1、 细胞病理技术综述 卢晓芳1主要内容细胞涂片技术细胞蜡块制作HPV检测技术1 12 23 32细细胞胞病病理理学学（c cy yt to op pa at th ho ol lo og gy y）定定义：义：是采集人体各部位的细胞，经染色后用显微镜观察其形态，协助临床诊断疾病的一门学科。3细细胞胞病病理理学学（c cy yt to op pa at th ho ol lo og gy y）评评价价（优优点）点）：1.简单易行、安全性强；2.对设备要求不高、费用低；3.对患者造成的痛苦少，可反复取材检查；4.诊断迅速，特别适用于大规模防癌普查和高危人群的随访观察。45适适用用大大规规模模防防癌癌
2、筛筛查查 6 适用大规模防癌筛查适用大规模防癌筛查 甲状腺穿刺甲状腺穿刺妇科涂片妇科涂片乳腺穿刺乳腺穿刺7细细胞胞病病理理学学（c cy yt to op pa at th ho ol lo og gy y）评评价价（缺缺点）点）：1.因细胞病理检查的局限性，只能看到少数细胞，不能全面观察病变组织结构，有一定的漏诊、误诊率；2.较难确定肿瘤的具体部位；3.不易对癌细胞做出明确的分型。8细细胞胞病病理理学学（c cy yt to op pa at th ho ol lo og gy y）分类（根据标本来源）：分类（根据标本来源）：1.1.脱落细胞学（脱落细胞学（exfoliative cytol
3、ogyexfoliative cytology）妇科：宫颈涂片非妇：胸腹腔积液、尿液、脑脊液、痰、乳溢、食管拉网等 2.2.细针吸取细胞学（细针吸取细胞学（fine needle aspiration cytologyfine needle aspiration cytology）甲状腺、乳腺、淋巴结、体表各部位；以及在影像学引导下，对胸腹腔的肿块穿刺。9传统制片技术传统制片技术一、直接制片一、直接制片将新鲜标本直接涂在载玻片将新鲜标本直接涂在载玻片上1.宫颈涂片2.痰涂片3.食管拉网4.乳溢5.鼻咽10涂片手法涂片手法11传统制片技术传统制片技术二、普通离心制片二、普通离心制片 胸腹腔积液、
4、心包积液、尿、脑脊液、穿刺液等液体标本，需要经离心后涂片。12传统制片技术传统制片技术二、普通离心制片二、普通离心制片 标本一般不少于标本一般不少于50ml50ml（脑脊液、穿刺液除外）（脑脊液、穿刺液除外）移到离心管中移到离心管中 离心离心2500r/102500r/10minmin 倒去倒去上清上清稀释合稀释合适浓度适浓度 重悬重悬沉淀沉淀 细胞细胞涂片涂片13传统制片技术传统制片技术二、普通离心制片二、普通离心制片 含血较多的标本，离心后会出现明显分层含血较多的标本，离心后会出现明显分层涂片时需取涂片时需取中间白膜层中间白膜层14传统制片技术传统制片技术 含血较多的标本，若红细胞过多，会
5、干扰医生诊断视野含血较多的标本，若红细胞过多，会干扰医生诊断视野15传统制片技术传统制片技术 红细胞裂解液祛除红细胞后，稀释合适浓度，直接重悬沉淀，涂片，背景清晰红细胞裂解液祛除红细胞后，稀释合适浓度，直接重悬沉淀，涂片，背景清晰 缺点：制成细胞蜡块后，有含铁血黄素生成，干扰免疫组化判读缺点：制成细胞蜡块后，有含铁血黄素生成，干扰免疫组化判读备注：备注：若标本量多，可若标本量多，可多分装几管离心。多分装几管离心。一部分祛红后涂片一部分祛红后涂片;另一部分，备做细另一部分，备做细胞蜡块，以免含铁血胞蜡块，以免含铁血黄素干扰。黄素干扰。16传统制片技术传统制片技术三、特殊离心涂片技术（三、特殊离心
6、涂片技术（细胞甩片细胞甩片）制备细胞含量很少的样品：如脑脊液、尿液、穿刺液Cytospin Cytospin 外观图外观图Cytospin Cytospin 内视图内视图17传统制片技术传统制片技术四、注意事项四、注意事项1.涂片时要注意避免来回反复摩擦，否则可能将细胞破坏；2.涂片尽可能均匀，太厚太薄，都不能满足镜下阅片要求；3.涂片完成后，潮干固定，不能过于干燥，否则细胞异型，不利于诊断，更易引起误诊；4.标本不宜放置时间过长，特别是尿液，需4冰箱冷藏，但不宜超过48h.18传统制片技术传统制片技术五、细胞涂片固定（固定剂种类）五、细胞涂片固定（固定剂种类）1.95%乙醇：首选固定剂2.甲
7、醇：固定作用比乙醇效果好，核结构清晰，但有毒性毒性3.丙酮：渗透力强，但使细胞强烈皱缩，对核的固定也欠佳4.10%NBF：交联固定，速度太慢5.Carnoy液：涂片做特染时常用固定剂19传统制片技术传统制片技术五、细胞涂片固定（注意事项）五、细胞涂片固定（注意事项）1.一病例，一容器，避免交叉污染（理想状态，不现实理想状态，不现实）2.固定液原则上每日更换，若为节省成本，没有日更换，也需过滤后使用，且必须保持其浓度3.固定时间：约15mim4.4.关键：涂片完成后，潮干立即固定，不可干燥，否则细胞褪变。关键：涂片完成后，潮干立即固定，不可干燥，否则细胞褪变。20传统制片技术传统制片技术干燥后固
8、定，细胞褪变干燥后固定，细胞褪变正常湿固定正常湿固定21液液基基细细胞胞学学技技术术 定义定义 液基细胞学检验技术，通过标本采集及保存、细胞混匀、分离提取诊断细胞、全自动制片及染色等过程制作细胞薄片，全过程均在液体状态全过程均在液体状态下完成，故称为液基细胞学技术。分类分类1.膜式薄层制片技术（thin-prep cytolosy test,TCT）2.LCT沉降式薄层检测技术（Auto Cyte PREP，LCT）22传传统统制制片片与与液液基基制制片片技技术术的的比比较较传统制片传统制片液基制片液基制片约约20%20%标本移至玻片标本移至玻片几乎几乎100%100%标本被收集至保存液中标本
9、被收集至保存液中制片技术不稳定、不能重复制片制片技术不稳定、不能重复制片技术稳定可靠、可以重复技术稳定可靠、可以重复易受血、粘液、炎性物遮盖易受血、粘液、炎性物遮盖去除血、粘液、及大量炎性遮盖物去除血、粘液、及大量炎性遮盖物细胞分布不均匀细胞分布不均匀,易重叠易重叠细胞分布均匀集中细胞分布均匀集中,不易重叠不易重叠涂片区域过大，观察费时费力涂片区域过大，观察费时费力,易漏诊易漏诊制片区域集中，不易漏诊制片区域集中，不易漏诊23液液基基细细胞胞妇妇科科标标本本采采集集耗耗材材24液基细胞标本采集步骤液基细胞标本采集步骤漂洗漂洗拧紧拧紧记录记录25液基细胞妇科标本采集注意事项液基细胞妇科标本采集注
10、意事项采样过程中，将宫颈刷向同一方向转采样过程中，将宫颈刷向同一方向转3535圈，不圈，不要太用力或转得过多以免出血冲淡细胞并使用恰当要太用力或转得过多以免出血冲淡细胞并使用恰当的力度保证取到更多的细胞。的力度保证取到更多的细胞。经期不能取材。经期不能取材。分泌物太多时要用干绵签擦干净后再取。分泌物太多时要用干绵签擦干净后再取。宫颈糜烂严重的旋转不要超过宫颈糜烂严重的旋转不要超过3 3圈，以免出血。圈，以免出血。旋转时向同一方向，不要来回转动以免加大创伤引旋转时向同一方向，不要来回转动以免加大创伤引起出血。起出血。26液液基基细细胞胞制制片片技技术术膜式薄层制片技术（膜式薄层制片技术（thin
11、-prep cytolosy test,TCTthin-prep cytolosy test,TCT）新柏氏膜式液基薄层细胞学（TCT）：1996年5月通过美国FDA批准用于临床宫颈癌筛查。拥有超过27项国际专利。27TCTTCT取材优点取材优点28液液基基细细胞胞制制片片技技术术膜式薄层制片技术（膜式薄层制片技术（thin-prep cytolosy test,TCTthin-prep cytolosy test,TCT）新柏氏新柏氏T2000T2000（原理：负压膜吸附）（原理：负压膜吸附）29液液基基细细胞胞学学技技术术膜式薄层制片技术（膜式薄层制片技术（TCTTCT）制片过程）制片过程
12、30液液基基细细胞胞学学技技术术膜式薄层制片技术（膜式薄层制片技术（TCTTCT）制片后巴氏染色）制片后巴氏染色31 新柏氏新柏氏 玻片扫描分析影像系统（玻片扫描分析影像系统（TISTIS）自动阅片系统）自动阅片系统 TIS使医生阅片技巧与计算机强大影像处理能力完美结合。与传统涂片人工阅片相比，TIS 可帮助医生工作效率提高75%，且可将假阴性率降低至 0.012%。备注：该系统只能扫描备注：该系统只能扫描TCTTCT32液液基基细细胞胞学学技技术术沉降式液基薄层制片技术沉降式液基薄层制片技术(Auto Cyte PREPAuto Cyte PREP，LCTLCT）该技术为沉降式沉降式原理技术
13、。代表公司有美国BD公 司的LCT，国产广州安必平公司的LBP 33液液基基细细胞胞制制片片技技术术LCTLCT沉降式液基薄层制片技术原理沉降式液基薄层制片技术原理（一）用梯度密度试剂分离去除液基细胞学中的血液、黏液等干扰成分，富集细胞及诊断成份。（二）根据人体不同类型细胞其比重不同的特点，尤其是病变细胞比重大、沉降速度快，与特殊处理后的载玻片相互吸引，从而最大程度地捕获病变细胞和具诊断价值的成份，最终制成背景清晰、诊断线索明确的单层细胞薄片 34液液基基细细胞胞学学技技术术LCTLCT沉降式液基薄层制片技术原理沉降式液基薄层制片技术原理病变程度越重的细胞，沉降得越快，被玻片捕获的机率就越大，
14、即使选择病变程度越重的细胞，沉降得越快，被玻片捕获的机率就越大，即使选择诊断面积内的细胞数量为诊断面积内的细胞数量为50005000个，亦是所采集的所有细胞中病变程度相对最个，亦是所采集的所有细胞中病变程度相对最重的重的50005000个细胞，可明显提高检出率。个细胞，可明显提高检出率。35液基细胞制片技术液基细胞制片技术1.1.宫颈细胞刷宫颈细胞刷 直接入瓶，通过震荡器处直接入瓶，通过震荡器处理，保证细胞刷收集到的细胞理，保证细胞刷收集到的细胞100%100%用用于制片，避免丢弃采样刷而导致刷上于制片，避免丢弃采样刷而导致刷上细胞丢失的情况。细胞丢失的情况。2.2.标本处理液标本处理液 主要
15、成份为主要成份为24%24%乙醇，对乙醇，对工作环境无污染。采集标本后，在常工作环境无污染。采集标本后，在常温下能保存四个星期。温下能保存四个星期。广 州 安 必 平 (L B P )医 药 科 技 有 限 公 司 产品知识培训LCTLCT沉降式液基薄层制片过程沉降式液基薄层制片过程363 3密度梯度试剂程控离心密度梯度试剂程控离心能将妇科标本中普遍存在的血液、粘液能将妇科标本中普遍存在的血液、粘液及其他细胞碎屑与诊断有效成份（包括及其他细胞碎屑与诊断有效成份（包括组织细胞、病原微生物等）剥离分层，组织细胞、病原微生物等）剥离分层，排除干扰成份，保证富集诊断成份。排除干扰成份，保证富集诊断成份
16、。可同时提高病变细胞及病原微生物检出可同时提高病变细胞及病原微生物检出率，给临床提供准确的诊疗指导。率，给临床提供准确的诊疗指导。离心 除去血液、粘液及细胞碎屑 集中诊断细胞(鳞状上皮、腺上皮）产品知识培训广 州 安 必 平 (L B P )医 药 科 技 有 限 公 司 液基细胞学技术液基细胞学技术LCTLCT沉降式液基薄层制片过程沉降式液基薄层制片过程374 4重力自然沉降制片重力自然沉降制片可可根据涂片根据涂片厚薄，调整沉降厚薄，调整沉降时间，在时间，在13mm13mm诊断面积内诊断面积内细胞数量可选择为细胞数量可选择为50005000120000120000，诊断面积，诊断面积较较TC
17、TTCT小小 产 品 知 识 培 训液基细胞制片技术液基细胞制片技术LCTLCT沉降式液基薄层制片过程沉降式液基薄层制片过程38宫颈宫颈尿液尿液痰痰浆膜腔浆膜腔L LC CT T沉沉淀淀式式液液基基薄薄层层制制片片效效果果图图39罗氏罗氏P16/ki67P16/ki67双染试剂盒液基涂片上的免疫组化染色双染试剂盒液基涂片上的免疫组化染色40细细胞胞蜡蜡块块制制作作定义定义 就是将送检的胸腹水，通过病理技术流程的处理，制作成细胞学常规蜡块，将其细胞成分保存在蜡块中，从而切片进行常规显微镜下诊断，判别细胞的性质、类型，达到较为精确的肿瘤细胞的诊断。41细细胞胞蜡蜡块块制制作作定义定义 就是将送检的
18、胸腹水，通过病理技术流程的处理，制作成细胞学常规蜡块，将其细胞成分保存在蜡块中，从而切片进行常规显微镜下诊断，判别细胞的性质、类型，达到较为精确的肿瘤细胞的诊断。42细细胞胞蜡蜡块块制制作作临床意义临床意义1、增加了细胞涂片的数量、密度，并对细胞做了很好保存，既能重复多切片，又能辅助肿瘤免疫组化检测，提高了胸腹水中肿瘤诊断的阳性率。43细胞蜡块制作细胞蜡块制作临床意义临床意义2.查到肿瘤细胞时，对细胞类型能够做很好的分型，为肿瘤规范治疗提供更多参考依据。3.此项技术较以前脱落细胞学普通涂片准确性更高，保存更方便，对疾病的诊断更加明确。44细胞蜡块制作细胞蜡块制作制作步骤制作步骤1.接到胸腹水后
19、，将其静止沉淀1小时，然后吸取底部液体置入离心管中;2.离心2500r/10min，倾去上清液;3.加入适量固定液（10%NBF：95%乙醇1:1），离心2500r/10min，倾去上清液;4.将上清液控干，等待取材;5.细胞量足够多时，取材时用包埋纸包裹即可，常规固定脱水包埋45细胞蜡块制作细胞蜡块制作制作步骤制作步骤6.细胞量过少时，需用支撑物凝聚细胞常用：琼脂糖（5%浓度）蛋清甘油46点优缺点点优缺点l优点优点l缺缺点点1.使单个分散的细胞标本聚集起来。2.解决了直接离心包埋细胞时细胞散落等问题。3.降低了细胞的损失量保留尽量多的细胞。1.琼脂糖遇高温即融，温度下降后又重新凝固，温度难以
20、控制。2.烤片后载玻片上的蜡片间隙中琼脂糖融化，封片后镜下可见水珠样空泡。3.琼滴加琼脂糖后，细胞悬浮，凝固后细胞不在同一层面琼脂糖细胞蜡块制作琼脂糖细胞蜡块制作47细细胞胞蜡蜡块块切切片片48细细胞胞蜡蜡块块切切片片染染色色49细细针针穿穿刺刺细细胞胞学学 定定义义 FNA（Fine Needle Aspiration）是使用针头（22G-24G）刺入病变区域内，通过提插针方式将病灶内的细胞或小组织块切割下来，同时借助针管内负压将其吸出，涂片及染色后在光镜下阅片，最后完成病理诊断的一种活检方法50细针穿刺技术细针穿刺技术发展发展阶段阶段 1930s徒手穿刺1950s把手穿刺1996持笔试现在
21、专用穿刺针51为为什什么么要要进进行行甲甲状状腺腺细细针针穿穿刺：刺：1.指南的需要指南的需要52532.相对粗针穿刺安全，并发症少 1)穿刺针细（22G-24G）出血少，常见并发症 出血及血肿；虚脱；气胸；误入气管；542）针道播散少见 Robbin、Berg、Engcell、Zajicek、Eriksson、Sprenger、Koss、彭孝敬等。通过大量的材料证实针道播散及转移的机率极低，不足万分之一。并证实接受FNAC的恶性肿瘤病人与未接受FNAC的恶性肿瘤病人的长期生存率并无统计学差异。反之，由于FNAC工作的开展使许多恶性肿瘤病人得到及时的诊断与治疗。553.诊断效率高满意标本的情况
22、下，FNA的敏感性，特异度均可以超过90%。附属第一医院2015年度甲状腺细针穿刺诊断与手术组织学诊断符合率（51/56,91.07%）细针与手术不符合共5例：其中标本不满意3例 粗针穿刺（-），手术（+），细针（+）：共2例：均为PTC565757怎怎样样进进行行甲甲状状腺腺细细针针穿穿刺？刺？585960616263H HP PV V病病毒毒检检测测技技术术 HPV称为人乳头瘤状病毒，是一类病毒的总称，结构为DNA双链病毒。目前已分出100余种HPV DNA，其中30多种与宫颈感染和病变有关。根据其致病力的大小分为高危型和低危型两种，国际癌症研究协会对9个国家11次病例对照研究资料分析 H
23、PV6,11,40,42,43,44,54,61,70,72,81,cp6 108等12种，主要引起生殖道肛周皮肤和阴道下部的外生性湿疣类病变、扁平湿疣类病变和低度子宫颈上皮内瘤样变(CINI),多呈一过性，可自然逆转 HPV16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，68，73，82等15种，主要导致CINII-III级病变和宫颈癌的发生,持续高危型HPV感染的CIN级易进展为CIN 64HPVHPV介绍介绍E：早期基因区编码早期6个蛋白L：晚期基因区编码晚期2个蛋白65感染后的存在状态：状态一：非整合状态状态二：整合到宿主细胞http:/ HPVHPV介介绍绍6
24、6HPVHPV介绍介绍根据感染组织类型分为：皮肤组织 粘膜组织67人乳头状病毒（人乳头状病毒（HPVHPV）目前根据DNA同源性将HPV分为100多种亚型，约35种型别与生殖道感染(如：生殖器疣等)有关，约20种型别与癌症相关。与宫颈癌相关的高危型高危型 HPV(high-risk HPV,or HPV(high-risk HPV,or hrHPV)hrHPV)有有1414种种：16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59,66,68低危型有 6，11，40，42，43，44来自世界各地的宫颈癌组织标本的研究发现，HPV16、18型感染率最高（占70%）HPV HPV
25、 是引起宫颈癌的主要因素是引起宫颈癌的主要因素超过超过99%99%的宫颈癌都检测到的宫颈癌都检测到HPVHPV6868HPVHPV检查的临床价值检查的临床价值HPV准确分型是判断HPV持续感染状态的基础，是筛选宫颈癌高危人群的基础；HPV高危亚型病毒载量提示高度病变的风险，跟踪和随访提示病毒的清除或疾病的进展。健康人群通过体检筛查出感染HPV高危亚型的人群，进行定期随访管理，可以最终消除宫颈癌。69宫颈癌临床诊断及筛选指南宫颈细胞学检查正常ASC-US ASC-H LSIL HSIL4-6个月复查或HPV检查HPV 阴性(高危型)HPV 阳性(高危型)12个月复查 阴道镜非侵袭性病变宫颈癌前病
26、变或者宫颈癌半年或一年重或者1年重复HPV复细胞学检查检查 治疗70Logo公司公司SFDAFDAQIAGENYYHologicYYROCHEYYHPVHPV检测三巨头检测三巨头2022-12-1371HPV-DNAHPV-DNA检测原理检测原理原理原理代表公司代表公司杂交捕获QIAGEN（HC2）酶切信号放大Hologic（cervista）PCR荧光法ROCHE(cobas4800）2022-12-1372HPVDNAHPVDNA检检测测QIAGEN HC2QIAGEN HC2原理：基于信号放大的酶标板技术的化学发光检测的核酸杂交检测方法（杂交捕获）流程：裂解杂交捕获反应冲洗信号收集判读时
27、间：手工操作3.5小时，仪器操作4.5小时结果：检测13种HPV高危型，不分型主要问题：与个别HPV亚型会发生交叉反应，无内对照，约5%假阳 性率DML200073HPVDNAHPVDNA检检测测Hologic Cervista HRHPVHologic Cervista HRHPV原理：基于专利Invader 酶切信号放大技术流程：磁珠分离核酸提取酶切信号放大荧光检测时间：4小时自动化孵育+2小时人工操作（半自动）结果：14种高危型16、31、33、52、58、18、39、45、66、68、51、56、66，不分型主要问题：可能与其它HPV如HPV67和70发生交叉反应，从而产生假阳性结果荧
28、光测读仪温度循环仪74HPVDNAHPVDNA检检测测Hologic Cervista(r)HPV 16/18Hologic Cervista(r)HPV 16/18原理：基于专利Invader 酶切信号放大技术流程：磁珠分离核酸提取酶切信号放大荧光检测时间：4小时自动化孵育+2小时人工操作（半自动）结果：仅对16、18分型主要问题：可与高水平的高危型HPV31发生交叉反应。非常低的HPV感染或样本可能导致假阴性荧光测读仪温度循环仪75HPVDNAHPVDNA检检测测ROCHE PCRROCHE PCR多色荧光探针法多色荧光探针法原理：基于PCR反应结合不同荧光染料的探针检测高危型HPV并对1
29、6、18分型流程：核酸提取PCR扩增检测时间：5小时（手工操作时间15分钟）结果：Cutoff值，14种高危型，并对16、18分型最新产品，文献见美国ATHENA实验（Lancet Oncol）cobas 4800 HPV检测系统HR1618Contr.Ch1Ch1Ch2Ch2Ch3Ch3Ch4Ch431,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66,68161833313935514552565859666876HPV-mRNA检测 Hologic Aptima E6Hologic Aptima E6、E7E7检测检测 Aptima HPV检测是唯一被FDA/CE/CFDA批准的基于致癌基因E6/E7 mRNA的HPV检测试剂，相比传统的HPV DNA检测，可显著减少对一过性HPV感染的检出率，更加专注于真正有癌变风险的高危型HPV感染。7778
