1、美丽的海医校园美丽的海医校园 临床免疫学实验指导临床免疫学实验指导海南医学院海南医学院实验六实验六 单个核细胞分离及细胞免疫功能检测单个核细胞分离及细胞免疫功能检测【实验目的实验目的】1.1.熟悉淋巴细胞分离方法熟悉淋巴细胞分离方法2.2.了解了解T T淋巴细胞亚群测定方法及其临床意义淋巴细胞亚群测定方法及其临床意义 T T细胞介导的免疫应答特征：是细胞介导的免疫应答特征：是T T细胞辅助细胞（细胞辅助细胞（Th1Th1）介导的）介导的 单个核细胞（单个核细胞（L,ML,M），以浸润为主的炎症反应与细胞毒性），以浸润为主的炎症反应与细胞毒性T T细胞细胞 （CTLCTL或或TCTC）发生特异性
2、细胞毒效应）发生特异性细胞毒效应.临床上反复感染者和肿瘤病人，使人首先想到的是：患者是否有临床上反复感染者和肿瘤病人，使人首先想到的是：患者是否有 细胞免疫缺陷，必须进行细胞免疫缺陷的检测，而这种检查的细胞免疫缺陷，必须进行细胞免疫缺陷的检测，而这种检查的 第一步就是单个核细胞的分离，计数。然后进行功能检查。第一步就是单个核细胞的分离，计数。然后进行功能检查。一、单个核细胞分离法（主要为淋巴细胞）一、单个核细胞分离法（主要为淋巴细胞）（一）葡聚糖（一）葡聚糖泛影葡胺法分离单个核细胞泛影葡胺法分离单个核细胞 密度梯度离心法：密度梯度离心法：水平离心机，逐渐加速，自然停转水平离心机，逐渐加速，自然
3、停转1.1.分离液：分离液：葡聚糖葡聚糖-泛影葡胺混合液泛影葡胺混合液（比重（比重1.0751.0751.0921.092之间）之间）将分离液将分离液，加入抗凝血中离心，离心后，加入抗凝血中离心，离心后不同比重的血细胞在分不同比重的血细胞在分离液中呈梯度分布。比密大在底部，小的在上部。离液中呈梯度分布。比密大在底部，小的在上部。红细胞和多核白细胞比重较大（红细胞和多核白细胞比重较大（1.0921.092），分布于最底层），分布于最底层，单核细胞比重较小（单核细胞比重较小（1.0751.0751.0901.090），分布于血浆与分离液的），分布于血浆与分离液的交界处。交界处。界限清楚，层次分明。
4、将该层细胞吸出，即为单个核界限清楚，层次分明。将该层细胞吸出，即为单个核细胞（主要为淋巴细胞）细胞（主要为淋巴细胞）血浆和血小板位于最上层。血小板在血浆中下部血浆和血小板位于最上层。血小板在血浆中下部 2.Hanks2.Hanks缓冲液：（缓冲液：（pH 7.2-7.4,pH 7.2-7.4,无无CaCa、MgMg离子）离子）3.0.4%3.0.4%台盼蓝染液台盼蓝染液梯度离心法分离提取单个核细胞稀释血浆稀释血浆内含血小板内含血小板分离液分离液粒细胞粒细胞红细胞红细胞用细长吸管慢慢插入白膜层，沿管壁周边轻轻吸取单核细胞层于另一试管内用细长吸管慢慢插入白膜层，沿管壁周边轻轻吸取单核细胞层于另一试
5、管内 加入加入PBSPBS洗液洗液3-4ml3-4ml，离心洗涤，离心洗涤2 2次，次，1500/r,10min.1500/r,10min.弃去上清，留约弃去上清，留约50l.50l.加加含有含有10%10%灭活小牛血清灭活小牛血清-PBS-PBS液液1.0ml1.0ml，混匀充池，镜下计数。，混匀充池，镜下计数。单个核细胞单个核细胞 2000rpm/20-30min 肝素抗凝血肝素抗凝血2ml+Hanks2ml+Hanks液液2ml2ml液稀释液稀释沿管壁缓慢加入沿管壁缓慢加入到含有到含有2ml2ml淋巴细胞分离液的试管中淋巴细胞分离液的试管中(不能破坏二者的液面不能破坏二者的液面）,200
6、0r/min 2000r/min 离心离心20min20min 吸出淋巴细胞层加入另一试管中，加吸出淋巴细胞层加入另一试管中，加3 34ml Hanks4ml Hanks液，混匀离心洗涤，液，混匀离心洗涤，1500r/min 1500r/min 离心离心10min10min 弃弃去上清，去上清，再再加加3ml Hanks3ml Hanks液，混匀，液，混匀，1500r/min 1500r/min 10min10min，重复洗涤，重复洗涤2 2次次 重复重复1 1次次 末次离心后，弃去上清液。加含末次离心后，弃去上清液。加含10%10%灭活小牛血清灭活小牛血清/HanKs/HanKs液液 加至加
7、至1.0ml1.0ml，混匀，灌入血细胞计数池，单个核细胞计数，混匀，灌入血细胞计数池，单个核细胞计数，于低倍镜下计数于低倍镜下计数4 4个角大格内细胞总数。个角大格内细胞总数。方法方法留取约留取约50l,加缓冲液至加缓冲液至1.0ml，稀释，稀释20倍倍计数细胞方法计数细胞方法 加样：加样：将淋巴细胞悬液混匀，吸取将淋巴细胞悬液混匀，吸取10l10l加入到加入到 40l40l含含10%10%灭活小牛灭活小牛血清的血清的HanksHanks液中，混匀后再吸取液中，混匀后再吸取10l10l充入计数板上。充入计数板上。细胞悬液稀释细胞悬液稀释5 5倍。此稀释也可省略，可根据细胞密度而定倍。此稀释也
8、可省略，可根据细胞密度而定静置片刻，置显微镜下计算淋巴细胞数。静置片刻，置显微镜下计算淋巴细胞数。具体计数方法如下：具体计数方法如下：血细胞计数池的构造血细胞计数池的构造1.1.大方格大方格 9 9个个2.2.中方格分中方格分2 2种种WBCWBC计数区分计数区分1616个个RBCRBC计数区分计数区分2525个个3.3.小方格小方格1 1种，种，是指是指RBCRBC计数区计数区的的1 1个中方格又分个中方格又分1616个小方格，即：个小方格，即：计数池内有：计数池内有：1 1种种大方格；大方格；2 2种中方种中方格；格；1 1种小方格种小方格池深池深 0.1mm0.1mm 血细胞计数池的构造
9、参数血细胞计数池的构造参数 4种方格的体积（容积）种方格的体积（容积）计数池区域计数池区域 边长（边长（mmmm）面积（面积（mm2mm2）池深（池深（mmmm）体积（体积（mm3 ulmm3 ul）一个计数全池一个计数全池 3 9 0.10 0.903 9 0.10 0.90 大方格大方格 1 1 0.10 0.101 1 0.10 0.10 白细胞中方格白细胞中方格 0.25 0.0625 0.10 0.006250.25 0.0625 0.10 0.00625 红细胞中方格红细胞中方格 0.20 0.0400 0.10 0.004000.20 0.0400 0.10 0.00400 红细
10、胞小方格红细胞小方格 0.05 0.0025 0.10 0.000250.05 0.0025 0.10 0.00025细胞计数原则细胞计数原则 计左上，不计右下计左上，不计右下 血细胞计数板血细胞计数板血细胞计数板上四个角的血细胞计数板上四个角的四个大方格四个大方格1 1个大方格中个大方格中1616个中方格个中方格 计数血细胞计数板上四个角的计数血细胞计数板上四个角的 四个大方格内单个核细胞总数。四个大方格内单个核细胞总数。（只计算上边和左边的压线细胞，（只计算上边和左边的压线细胞，右边和下边压线细胞不计算）右边和下边压线细胞不计算）单个核细胞总数计算：单个核细胞总数计算：是指最终制备的每是指
11、最终制备的每mlml细胞缓冲液内的细胞缓冲液内的 单个核细胞的密度（数量）单个核细胞的密度（数量）单个核细胞总数单个核细胞总数/ml/ml=单个核细胞总数单个核细胞总数/ml=X/4/ml=X/41010(稀释倍数稀释倍数)10103 3=X=X10104 44 4 4个大方格内个大方格内 细胞总数细胞总数 稀释倍数稀释倍数 10104 4关于稀释倍数：这里不是指血液稀释倍数。是指最后洗涤关于稀释倍数：这里不是指血液稀释倍数。是指最后洗涤离心弃去上清液后的单个核细胞沉淀中，加入缓冲液离心弃去上清液后的单个核细胞沉淀中，加入缓冲液1.0ml后。后。此缓冲液中的单个核细胞密度。此缓冲液中的单个核细
12、胞密度。细胞存活率检测细胞存活率检测 取取10l10l淋巴细胞悬液加入淋巴细胞悬液加入0.4%0.4%台盼蓝染色液台盼蓝染色液10l10l，混匀。取混匀。取10l10l加入血细胞计数板，静置片刻，加入血细胞计数板，静置片刻，置显微镜高倍镜下观察。计数置显微镜高倍镜下观察。计数200200个单个核细胞个单个核细胞 分别记录活细胞数，死细胞数，带入计算公式，分别记录活细胞数，死细胞数，带入计算公式，报告活细胞存活率。报告活细胞存活率。【结果判定【结果判定】活细胞不着色，折光性强。活细胞不着色，折光性强。死细胞由于染料可渗入死细胞由于染料可渗入 细胞内，细胞内，故死细胞被染成蓝色，故死细胞被染成蓝色
13、，体积较大，无光泽体积较大，无光泽 正常情况下，活细胞存活率应在正常情况下，活细胞存活率应在95%95%以上。以上。表明免疫活性细胞数量正常。然后做其他功能检测表明免疫活性细胞数量正常。然后做其他功能检测 在高倍镜下计数在高倍镜下计数200200个细胞中的死亡细胞数，个细胞中的死亡细胞数，计算其存活率：使用血细胞计数器：计算其存活率：使用血细胞计数器：细胞存活率细胞存活率 =活细胞数活细胞数(N)(N)活细胞数活细胞数+死细胞数死细胞数 200200 100%100%例如：活细胞总数为例如：活细胞总数为 120120个，存活率为：个，存活率为：60%60%；若活细胞计数为若活细胞计数为1801
14、80个，存活率：个，存活率：90%90%【临床意义临床意义】分离单个淋巴细胞技术是进行细胞免疫试验的重要技术之一，分离单个淋巴细胞技术是进行细胞免疫试验的重要技术之一，是进行流式细胞分析技术的重要的前期基本操作；是进行流式细胞分析技术的重要的前期基本操作；是进行各项免疫细胞功能检测的基础技术。是进行各项免疫细胞功能检测的基础技术。分离所得的单个核细胞可满足许多实验需要，分离所得的单个核细胞可满足许多实验需要，不仅用于淋巴细胞总数和细胞的存活率测定，不仅用于淋巴细胞总数和细胞的存活率测定，也用于进一步纯化淋巴细胞，进行淋巴细胞分类，分群，也用于进一步纯化淋巴细胞，进行淋巴细胞分类，分群，表面抗原
15、，各种标志物以及其他淋巴细胞功能测定等。表面抗原，各种标志物以及其他淋巴细胞功能测定等。实验报告：实验报告：1.1.报告单个核细胞计数总数结果报告单个核细胞计数总数结果2.2.报告单个核细胞存活率报告单个核细胞存活率3.3.简述密度梯度离心法分离单个核细胞的原理简述密度梯度离心法分离单个核细胞的原理4.4.分离单个淋巴细胞的临床意义分离单个淋巴细胞的临床意义T T细胞总数测定：细胞总数测定：EtEt花环实验。学生课余自学内容。花环实验。学生课余自学内容。E+E+淋巴细胞百分率测定：正常人参考值：淋巴细胞百分率测定：正常人参考值：60%-80%60%-80%由于干扰因素较多，主观因素影响，临床意
16、义不明显由于干扰因素较多，主观因素影响，临床意义不明显结果不稳定，重复性不高等原因，很少做。结果不稳定，重复性不高等原因，很少做。T T细胞总数测定细胞总数测定EtEt花环沉降法花环沉降法（E+E+淋巴细胞百分率：淋巴细胞百分率：60-80%60-80%）人类人类T细细胞的主要胞的主要标志标志的的CD2、CD3和和TCR均均能吸附能吸附绵羊红绵羊红细胞于淋细胞于淋巴周巴周围，形围，形成花瓣成花瓣样排列样排列称为称为E花花环实验。环实验。实验报告：实验报告：1.1.报告单个核细胞计数总数结果报告单个核细胞计数总数结果2.2.报告单个核细胞存活率报告单个核细胞存活率3.3.简述密度梯度离心法分离单个核细胞的原理简述密度梯度离心法分离单个核细胞的原理4.4.分离单个淋巴细胞的临床意义分离单个淋巴细胞的临床意义 实验课结束啦！可以轻松的玩一玩啦！
