稀释后，低速离心，取上清进行检测。取上清进行检测。o标本保存：标本保存：对于采集的标本如不能立即检测，需要保对于采集
31、的标本如不能立即检测，需要保存在存在2288，不超过，不超过2424小时，超过小时，超过2424小时以上，需保存小时以上，需保存在在-20-20以下，忌反复冻以下，忌反复冻融融。影响固相膜免疫试验的主要因素影响固相膜免疫试验的主要因素o 影响因素：影响因素：实验过程实验过程温度及时间结果判定检测前要平衡至室温（1825）后再开袋使用。无特殊说明，检测的温度为182 5 ，时 间 在3Omin以内。一些胶体金诊断试剂条只用于初步诊断，确诊需采用免疫印迹实验进行。试剂条平衡 层析法技术优势层析法技术优势:简单简单 现场现场 快速快速1.打开包装取出试纸条2.直接插入待测样品中 3.目测读出结果（3
32、-10分钟内）与常规诊断方法相比与常规诊断方法相比 优点优点缺点缺点快速：全部检测过程仅需 3-10分钟。简便：不需其它任何仪器设备，操作也极其简单，无需专业人员，携带方便，可随时随地进行。廉价：单个测试条成本极低可单份检测：对标本既能成批检测，又可单份检测，可立刻拿到结果，不必等待。稳定性好：金标试剂稳定，可长期保存。检测标本种类多：既可用于查血，又可用于检尿或唾液，因而适合各种检查定量问题灵敏度问题临床应用及评价临床应用及评价o 1.免疫金技术具有操作简便、快捷以及操作人员不需免疫金技术具有操作简便、快捷以及操作人员不需技术培训，无需特殊仪器设备，试剂稳定，便于保存等技术培训，无需特殊仪器
33、设备，试剂稳定，便于保存等特点，因此特别符合特点，因此特别符合“床边检验床边检验”(point of care test,POCT)项目要求。项目要求。o 2.本法灵敏度不及酶标法和酶发光免疫测定法，在临本法灵敏度不及酶标法和酶发光免疫测定法，在临床应用中应引起高度重视。床应用中应引起高度重视。o 3.该技术不能准确定量，只能作为定性或半定量试验，该技术不能准确定量，只能作为定性或半定量试验，目前主要应用于正常体液中不存在的物质（如传染病抗目前主要应用于正常体液中不存在的物质（如传染病抗原和抗体以及毒品类药物等）和正常含量极低而在特殊原和抗体以及毒品类药物等）和正常含量极低而在特殊情况下异常升
34、高的物质（如情况下异常升高的物质（如HCG等）的检测。等）的检测。技术应用技术应用类别类别应用领域应用领域检测的物质检测的物质人类医学人类医学各级医院,血站,CDC,防疫站,诊断中心；家庭自检；商检系统；边检口岸；公安系统.传染病（乙肝五项,HIV,SARS等）标志物（AFP、肌钙蛋白、粪便血红蛋白等）女性妊娠（hCG(早孕),LH,FSH)毒品（吗啡,K粉,摇头丸,冰毒）农牧业农牧业畜牧兽医站,商检系统,边检口岸,农牧类院系和研究所传染病（禽流感,兽瘟疫等）环境环境环保监测部门,研究机构有害物质超标食品安全食品安全食品安全检测中心,各监管部门农兽药残留（磺胺类、瘦肉精等）,大肠杆菌,黄曲霉素
35、快速检测流程结果判定Ora QuickPositiveNegativeReactive ControlPositive HIV-1/2Read results in 20 40 minutes不同厂家的试剂操作要求厂家厂家样品要求样品要求血量血量(ul)(ul)样品稀释样品稀释是否加缓是否加缓冲液冲液最小反应最小反应时间时间(分钟分钟)最大反应最大反应时间时间(分钟分钟)试剂储存试剂储存要求要求明胶颗粒法明胶颗粒法(PA)(PA)血清血清/血浆血浆25251:321:32N N120120/2-102-10DETERMINEDETERMINE血清血清/血浆血浆/全血全血5050N N用全血时用
36、全血时加加1 1滴滴151560602-302-30SDSD血清血清1010N NN N5 520201-30,1-30,不不能置冰箱能置冰箱保存保存杭州艾康杭州艾康血清血清/血浆血浆/全血全血2525N NY Y101020202-30,2-30,勿勿冻存冻存上海科华上海科华血清血清/血浆血浆4040N NY Y/30304-304-30厦门新创厦门新创血清血清/血浆血浆/全血全血6060N NY Y1 130304-304-30广州万孚广州万孚血清血清/血浆血浆/全血全血80-10080-100N N用全血时用全血时加加2 2滴滴101030304-30,4-30,勿勿冻存冻存北京万泰北京
37、万泰血清血清/血浆血浆8080N N用全血时用全血时加加1 1滴滴/3030室温储存，室温储存，可置可置2-8 2-8 检测质控 o 检测前要求实验室人员要熟读试剂说明书，严格按照说明书要求操作执行。一般彝族老乡只接受采集指尖血，不愿意采集静脉血，所以在使用试剂时要注意，有些试剂只能查血清和血浆，检测时就不能用全血（如中新科技、SD）。o 加入样品一定要严格按照说明书加样，如：科华加40ul,新创加50ul,雅培加50ul,万泰80ul,SD10UI,中新科技70-100UI,艾康50UI.万浮80 UI.加入的样本量不符合要求，会严重影响实验结果的判定。实验条件质控 o 实验条板反应时间，一
38、定要在15-30分钟内观察结果，在督导过程中曾经发现，个别检测点人员没有手表，时间靠估计，在不到15分钟就判读结果，影响结果的正确判断。为此，我们已经向凉山州艾滋病防治局提出申请，每个检测点配置一个定时钟。实验温度控制 o 凉山州属于高寒山区，冬天部份地区气温都在-0以下，严重影响实验结果，目前，在没有条件的情况下，检测点依靠电炉将室温升高。但是，这不能从根本上解决问题，我们已经向州艾滋病防治局提出申请，每个检测点配置一台小型桓温孵箱。斑点酶免疫吸附试验斑点酶免疫吸附试验 Dot-ELISADot-ELISA实验原理与常规的实验原理与常规的ELISAELISA相同，不同之处相同，不同之处在于在
39、于Dot-ELISADot-ELISA所用载所用载体为体为NCNC膜。其原理为膜。其原理为样品中的抗体或抗原样品中的抗体或抗原与预先包被在与预先包被在NCNC膜上膜上的抗原或抗体发生抗的抗原或抗体发生抗原抗体反应，然后再原抗体反应，然后再加入相应的酶标二抗加入相应的酶标二抗进行反应，反应结束进行反应，反应结束后，通过酶催化底物，后，通过酶催化底物，形成有色的沉淀物，形成有色的沉淀物，产生显色反应，根据产生显色反应，根据染色条带或斑点的有染色条带或斑点的有无或深浅，对抗体或无或深浅，对抗体或抗原进行检测。阳性抗原进行检测。阳性者即可在膜上出现肉者即可在膜上出现肉眼可见的染色条带或眼可见的染色条带
40、或斑点斑点。免疫印迹实验免疫印迹实验o 免疫印迹试验（免疫印迹试验（immunoblot test，IBT）又称酶联免疫电转移印迹法（又称酶联免疫电转移印迹法（enzyme lingked immunoelectrotransfer blot，EIBT），通常又称），通常又称 Western blot，是一种，是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合的技术，具有分析容量大、敏感性高、特异合的技术，具有分析容量大、敏感性高、特异性强等优点，是检测蛋白质特性、表达与分布性强等优点，是检测蛋白质特性、表达与分布的一种最常用的方法。的一种最常用的方法。免
41、疫印迹实验免疫印迹实验o 蛋白免疫印迹试验蛋白免疫印迹试验 o 重组免疫印迹试重组免疫印迹试验验 （recombinant recombinant immunoblotimmunoblot assay assay，RIBARIBA）利用基因重组的方）利用基因重组的方法，将各种抗原表达、纯化后（也可直接合成法，将各种抗原表达、纯化后（也可直接合成抗原多肽）以横线条的形式吸附或包被在抗原多肽）以横线条的形式吸附或包被在NCNC膜膜条上，用于疾病的诊断和检测。特异性较条上，用于疾病的诊断和检测。特异性较ELISAELISA高，敏感性稍差。临床常用于病原体的确认试高，敏感性稍差。临床常用于病原体的确认
42、试验和含复杂抗原成分的病原体抗体的分析。验和含复杂抗原成分的病原体抗体的分析。发展历程发展历程o印迹法（印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。测反应来检测样品的一种方法。o1975年，年，Southern建立了将建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并膜）上，并利用利用DNARNA杂交检测特定的杂交检测特定的DNA片段的方法，称为片段的方法，称为Southern印迹印迹法。法。o而后人们用类似的方法，对而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对和蛋白
43、质进行印迹分析，对RNA的印的印迹分析称为迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印印迹法迹法Towbin,H.,et al.(1979).Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets:procedure and some applications.Proc.Natl.Acad
44、.Sci.USA 76,4350-4354.Western blot 原理原理o 蛋白质蛋白质(病毒、细菌蛋白病毒、细菌蛋白)经经SDS-聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶电泳（凝胶电泳（SDS-PAGE），根据相对分子量），根据相对分子量的大小分成区带，然后通过转移电泳将的大小分成区带，然后通过转移电泳将SDS-PAGE上的蛋白质转印到硝酸纤维滤膜上加上上的蛋白质转印到硝酸纤维滤膜上加上相应的标记抗体（如酶标抗体、胶体金标记抗相应的标记抗体（如酶标抗体、胶体金标记抗体、荧光抗体、放射性同位素标记抗体），也体、荧光抗体、放射性同位素标记抗体），也可先加抗体反应，再加标记的抗抗体，通过对可先加抗体反应，再
45、加标记的抗抗体，通过对抗体的标记物的检测，以分析特异性抗原蛋白抗体的标记物的检测，以分析特异性抗原蛋白区带。区带。o 为什么要作蛋白质印迹实验？为什么要作蛋白质印迹实验？n 研究一些体外的蛋白质分子，寻找目的蛋白是研究一些体外的蛋白质分子，寻找目的蛋白是否存在样品当中否存在样品当中n 蛋白质的表达情况，上调或下调表达，在不同蛋白质的表达情况，上调或下调表达，在不同的样品中，如疾病和正常的样品之间的表达差的样品中，如疾病和正常的样品之间的表达差异性。异性。免疫印迹法免疫印迹法Western blot法法原理原理Westernblot抗原表位可能被破坏而漏检抗原表位可能被破坏而漏检Western
46、blot基本步骤基本步骤（一）（一）SDS-PAGE（目的蛋白的分离）（目的蛋白的分离）1、收集蛋白样品、收集蛋白样品 裂解液裂解细胞、或组织样品，通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白裂解液裂解细胞、或组织样品，通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白水溶液提取法水溶液提取法 针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂。有机溶剂提取法有机溶剂提取法 对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。2、蛋白质浓度测定、蛋白质浓度测定 目前常用比色法测定样品蛋白的含量目前常用比色法测定样品蛋白的含量3、电泳、电泳4、电
47、泳结果检查、电泳结果检查 Staking gelSeparating gelWestern blot （二）电转移（或转印、转膜）（二）电转移（或转印、转膜）转印就是将蛋白质由转印就是将蛋白质由SDS凝胶上转移到固相支持物上。凝胶上转移到固相支持物上。首选的固相支撑物是硝酸纤维滤膜（首选的固相支撑物是硝酸纤维滤膜（NC膜）膜）通常有两种方法：毛细管印迹法和通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法电泳印迹法。常用的常用的电泳转移方法电泳转移方法有湿转和半干转。两者的原理完全相有湿转和半干转。两者的原理完全相同，只是用于固定胶同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。膜叠层和施加电场的机
48、械装置不同。原料是基础-膜o 选择种类nNCnPVDFn尼龙膜o 选择标准na.膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜能结合蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）；nb.不影响后续的显色检测（也就是适和用于所选的显色方法，信噪比好）；nc.后继实验有其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，还要根据不同目的来挑选不同的转移膜膜的特点 Western blotting（三）（酶）免疫定位（三）（酶）免疫定位1.膜的封闭膜的封闭 为防止为防止NC膜的非特异性背景着色，用封闭液对膜的非特异性背景着色，用封闭液对NC膜进行封闭。常膜进行封闭。常用的封闭液为加有脱脂奶粉、小牛血清或牛血
49、清白蛋白的缓冲液用的封闭液为加有脱脂奶粉、小牛血清或牛血清白蛋白的缓冲液。2.靶蛋白与特异性抗体（一抗）反应靶蛋白与特异性抗体（一抗）反应 将可识别靶蛋白的将可识别靶蛋白的McAb或或PcAb与与NC膜一同温育膜一同温育。3.靶蛋白与标记的二抗反应靶蛋白与标记的二抗反应 待上步反应结束后，洗涤待上步反应结束后，洗涤NC膜，使之与标记的二抗反应，二抗可膜，使之与标记的二抗反应，二抗可用放射性同位素、酶、生物素、胶体金等标记。用放射性同位素、酶、生物素、胶体金等标记。4.指示反应指示反应 根据标记物的不同，可采用放射自显影、底物显色等，在根据标记物的不同，可采用放射自显影、底物显色等，在NC膜上膜
50、上显示相应的检测蛋白带显示相应的检测蛋白带Western bloto Western blot 中应该注意的问题中应该注意的问题（一）首先应该确定检测蛋白经（一）首先应该确定检测蛋白经SDS和还原剂处理后，和还原剂处理后，其抗原决定簇仍然可与相应的抗体结合。特别是在用单其抗原决定簇仍然可与相应的抗体结合。特别是在用单克隆抗体作为第克隆抗体作为第1抗体时应考虑这一点。抗体时应考虑这一点。（二）要保证检测所用抗体的特异性，尤其是一抗的特异（二）要保证检测所用抗体的特异性，尤其是一抗的特异性更为重要。另外，对一抗和标记体的使用浓度，通常性更为重要。另外，对一抗和标记体的使用浓度，通常要根据实际情况作
