1、府伟灵府伟灵西南医院检验科西南医院检验科2随着人类基因组测序计划的逐步实施以及分随着人类基因组测序计划的逐步实施以及分子生物学相关学科的迅猛发展，越来越多的子生物学相关学科的迅猛发展，越来越多的动植物、微生物基因组序列得到测定。动植物、微生物基因组序列得到测定。在在GenBank数据库中已含有数据库中已含有300万个序列，总万个序列，总数超过数超过22亿个碱基对，其中包括亿个碱基对，其中包括19种不同生种不同生物体的完整序列、近物体的完整序列、近9 000个已知功能或已推个已知功能或已推测功能的人类基因序列。测功能的人类基因序列。基因序列数据库正在以前所未有的速度迅速基因序列数据库正在以前所未
2、有的速度迅速增长。增长。3然而如何充分利用新序列信息资源，怎样然而如何充分利用新序列信息资源，怎样去研究如此众多基因的生物信息及其在生去研究如此众多基因的生物信息及其在生命过程中所担负的功能，成为生命科学工命过程中所担负的功能，成为生命科学工作者的共同课题。作者的共同课题。4已建立的诸如已建立的诸如Northern印迹、印迹、RNA酶保酶保护实验、护实验、S1核酸酶分析、噬斑杂交以及核酸酶分析、噬斑杂交以及狭线印迹等方法不能提供足够通量来有狭线印迹等方法不能提供足够通量来有效地利用新的基因组学的资源。为此，效地利用新的基因组学的资源。为此，必须发展高通量或平行监测基因表达的必须发展高通量或平行
3、监测基因表达的新方法。新方法。基因芯片技术正是在这样的背景下应运基因芯片技术正是在这样的背景下应运而生。而生。5早在早在80年代初期，有人就曾设想利用年代初期，有人就曾设想利用计算机半导体技术生产基因芯片以对计算机半导体技术生产基因芯片以对人类基因大量的遗传信息进行分析和人类基因大量的遗传信息进行分析和检查。检查。但直到但直到1994 年年Pease等人创造的光导原位合成高等人创造的光导原位合成高密、微化的寡核苷酸阵列密、微化的寡核苷酸阵列(ODTA)的制作技术问的制作技术问世之后，才使该设想逐步成为现实。世之后，才使该设想逐步成为现实。因此可以说光导因此可以说光导ODTA化学合成法，为基因芯
4、化学合成法，为基因芯片技术奠定了基础。片技术奠定了基础。7现在全世界已有十多家公司从事基因芯片现在全世界已有十多家公司从事基因芯片研究和开发工作，而且已有较为成型的产研究和开发工作，而且已有较为成型的产品和设备问世。这些公司主要以美国的品和设备问世。这些公司主要以美国的Affymetrix公司为代表。公司为代表。图片来自益来基因网图片来自益来基因网:http:/www.el- 直接在芯片上用四种核苷酸合成所需的探针直接在芯片上用四种核苷酸合成所需的探针合成点样合成点样 将已经合成好的探针定位在芯片上将已经合成好的探针定位在芯片上基因芯片制备的两种基本方法基因芯片制备的两种基本方法由美国由美国A
5、ffymetrix公司开发公司开发Affymetrix Website:http:/ from UKBF:http:/www.ukbf.fu-berlin.de/161.把玻璃基片上的活性羟基修饰上光保把玻璃基片上的活性羟基修饰上光保护基团，此光保护基团可被一定波长护基团，此光保护基团可被一定波长的光激活并脱保护。的光激活并脱保护。2.根据所要制作的阵列的需要设计光刻根据所要制作的阵列的需要设计光刻掩膜。将掩膜（掩膜。将掩膜（M1）覆盖在修饰过的）覆盖在修饰过的基片上，用光照射使曝光区域的基片基片上，用光照射使曝光区域的基片表面脱除保护基团而形成活性羟基表面脱除保护基团而形成活性羟基（1-2）
6、。）。步骤步骤3.引入引入5端被端被X基团保护、基团保护、3端被活化的单核苷酸端被活化的单核苷酸dNTP，使，使dNTP的的3端与基片上的活性羟基缩合，端与基片上的活性羟基缩合，洗去未有效结合的洗去未有效结合的dNTP（3）。）。4.更换掩膜更换掩膜M2，重复，重复1-2，直到所需要的探针阵列合，直到所需要的探针阵列合成完毕（成完毕（4-6）。）。使用多种掩盖物能以更少的合成步骤生产出使用多种掩盖物能以更少的合成步骤生产出高密度的阵列，在合成循环中探针数目呈指高密度的阵列，在合成循环中探针数目呈指数增长。数增长。某一含个核苷酸的寡聚核苷酸，通过某一含个核苷酸的寡聚核苷酸，通过4n个化学步骤能合
7、成出个化学步骤能合成出4n个可能结构。个可能结构。例如：一个完整的十核苷酸通例如：一个完整的十核苷酸通过过32个化学步骤，个化学步骤，8个小时可能个小时可能合成合成65,536（即（即216）个探针。）个探针。Picture From BROWN LAB http:/cmgm.stanford.edu/pbrown/芯片原位喷印合成原理与喷墨打印类似，芯片原位喷印合成原理与喷墨打印类似，不过芯片喷印头和墨盒有多个，墨盒中装的不过芯片喷印头和墨盒有多个，墨盒中装的是四种碱基等液体而不是碳粉。是四种碱基等液体而不是碳粉。采用的化学原理与传统采用的化学原理与传统的的DNA固相合成一致，因固相合成一致
8、，因此不需要特殊制备的化学此不需要特殊制备的化学试剂。试剂。Picture from BioDot:http:/1.根据所需微阵列，设计有凹根据所需微阵列，设计有凹凸的微印章，然后根据预先设凸的微印章，然后根据预先设计在制备的各级印章上涂上对计在制备的各级印章上涂上对应的单核苷酸。应的单核苷酸。2.按照设计的顺序将不同的微按照设计的顺序将不同的微印章逐个依次压印在同一基印章逐个依次压印在同一基片上，得到片上，得到256256阵列的阵列的高密度基因芯片。高密度基因芯片。图片来自益来基因网图片来自益来基因网:http:/www.el- Pharmaceuticals(Palo Alto,CA,US
9、A)和和Protogene(Palo Alto,CA,USA)等几处中心进行发展。等几处中心进行发展。用与压电接口（方型）相连的微型用与压电接口（方型）相连的微型喷嘴将生化物质喷向基底，通过电喷嘴将生化物质喷向基底，通过电流控制使样品体积得到精确控制。流控制使样品体积得到精确控制。第一轮结束后，清洗喷嘴进行下一第一轮结束后，清洗喷嘴进行下一步。步。方法与步骤方法与步骤301980年年Bains等将预先合成的短等将预先合成的短DNA片片段固定在固相支持物上进行的杂交测序段固定在固相支持物上进行的杂交测序实验是基因芯片的最原始模型，所以合实验是基因芯片的最原始模型，所以合成点样是基因芯片制作的最原
10、始的方法成点样是基因芯片制作的最原始的方法由由Affymetrix公司发展起来的光导公司发展起来的光导ODTA合成照相平板印刷术将基因芯片合成照相平板印刷术将基因芯片引入了工业化生产的阶段。引入了工业化生产的阶段。31将样品处理、芯片杂交和信号检测集于一将样品处理、芯片杂交和信号检测集于一体的所谓体的所谓“缩微实验室缩微实验室”逐渐成为基因芯逐渐成为基因芯片发展的新趋势。在这方面主要有以下技片发展的新趋势。在这方面主要有以下技术较为成功：术较为成功：电子芯片电子芯片三维芯片三维芯片流过式芯片流过式芯片石英谐振芯片石英谐振芯片32片基为带有正电荷的硅片，硅片经热氧化，片基为带有正电荷的硅片，硅片
11、经热氧化，制成制成1mm2的阵列，每个阵列含多个微电极，的阵列，每个阵列含多个微电极，在每个电极上通过氮化硅沉积和蚀刻制备出在每个电极上通过氮化硅沉积和蚀刻制备出样品池。样品池。将链连有亲和素的琼脂糖覆盖在电极上，在将链连有亲和素的琼脂糖覆盖在电极上，在电场作用下预先合成的生物素标记的探针即电场作用下预先合成的生物素标记的探针即可结合在特定电极上。可结合在特定电极上。AVI from Nanogen:http:/ from Nanogne website:http:/ from UKMSTS Suimmit Conference:http:/www.cmf.rl.ac.uk/presentat
12、ions/37从待测样品中分离从待测样品中分离DNA或或RNA并对其并对其进行荧光标记。进行荧光标记。将标记的靶核酸样品流过芯片，固定在将标记的靶核酸样品流过芯片，固定在芯片上微通道内的寡核苷酸探针捕获与芯片上微通道内的寡核苷酸探针捕获与之相互补的靶核酸。之相互补的靶核酸。Picutre from UKMSTS Suimmit Conference:http:/www.cmf.rl.ac.uk/presentations/38特点特点敏感性高，由于寡核苷酸吸咐表面的增大，敏感性高，由于寡核苷酸吸咐表面的增大，流过式芯片可监测稀有基因表达的变化。流过式芯片可监测稀有基因表达的变化。速度快，微通道
13、加速了杂交反应，减少了每速度快，微通道加速了杂交反应，减少了每次检测所需时间。次检测所需时间。价格降低，由于采用了特殊的共价化学技术价格降低，由于采用了特殊的共价化学技术将寡核苷酸吸咐于微通道内，使每一种流过将寡核苷酸吸咐于微通道内，使每一种流过式芯片可反复使用多次，从而使其成本降低。式芯片可反复使用多次，从而使其成本降低。Gene Logic 正在开发正在开发 http:/39靶基因的制备需要运用常规手段从细胞和靶基因的制备需要运用常规手段从细胞和组织中提取模板分子，进行模板的扩增和组织中提取模板分子，进行模板的扩增和标记。标记。靶基因样品的制备方法将根据基因芯片的靶基因样品的制备方法将根据
14、基因芯片的类型和所研究的对象（如类型和所研究的对象（如mRNA、DNA等）等）而决定。而决定。40核酸样品制备是基因芯片分析的必须步核酸样品制备是基因芯片分析的必须步骤，传统的化学提取法比较费时，不能骤，传统的化学提取法比较费时，不能满足基因芯片对快速高效的要求。因而，满足基因芯片对快速高效的要求。因而，人们发明了与芯片相结合的核酸提取方人们发明了与芯片相结合的核酸提取方法。法。芯片微过滤法芯片微过滤法 生物电子芯片法生物电子芯片法41宾夕法尼亚大学的研究小组针对人白细宾夕法尼亚大学的研究小组针对人白细胞的分离设计的一种核酸样品制备方法。胞的分离设计的一种核酸样品制备方法。微过滤芯片是通过在硅
15、片上刻出几个微微过滤芯片是通过在硅片上刻出几个微米大小的各种形状的过滤微通道，再在米大小的各种形状的过滤微通道，再在硅芯片上加上一块玻璃盖片而成。硅芯片上加上一块玻璃盖片而成。发展经历了竖式发展经历了竖式Z型结构、竖式条状梳式型结构、竖式条状梳式结构到最终的横坝式结构。结构到最终的横坝式结构。芯片微过滤法芯片微过滤法42为了把不同的癌细胞、为了把不同的癌细胞、细菌或病毒从血清、细菌或病毒从血清、水样或其他液体样品水样或其他液体样品中分离而设计的用作中分离而设计的用作介电电泳的细胞分离介电电泳的细胞分离方法。方法。通过在硅芯片上制作通过在硅芯片上制作一系列各种排列的金一系列各种排列的金属电极和在
16、这些电极属电极和在这些电极上施加高频电场，使上施加高频电场，使不同的细胞内感应出不同的细胞内感应出偶电极。偶电极的出偶电极。偶电极的出现反过来使细胞承受现反过来使细胞承受正介电力或负介电力，正介电力或负介电力，从而使细胞从各种液从而使细胞从各种液体样品中分离出来。体样品中分离出来。生物电子芯片法生物电子芯片法Picture from Nanogen website:http:/美国的美国的Nanogen公司通公司通过在微过滤芯片的电极过在微过滤芯片的电极上施加一系列高压脉冲上施加一系列高压脉冲对电极上分离得到的大对电极上分离得到的大肠杆菌细胞进行进行电肠杆菌细胞进行进行电子胞解，获得了大肠杆子
17、胞解，获得了大肠杆菌细胞内的各种菌细胞内的各种RNA和和DNA。Picture from Nanogen website:http:/44主要采用荧光分子标记：主要采用荧光分子标记：常规标记常规标记在扩增过程中加入含有荧在扩增过程中加入含有荧光标记的光标记的dNTP（至少一种为荧光标记）。（至少一种为荧光标记）。末端标记末端标记直接在引物上标记荧光。直接在引物上标记荧光。45荧光显影法荧光显影法质谱法质谱法化学发光法化学发光法光导纤维法光导纤维法压电石英谐振法压电石英谐振法ScanningmRNALabelingHybridizationCellAVI from Nanogen:http:/
18、完全正常的完全正常的 Watson-Crick配对双链配对双链 错配错配碱基的双链碱基的双链荧光强度荧光强度 完全正常的完全正常的 Watson-Crick配对双链配对双链 错配错配碱基的双链（碱基的双链（5-35%）501.电荷偶合装置电荷偶合装置CCD（charge-coupled devices）2.光电倍增管光电倍增管PMT（photomultiplier tube）51图片来自益来基因网图片来自益来基因网:http:/www.el- Solutions公司公司Packard公司公司GSI公司公司Beecher Instruments公司公司Molecular DynamicsGene
19、tic Microsystems公司公司Axon Instruments公司公司53化学发光与荧光法的基本原理类似，但化学发光与荧光法的基本原理类似，但标记物不是荧光素而是鲁米诺之类具有标记物不是荧光素而是鲁米诺之类具有化学发光特性的物质。化学发光特性的物质。化学发光比荧光法的灵敏度更高。化学发光比荧光法的灵敏度更高。54将合成的氰脲酰氯活化的寡核苷酸探针固定将合成的氰脲酰氯活化的寡核苷酸探针固定在直径在直径200m的光纤末端，然后固定有不同的光纤末端，然后固定有不同探针的光纤按特定位置组合成束，形成一个探针的光纤按特定位置组合成束，形成一个微阵列的传感装置即光纤微阵列的传感装置即光纤DNA生
20、物传感器微生物传感器微阵列。阵列。其探针末端可以伸入样品溶液中，杂交的荧其探针末端可以伸入样品溶液中，杂交的荧光信号由光纤另一端偶联的光信号由光纤另一端偶联的CCD相机接受。相机接受。整个分析操作可在整个分析操作可在5分钟内完成。分钟内完成。55光纤光纤DNA生物传感器微阵列的探针敏感膜生物传感器微阵列的探针敏感膜可以再生使用，因而成本得以降低。可以再生使用，因而成本得以降低。这种将传感器与微阵列结合起来的方法特这种将传感器与微阵列结合起来的方法特别适用于操作杂交分析不方便的环境和不别适用于操作杂交分析不方便的环境和不具备激光共聚焦显微镜这种昂贵设备的实具备激光共聚焦显微镜这种昂贵设备的实验室
21、（如临床检测实验室），对推广基因验室（如临床检测实验室），对推广基因芯片的应用有重要意义。芯片的应用有重要意义。56传感装置采用压电石英谐振晶体传感装置采用压电石英谐振晶体目前正在开发之中目前正在开发之中57石英谐振石英谐振DNA生物传感器微阵列比光纤生物传感器微阵列比光纤DNA生物传感器微阵列更具优越性生物传感器微阵列更具优越性石英谐振传感器具有微天平之称，敏感性很高（理石英谐振传感器具有微天平之称，敏感性很高（理论上可达到论上可达到fg级水平），有望省略杂交前的扩增步骤。级水平），有望省略杂交前的扩增步骤。石英谐振传感器的响应机制是石英谐振传感器的响应机制是“压电效应压电效应”，即对，即对
22、质量敏感，所以无须对探针或靶核酸进行标记。质量敏感，所以无须对探针或靶核酸进行标记。581998年底美国科学促进会将基因芯片列年底美国科学促进会将基因芯片列为为1998年度自然科学领域十大进展之一年度自然科学领域十大进展之一 59杂交测序技术（杂交测序技术（SBH）邻堆杂交技术（邻堆杂交技术（CSH）毛细管电泳芯片测序技术毛细管电泳芯片测序技术60基因芯片发展和应用的基础。基因芯片发展和应用的基础。任何线性任何线性DNA或或RNA单链均可分解为一系列碱单链均可分解为一系列碱基数固定、错落重叠的寡核苷酸片段（基数固定、错落重叠的寡核苷酸片段（ODT），），或称为亚序列（或称为亚序列（subseq
23、uence）将所有将所有n体亚序列探针都固定在一个固相支持物上，体亚序列探针都固定在一个固相支持物上，n体亚体亚序列探针的序列与其在固相支持物上的位点一一对应形成序列探针的序列与其在固相支持物上的位点一一对应形成探针阵列。探针阵列。被标记的靶序列与芯片进行杂交后，芯片上所有杂交信号被标记的靶序列与芯片进行杂交后，芯片上所有杂交信号的位点组成一个的位点组成一个“杂交模式杂交模式”，该，该“杂交模式杂交模式”实际上反实际上反应的是靶序列的所有应的是靶序列的所有n体亚序列信息，计算机通过对该体亚序列信息，计算机通过对该“杂交模式杂交模式”的分析就可以确定靶核酸的序列。的分析就可以确定靶核酸的序列。方
24、法与步骤方法与步骤62采用采用SBH技术，用含技术，用含65,536个个8聚寡核苷聚寡核苷酸的微阵列，可测定酸的微阵列，可测定200bp长长DNA序列，序列，采用采用67,108,864个个13聚寡核苷酸探针的微聚寡核苷酸探针的微阵列，可对数千个碱基长的阵列，可对数千个碱基长的DNA测序。测序。63SBH技术的效率随着微阵列中寡核苷酸数量技术的效率随着微阵列中寡核苷酸数量与长度的增加而提高，但微阵列中寡核苷酸与长度的增加而提高，但微阵列中寡核苷酸数量与长度的增加则提高了微阵列的复杂性，数量与长度的增加则提高了微阵列的复杂性，降低了杂交准确性。降低了杂交准确性。CSH技术弥补了技术弥补了SBH技
25、术存在的弊端，技术存在的弊端，CSH技术的应用增加了微阵列中寡核苷酸的有效技术的应用增加了微阵列中寡核苷酸的有效长度，加强了序列准确性，可进行较长的长度，加强了序列准确性，可进行较长的DNA测序。测序。64CSH杂交测序原理示意图（杂交测序原理示意图（点击此处观看点击此处观看Flash动画动画）65Mathies等成功地应用通过光刻加工出等成功地应用通过光刻加工出的毛细管长的毛细管长3.5厘米、横切面厘米、横切面50微米微米8微米的毛细管电泳测序芯片在微米的毛细管电泳测序芯片在10分钟内分钟内完成了含完成了含433碱基对的碱基对的DNA序列测定。序列测定。美国的美国的CuraGen公司和普林斯
26、顿大学也公司和普林斯顿大学也正在从事这类芯片的研究开发工作。正在从事这类芯片的研究开发工作。66随着人类基因组计划的顺利进行，基因组研随着人类基因组计划的顺利进行，基因组研究的重心转了功能基因组学，研究基因的功究的重心转了功能基因组学，研究基因的功能，特别是研究疾病相关基因已成了生物科能，特别是研究疾病相关基因已成了生物科技界的热点。基因表达芯片为此提供了最好技界的热点。基因表达芯片为此提供了最好的技术平台。的技术平台。67对大多数基因而言，对大多数基因而言，mRNA表达水平与表达水平与其蛋白质的水平相对应。其蛋白质的水平相对应。Picture from IIR:http:/www.inet.
27、uni2.dk/iirrh/IIRhome.htm68一般以一般以Oligo-dT作引物进行作引物进行RT-PCR制备靶基制备靶基因，对细胞内大量基因的因，对细胞内大量基因的mRNA表达差异进表达差异进行检测，从而了解细胞的性质与状态。行检测，从而了解细胞的性质与状态。基因芯片技术可清楚地直接快速地检测出以基因芯片技术可清楚地直接快速地检测出以1:300,000水平出现的水平出现的mRNA，且易于同时监，且易于同时监测成千上万的基因。测成千上万的基因。69RRRRGG:AB:A=B:ABSample ASample Bpreparation of mRNAlabeled cDNAmixingh
28、ybridizationpreparation of mRNAlabeled cDNA基因表达分析示意图基因表达分析示意图70由于生物芯片技术可直接测到由于生物芯片技术可直接测到mRNA的的种类及丰度，所以它是研究基因表达的种类及丰度，所以它是研究基因表达的有力工具。有力工具。基因芯片种包含了几万种人工合成的寡基因芯片种包含了几万种人工合成的寡核苷酸探针或核苷酸探针或cDNA，可检测转录产物，可检测转录产物从几个数量级到每个细胞的几个拷贝，从几个数量级到每个细胞的几个拷贝，均能被定量研究，被检测目的基因可多均能被定量研究，被检测目的基因可多达达10,000个。个。71系统微型化，样品需量极小系
29、统微型化，样品需量极小 同时研究上万个基因的表达变化，同时研究上万个基因的表达变化，研究效率明显提高研究效率明显提高 能更多地揭示基因之间表达变化能更多地揭示基因之间表达变化的相互关系，从而研究基因与基的相互关系，从而研究基因与基因之间内在的作用关系因之间内在的作用关系 检测基因表达变化的灵敏度高，检测基因表达变化的灵敏度高，可检测丰度相差几个数量级的表可检测丰度相差几个数量级的表达情况达情况 节约费用和时间节约费用和时间 表达谱基因芯片研究基因表达与传统的表达谱基因芯片研究基因表达与传统的Northern Blot相比有许多重要的优点相比有许多重要的优点72定量检测大量基因表达水平在阐述基因
30、定量检测大量基因表达水平在阐述基因功能、探索疾病原因及机理、发现可能功能、探索疾病原因及机理、发现可能的诊断及治疗等方面是很有价值的。的诊断及治疗等方面是很有价值的。基因芯片技术在发现新基因及分析各个基因芯片技术在发现新基因及分析各个基因在不同时空表达方面时一项十分有基因在不同时空表达方面时一项十分有用的技术，它具有样品用量极少，自动用的技术，它具有样品用量极少，自动化程度高等优点，便于大量筛选新基因。化程度高等优点，便于大量筛选新基因。73目前，大量人类目前，大量人类ESTs给给cDNA微阵列提供微阵列提供了丰富的资源，数据库中了丰富的资源，数据库中400,000个个ESTs代表了所有人类基
31、因，成千上万的代表了所有人类基因，成千上万的ESTs微阵列将为人类基因表达研究提供强有力微阵列将为人类基因表达研究提供强有力的分析工具。这将大大地加速人类基因组的分析工具。这将大大地加速人类基因组的功能分析。的功能分析。74肿瘤和遗传性疾病发生的根本原因是由于肿瘤和遗传性疾病发生的根本原因是由于遗传物质发生了改变。遗传物质发生了改变。检测基因突变对于阐明肿瘤与遗传病的分检测基因突变对于阐明肿瘤与遗传病的分子机制、疾病的早期诊断具有重要意义。子机制、疾病的早期诊断具有重要意义。75以往研究突变和多态时多采用以往研究突变和多态时多采用PCR-SS-CP、手工或自动测序、异源双链分析、手工或自动测序
32、、异源双链分析、蛋白截短检测等方法，所有这些都需经蛋白截短检测等方法，所有这些都需经过电泳环节，不能满足大规模、低消耗过电泳环节，不能满足大规模、低消耗和自动化的要求。和自动化的要求。应用基因芯片方法检测时可克服上述不应用基因芯片方法检测时可克服上述不足，且与足，且与DNA聚合酶或连接酶结合检测聚合酶或连接酶结合检测时可获得更高的分辨率时可获得更高的分辨率76Hacia等用含有等用含有96,000个寡核苷酸探针的基因个寡核苷酸探针的基因芯片来检测遗传性乳腺癌基因芯片来检测遗传性乳腺癌基因BRCA1第第11外外显子显子3.45kb长度内的所有可能的杂合性突变，长度内的所有可能的杂合性突变，包括碱
33、基替换及小的插入、缺失等，并借此包括碱基替换及小的插入、缺失等，并借此确定发病风险。确定发病风险。基因芯片也可用于肺癌、卵巢癌、前列腺癌、基因芯片也可用于肺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌等多种肿瘤的研究中，为肿瘤基因组结肠癌等多种肿瘤的研究中，为肿瘤基因组解剖计划（解剖计划（CGAP）的完成提供重要的技术）的完成提供重要的技术支持。支持。77Lipshutz等证明基因芯片可用来筛查等证明基因芯片可用来筛查HIV病毒的蛋白酶基因和反转录酶基因病毒的蛋白酶基因和反转录酶基因的突变。这些突变能引起对抗生素，如的突变。这些突变能引起对抗生素，如AZT等的抗性。等的抗性。Affymetrix公司已制造出商
34、用公司已制造出商用HIV芯片，芯片，包括包括1,040个蛋白酶和反转录酶基因，个蛋白酶和反转录酶基因，用来研究病毒抗性发展过程中的碱基突用来研究病毒抗性发展过程中的碱基突变。变。78Chee等制造了含有等制造了含有135,000个个25-mer探针的基探针的基因芯片来探测因芯片来探测16.6kb的人线粒体基因组。共的人线粒体基因组。共分析了分析了10个样本，检出个样本，检出505个多态。每个样本个多态。每个样本可在可在12min内阅读完毕，正确率达内阅读完毕，正确率达99%。据。据估测，每一工作日可阅读估测，每一工作日可阅读40个线粒体基因组，个线粒体基因组，大大高于现在凝胶测序仪可达到的每日
35、大大高于现在凝胶测序仪可达到的每日2个基个基因组水平。因组水平。基因芯片除可用于研究基因芯片除可用于研究mtDNA基因突变以及基因突变以及民族内和民族间民族内和民族间mtDNA的多态性外，还可用的多态性外，还可用来揭示来揭示mtDNA基因的表达与神经性疾病和长基因的表达与神经性疾病和长寿等关系。寿等关系。79SBH技术可大规模地检测和分析技术可大规模地检测和分析DNA的变异及的变异及多态性。多态性。Picture from NCBI website.突变突变80基因芯片技术是一项高效、准确的基因芯片技术是一项高效、准确的DNA序列分析技术，将基因芯片技术用于检序列分析技术，将基因芯片技术用于检
36、测分子突变，不仅可准确地确定突变位测分子突变，不仅可准确地确定突变位置和类型，更可同时检测多个基因，及置和类型，更可同时检测多个基因，及至整个基因组的突变，其快速高效是其至整个基因组的突变，其快速高效是其它方法无法比拟的。它方法无法比拟的。81基因芯片技术用于基因组研究可创造第基因芯片技术用于基因组研究可创造第三代遗传图，即将遗传病表型于三代遗传图，即将遗传病表型于DNA上上特定的基因序列联系起来。特定的基因序列联系起来。以单核苷酸多态性（以单核苷酸多态性（SNPs)为标记可帮为标记可帮助区分两个个体遗传物质的差异，若能助区分两个个体遗传物质的差异，若能将所有将所有SNPs全部信息装入生物芯片
37、则全部信息装入生物芯片则可检测到与之相关的基因间差异。可检测到与之相关的基因间差异。多态性分析多态性分析82基因组测序完成后，未知基因的功能研基因组测序完成后，未知基因的功能研究是一个十分诱人的后基因组研究课题。究是一个十分诱人的后基因组研究课题。斯坦福大学的斯坦福大学的Davis研究小组的研究提示研究小组的研究提示DNA芯片技术将来可能应用于人类基因芯片技术将来可能应用于人类基因组测序完成后未明开放读码框架组测序完成后未明开放读码框架ORF生生物学功能的研究，可能会对深刻认识生物学功能的研究，可能会对深刻认识生命现象及药物设计带来重大影响。命现象及药物设计带来重大影响。83Davis研究小组
38、利用研究小组利用DNA芯片技术对酵母缺失芯片技术对酵母缺失突变株进行定量分析以确定酵母全序列测定突变株进行定量分析以确定酵母全序列测定完成后新发现的完成后新发现的ORF的生物学功能。他们应的生物学功能。他们应用基因打靶技术产生多个用基因打靶技术产生多个ORF缺失的酵母突缺失的酵母突变株，并在缺失变株，并在缺失ORF旁引入旁引入20个核苷酸的标个核苷酸的标志序列作为缺失志序列作为缺失ORF的身份标志，谓之的身份标志，谓之分分子条形码子条形码（molecular bar codes），分子条），分子条形码可与基因芯片上的探针进行杂交以便于形码可与基因芯片上的探针进行杂交以便于筛选。这样，筛选。这样
39、，ORF的功能测试可通过一次杂的功能测试可通过一次杂交及用同一生长选择条件完成，大大提高了交及用同一生长选择条件完成，大大提高了效率和准确性。效率和准确性。84遗传病相关基因的定位遗传病相关基因的定位肿瘤疾病的诊断肿瘤疾病的诊断感染性疾病的诊断感染性疾病的诊断85随着随着HGP的发展，各种方法相继创立，的发展，各种方法相继创立，并应用到基因定位中。并应用到基因定位中。基因芯片技术已成为一种基因定位的高基因芯片技术已成为一种基因定位的高效工具。效工具。配合使用多重配合使用多重PCR/基因芯片，可一次基因芯片，可一次筛查多种遗传病，既经济又敏感可靠。筛查多种遗传病，既经济又敏感可靠。86HIV-1
40、基因组中的基因组中的rt与与pro在疾病过程中易发在疾病过程中易发生多种变异，从而导致对多种药物的抗药性，生多种变异，从而导致对多种药物的抗药性，因此，检测和分析其变异性与多态性具有重因此，检测和分析其变异性与多态性具有重要临床意义。要临床意义。可以预测，在不久的将来，人们可望在一张可以预测，在不久的将来，人们可望在一张基因芯片上检测几乎所有的病原微生物基因。基因芯片上检测几乎所有的病原微生物基因。87通过确定重复基因的程度，基因芯片已通过确定重复基因的程度，基因芯片已用来对基因组文库进行图谱绘制。用来对基因组文库进行图谱绘制。基因方库中的每个克隆的所有化学反应基因方库中的每个克隆的所有化学反
41、应均一个反应管，可以快速平行地对多克均一个反应管，可以快速平行地对多克隆进行图谱绘制。隆进行图谱绘制。每人每天可对几百个克隆进行基因图谱每人每天可对几百个克隆进行基因图谱绘制。绘制。88药物筛选药物筛选药物作用机制研究药物作用机制研究毒理学研究毒理学研究基因扫描基因扫描环境化学毒物的筛选环境化学毒物的筛选耐药菌株和药敏检测耐药菌株和药敏检测891.基因芯片上核酸探针的选择和基因芯片上核酸探针的选择和序列设计，以及基因芯片杂交序列设计，以及基因芯片杂交后信息的分析、处理和建库。后信息的分析、处理和建库。两个方面的内容：两个方面的内容：902.基因芯片所获大量的基因及其基因相基因芯片所获大量的基因
42、及其基因相互作用信息，为生物信息学研究和生互作用信息，为生物信息学研究和生物数据库的挖掘提供了高效、快速和物数据库的挖掘提供了高效、快速和方便的实验工具，拓宽了生物信息学方便的实验工具，拓宽了生物信息学的研究内容。的研究内容。911.根据基因芯片的分析目标，从相关基根据基因芯片的分析目标，从相关基因数据库中选取特异性基因序列，使因数据库中选取特异性基因序列，使之能够通过与靶基因杂交而给出明确、之能够通过与靶基因杂交而给出明确、可靠、易于分析的分子及其相互作用可靠、易于分析的分子及其相互作用信息。信息。922.根据所选用的核酸序列进行探针序列根据所选用的核酸序列进行探针序列及其布局设计，使所设计
43、的探针组合及其布局设计，使所设计的探针组合对靶基因的杂交特异性强，探针之间对靶基因的杂交特异性强，探针之间关联性好。关联性好。933.探针及其空间布局的优化：包括探针探针及其空间布局的优化：包括探针制备工艺的优化和探针杂交的优化等制备工艺的优化和探针杂交的优化等诸多方面。诸多方面。94高密度芯片获的分子信息，已很难运用高密度芯片获的分子信息，已很难运用传统的论文形式来发表。传统的论文形式来发表。目前，一些研究者通过把基因芯片的表目前，一些研究者通过把基因芯片的表达谱公布在自己实验室网站上，供其他达谱公布在自己实验室网站上，供其他研究者的访问与交流。研究者的访问与交流。95由于网站分散以及各实验
44、室所用芯片缺由于网站分散以及各实验室所用芯片缺乏标准，使不同实验室之间的数据交流乏标准，使不同实验室之间的数据交流和分析存在一定困难。和分析存在一定困难。基因芯片数据标准化问题已引起人们越基因芯片数据标准化问题已引起人们越来越多的重视，人们正考虑建立相应的来越多的重视，人们正考虑建立相应的芯片数据库。芯片数据库。96一些公司与研究机构正在发展与基因芯一些公司与研究机构正在发展与基因芯片的相关软件，用于构建和管理基因表片的相关软件，用于构建和管理基因表达信息的数据库及数据比较工具。达信息的数据库及数据比较工具。97基因芯片技术作为基因分析的有力武器，基因芯片技术作为基因分析的有力武器，不仅被学术
45、界看重，而且得到很多大公不仅被学术界看重，而且得到很多大公司和多国政府部门的高度重视并投以巨司和多国政府部门的高度重视并投以巨资进行研究开发。资进行研究开发。基因芯片技术在诞生的十几年内就得到基因芯片技术在诞生的十几年内就得到巨大的进步，目前已很难从技术的角度巨大的进步，目前已很难从技术的角度给基因芯片下一个准确的定义。给基因芯片下一个准确的定义。98在芯片技术中，虽然邻堆杂交技术弥补在芯片技术中，虽然邻堆杂交技术弥补了了SBH随探针延长而特异性降低的不足，随探针延长而特异性降低的不足，但芯片的分子生物学基础已不再是杂交但芯片的分子生物学基础已不再是杂交分析一家的天下，基于毛细管电泳分析分析一
46、家的天下，基于毛细管电泳分析的基因芯片已经诞生。的基因芯片已经诞生。99光导光导ODTA合成平板印刷术虽然第一次将基合成平板印刷术虽然第一次将基因芯片从实验室带到了商品化的时代，但特因芯片从实验室带到了商品化的时代，但特殊的设备和昂贵的成本以及合成效率的不尽殊的设备和昂贵的成本以及合成效率的不尽人意使它不能阻止喷印法和它竞争，而且，人意使它不能阻止喷印法和它竞争，而且，曾被它取代的合成点样法也由于自动化技术曾被它取代的合成点样法也由于自动化技术的进步而获得了新生，并在下一代芯片技术的进步而获得了新生，并在下一代芯片技术中扮演重要角色。中扮演重要角色。100传统的核酸样品制备、传统的核酸样品制备
47、、DNA片段的化学片段的化学反应制备和芯片杂交分析三步曲更是显反应制备和芯片杂交分析三步曲更是显得烦琐，因而得烦琐，因而“缩微实验室缩微实验室”又应运而又应运而生。生。基因芯片所具有的高效核酸分析能力使基因芯片所具有的高效核酸分析能力使它被誉为遗传信息分析方法革命性的里它被誉为遗传信息分析方法革命性的里程碑。程碑。101除了核酸测序外，在基因诊断、寻找新除了核酸测序外，在基因诊断、寻找新基因、研究基因表达、突变检测、基因基因、研究基因表达、突变检测、基因多态性分析、基因指纹分析和后基因组多态性分析、基因指纹分析和后基因组研究等方面得到广泛应用。研究等方面得到广泛应用。但是基因芯片也不是十全十美，在灵敏但是基因芯片也不是十全十美，在灵敏度、特异性、成本等方面都有待改进。度、特异性、成本等方面都有待改进。
