1、第六章第六章 渔药安全性评价渔药安全性评价 渔用药物与其他医用、兽用药品、农药、饲渔用药物与其他医用、兽用药品、农药、饲料添加剂以及各种工业用及生活用化学药品料添加剂以及各种工业用及生活用化学药品一样，在推广应用以前，均需要检验其毒性一样，在推广应用以前，均需要检验其毒性和安全性，即进行和安全性，即进行毒理学方面的试验研究毒理学方面的试验研究和和安全性的毒理学评价安全性的毒理学评价，只有被试验证明是安，只有被试验证明是安全而有效的渔用药物，才能获准进入临床应全而有效的渔用药物，才能获准进入临床应用阶段。用阶段。第一节第一节 渔药毒理学简介渔药毒理学简介第二节第二节 渔药的安全评价渔药的安全评价
2、第一节第一节 渔药毒理学简介渔药毒理学简介 毒理学毒理学（toxicologytoxicology）：是研究化学、物理、）：是研究化学、物理、生物等因素对生物机体负面效应的综合性学科。生物等因素对生物机体负面效应的综合性学科。渔药毒理学渔药毒理学：主要是研究渔用药物对水生动、：主要是研究渔用药物对水生动、植物体的有害影响，包括这些有害影响发生的植物体的有害影响，包括这些有害影响发生的程度、频率和发生的机制，以及如何应用毒理程度、频率和发生的机制，以及如何应用毒理学资料预测渔药对人类和环境生态的潜在危害，学资料预测渔药对人类和环境生态的潜在危害，从而达到控制和预防这类危害发生的目的。从而达到控制
3、和预防这类危害发生的目的。毒理学研究的范围很广，毒理学研究的范围很广，包括毒物的来源、化学结构、理化性质、毒性、包括毒物的来源、化学结构、理化性质、毒性、影响毒性的因素、毒物代谢动力学、毒物的生物影响毒性的因素、毒物代谢动力学、毒物的生物转化、作用机理、中毒的诊断症状、病理变化、转化、作用机理、中毒的诊断症状、病理变化、组织病理、中毒的诊断、毒物的检测方法、中毒组织病理、中毒的诊断、毒物的检测方法、中毒的治疗与预防等。的治疗与预防等。此外毒理学还研究毒物的一些特殊作用，如此外毒理学还研究毒物的一些特殊作用，如“三三致致”作用、免疫抑制作用、行为异常、遗传异常、作用、免疫抑制作用、行为异常、遗传
4、异常、对生殖的影响、对生态的影响以及毒物及其他化对生殖的影响、对生态的影响以及毒物及其他化学物质之间的联合作用和相互作用等。学物质之间的联合作用和相互作用等。现代毒理学的研究方法可概括为现代毒理学的研究方法可概括为实验室方法实验室方法、临床观察和现场调查临床观察和现场调查、综合危险度评定综合危险度评定等三大等三大类。类。渔药毒理学的研究内容渔药毒理学的研究内容主要包括以下几个方面：主要包括以下几个方面：即急性毒性试验、亚急性毒性试验和慢性毒性即急性毒性试验、亚急性毒性试验和慢性毒性试验、致突变试验、生殖毒性试验、致癌试验、试验、致突变试验、生殖毒性试验、致癌试验、临床毒性观察和其他毒性试验等。
5、临床毒性观察和其他毒性试验等。渔药毒理学试验又可大致分为两类：一般毒性渔药毒理学试验又可大致分为两类：一般毒性试验和特殊毒性试验试验和特殊毒性试验 一般毒性试验一般毒性试验 指那些不以观察和测定某种特定的毒性指那些不以观察和测定某种特定的毒性反应为目的而设计的毒性试验，所观察反应为目的而设计的毒性试验，所观察的毒性指标具有广谱性和不确定性等特的毒性指标具有广谱性和不确定性等特点，如点，如急性、亚急性、慢性（或终身）急性、亚急性、慢性（或终身）毒性试验毒性试验等。等。特殊毒性试验特殊毒性试验 指以观察和测定药物能否引起某种或某些指以观察和测定药物能否引起某种或某些特定毒性反应为目的而设计的毒性试
6、验，特定毒性反应为目的而设计的毒性试验，毒性指标明确。毒性指标明确。狭义狭义的特殊毒性试验是指致畸、致突变、的特殊毒性试验是指致畸、致突变、致癌等致癌等“三致三致”试验。试验。广义广义的特殊毒性试验还包括过敏性试验、的特殊毒性试验还包括过敏性试验、局部刺激试验、免疫毒性试验、光敏试验、局部刺激试验、免疫毒性试验、光敏试验、眼毒试验、耳毒试验等。眼毒试验、耳毒试验等。在毒理学试验研究的设计中，都应该特在毒理学试验研究的设计中，都应该特别注意别注意剂量剂量、给药途径给药途径、动物种属动物种属和和给给药次数与观测期限药次数与观测期限等方面。等方面。毒性试验毒性试验一、急性毒性试验一、急性毒性试验二、
7、亚急性毒性试验二、亚急性毒性试验三、慢性毒性试验三、慢性毒性试验四、特殊毒理学试验四、特殊毒理学试验五、行为回避反应五、行为回避反应六、毒代动力学研究六、毒代动力学研究一、急性毒性试验一、急性毒性试验 急性毒性试验急性毒性试验是在是在1d1d内单次或多次内单次或多次（2 23 3次）次）对实验动物给予药物后，在对实验动物给予药物后，在7d7d内内，连续观察实，连续观察实验动物所产生的毒性反应和死亡情况，观察毒验动物所产生的毒性反应和死亡情况，观察毒性反应过程中毒性的表现，分析毒性主要涉及性反应过程中毒性的表现，分析毒性主要涉及何种组织和器官，毒性反应出现的时间、毒性何种组织和器官，毒性反应出现
8、的时间、毒性损害的严重程度，是否可以逆转消失。损害的严重程度，是否可以逆转消失。如果实验动物中毒死亡应及时解剖，进行尸检，如果实验动物中毒死亡应及时解剖，进行尸检，如果发现病变器官就应该进一步做病理学检查。如果发现病变器官就应该进一步做病理学检查。急性毒性试验的目的急性毒性试验的目的:1.1.确定受试药物的毒性强度；确定受试药物的毒性强度；2.2.计算治疗指数（计算治疗指数（therapeutic index,TItherapeutic index,TI），），半数致死量半数致死量LDLD5050和和半数有效量半数有效量EDED5050的比值即治的比值即治疗指数；疗指数；3.3.观察毒性症状为
9、临床检测毒性提供参考依据，观察毒性症状为临床检测毒性提供参考依据，4.4.为亚急性、慢性毒性的试验设计提供参考资料。为亚急性、慢性毒性的试验设计提供参考资料。药物急性毒性的测定，可分为药物急性毒性的测定，可分为静水式生物测静水式生物测试法试法和和流水式生物测试法流水式生物测试法两种。两种。常以开始致死浓度（常以开始致死浓度（ILLILL）、半数致死浓度）、半数致死浓度LCLC5050和半数有效量和半数有效量EDED5050或半数忍受限（或半数忍受限（TLmTLm），），并结合该渔药引起受试生物体中毒的症状和并结合该渔药引起受试生物体中毒的症状和特点，评价被测试渔药毒性的强弱以及它对特点，评价被
10、测试渔药毒性的强弱以及它对水环境的污染程度，为制定该渔药的最高用水环境的污染程度，为制定该渔药的最高用药量或环境中最大允许浓度（药量或环境中最大允许浓度（MATCMATC）提供基）提供基本数据。本数据。由于急性毒性试验的水生动物，常以小型由于急性毒性试验的水生动物，常以小型个体为主，其中主要是各种鱼类。通常要个体为主，其中主要是各种鱼类。通常要选择敏感性高、来源广、易于饲养的品种，选择敏感性高、来源广、易于饲养的品种，如鲢、草鱼，也可以选用金鱼、鲤鱼、黄如鲢、草鱼，也可以选用金鱼、鲤鱼、黄鳝等。鳝等。一般选用的动物个体差异不应过大（同一一般选用的动物个体差异不应过大（同一批试验中，最大个体与最
11、小个体规格差异批试验中，最大个体与最小个体规格差异应不超过应不超过1.51.5倍），以体重小于倍），以体重小于5.0g5.0g体长小体长小于于7.0cm7.0cm的较好。的较好。进行毒性试验之前，首先将受试动物在实验室进行毒性试验之前，首先将受试动物在实验室内养殖内养殖7-10d7-10d，剔除有病或畸形个体后随机分组，剔除有病或畸形个体后随机分组进行试验。进行试验。试验时，要控制水温保持恒定：以温水性鱼类试验时，要控制水温保持恒定：以温水性鱼类为为2525，冷水性鱼类为，冷水性鱼类为1212为宜。溶解氧要稳为宜。溶解氧要稳定在定在5.0mg/L5.0mg/L以上，以上，pHpH控制在控制在6
12、.5-8.56.5-8.5之间。之间。静水试验每日至少换一次试验溶液，流式试验静水试验每日至少换一次试验溶液，流式试验每每24h24h要换要换95%95%的新试液。的新试液。试验期间，对照组受试动物的死亡率应低于试验期间，对照组受试动物的死亡率应低于5%5%。在急性毒性试验期间，对受试动物一般不在急性毒性试验期间，对受试动物一般不投喂饵料，从致毒开始，观察记录受试鱼投喂饵料，从致毒开始，观察记录受试鱼类的中毒表现，生理、生化变化和死亡情类的中毒表现，生理、生化变化和死亡情况。况。并将观察结果采用内插法或几率单位并将观察结果采用内插法或几率单位-对对数图解法求出实验动物的开始致死浓度数图解法求出
13、实验动物的开始致死浓度（开始致死水平，（开始致死水平，ILLILL）、全部死亡的最）、全部死亡的最小浓度（小浓度（LCLC100100）和半数致死浓度）和半数致死浓度LCLC5050。急性毒性的参数：急性毒性的参数：半数致死剂量半数致死剂量LDLD5050 在测定药物毒性的实际工作中，往往要先在测定药物毒性的实际工作中，往往要先做预备试验，大概了解药物引起受试动物做预备试验，大概了解药物引起受试动物全部死亡和不引起死亡的剂量范围，全部死亡和不引起死亡的剂量范围，再将受试动物分为几组，各组给予不同的再将受试动物分为几组，各组给予不同的剂量，剂量，然后观察各组的死亡率。然后观察各组的死亡率。各组动
14、物的死亡率随着剂量增加而递升，但是两者各组动物的死亡率随着剂量增加而递升，但是两者不是直线关系，呈长尾的不是直线关系，呈长尾的“S”S”型曲线。如果将剂量型曲线。如果将剂量值变换成对数值，则死亡率的曲线成为一条值变换成对数值，则死亡率的曲线成为一条对称的对称的“S”S”型曲线型曲线，这条曲线的两端伸延平坦，即上升速，这条曲线的两端伸延平坦，即上升速度较缓慢。度较缓慢。药物毒性性试验中，死亡率从开始上升阶段和邻近药物毒性性试验中，死亡率从开始上升阶段和邻近100%100%死亡的终了阶段，剂量的增加所引起的死亡率死亡的终了阶段，剂量的增加所引起的死亡率上升是比较缓慢的，即在两端处的剂量稍有变动时，
15、上升是比较缓慢的，即在两端处的剂量稍有变动时，在死亡率上不宜表现出来。在死亡率上不宜表现出来。而在中间阶段，即在而在中间阶段，即在50%50%死亡率处，剂量稍有增减变死亡率处，剂量稍有增减变动时，便立即会在死亡率上产生明显的差别。动时，便立即会在死亡率上产生明显的差别。由此可见，位于曲线两端的最小致死量和绝由此可见，位于曲线两端的最小致死量和绝对致死量等指标都不够敏感，且稳定性较差，对致死量等指标都不够敏感，且稳定性较差，误差较大，若作为药物毒性测定的主要指标误差较大，若作为药物毒性测定的主要指标是不合适的。是不合适的。而位于曲线中段的而位于曲线中段的半数致浓度最为敏感半数致浓度最为敏感，同，
16、同时也比较稳定，误差小，所以时也比较稳定，误差小，所以半数致死浓度半数致死浓度是用来表示和衡量某药物（或毒性）大小较是用来表示和衡量某药物（或毒性）大小较常用的指标。常用的指标。LCLC5050测定方法在许多统计学专著中都有详细的测定方法在许多统计学专著中都有详细的论述和应用举例。论述和应用举例。LCLC5050测定方法虽然众多，其实影响测定方法虽然众多，其实影响LCLC5050测定结测定结果准确性的因素不是计算方法的不同，其果准确性的因素不是计算方法的不同，其关关键是键是试验设计应符合要求，药物剂量大小的试验设计应符合要求，药物剂量大小的确定，药物称量与配制，受试动物的种类、确定，药物称量与
17、配制，受试动物的种类、体重、性别、健康状态，给药操作的熟练程体重、性别、健康状态，给药操作的熟练程度。度。下面介绍两种简便的测定计算下面介绍两种简便的测定计算LCLC5050的方法的方法1.1.目测概率单位法目测概率单位法 （绘图法、直线内插法）（绘图法、直线内插法）将试验剂量换算成对数剂量，死亡率换算成概率将试验剂量换算成对数剂量，死亡率换算成概率（机率）单位，使剂量（机率）单位，使剂量-死亡率曲线直线化。即按死亡率曲线直线化。即按剂量与死亡百分数直接在图纸上绘出剂量与死亡百分数直接在图纸上绘出LCLC5050。步骤如。步骤如下：下：1 1）编制计算表）编制计算表 将剂量换算成对数剂量（将剂
18、量换算成对数剂量（X X）；将死亡率换算成概）；将死亡率换算成概率单位（率单位（Y Y），死亡率为），死亡率为0 0或或100%100%者不列入。计算表者不列入。计算表应含剂量、对数剂量、动物数、死亡动物数、死亡应含剂量、对数剂量、动物数、死亡动物数、死亡率、概率单位等项目。率、概率单位等项目。2 2）用目测法求）用目测法求LCLC5050 依据计算表中数据，以图纸的横坐标为对数剂量依据计算表中数据，以图纸的横坐标为对数剂量（X X），纵坐标为死亡率的概率单位（），纵坐标为死亡率的概率单位（Y Y），绘制），绘制散点图。然后顺着各点分布的趋势目测较适直线，散点图。然后顺着各点分布的趋势目测较适
19、直线，可先执一条黑线在点图上移动，使点子大体上交可先执一条黑线在点图上移动，使点子大体上交错分布在直线的上下，各点至直线的纵向距离应错分布在直线的上下，各点至直线的纵向距离应尽量短些，并重点照顾尽量短些，并重点照顾Y=5Y=5附近的点子。黑线位附近的点子。黑线位置确定后，即用铅笔在图上定下两点，然后作一置确定后，即用铅笔在图上定下两点，然后作一直线。从纵坐标概率单位为直线。从纵坐标概率单位为5 5处作一水平线，过处作一水平线，过水平线与直线的交点作垂直线与横坐标相交，此水平线与直线的交点作垂直线与横坐标相交，此处的读数极为处的读数极为LC50LC50的对数值。的对数值。3 3）求）求LCLC5
20、050的可限区间的可限区间 上面所求得的上面所求得的LCLC5050是一个样本指标，只能作为总体是一个样本指标，只能作为总体LCLC5050的点值估计，同时也可对总体的点值估计，同时也可对总体LCLC5050做范围估计，做范围估计，即求总体即求总体LCLC5050的可信区间。的可信区间。A.A.按下式求各致死量对数值的标准差按下式求各致死量对数值的标准差 B.B.按下列公式求半数致死量对数值的标准误按下列公式求半数致死量对数值的标准误 C.C.按下式求半数致死量的按下式求半数致死量的95%95%可信区间可信区间 在实验设计上，本法要求剂量按等比数级排列，在实验设计上，本法要求剂量按等比数级排列
21、，如出现相邻的重复如出现相邻的重复0 0或或100%100%，应将靠边的组弃，应将靠边的组弃去不计，是小剂量组只有去不计，是小剂量组只有1 1组组0 0，大剂量组只有，大剂量组只有1 1组组100%100%。算式如下：。算式如下：其中其中XmXm最大剂量的对数最大剂量的对数 i i相邻两剂量比值（高剂量为分子）的对数相邻两剂量比值（高剂量为分子）的对数 p p各组的死亡率，以小数表示。各组的死亡率，以小数表示。2.2.改进寇氏改进寇氏（karber）法法急性毒性试验举例急性毒性试验举例 急性毒性一般根据急性毒性一般根据LCLC5050的大小，参照急性毒的大小，参照急性毒性的标准进行评价。性的标
22、准进行评价。更多的则是采用渔药的安全浓度进行评价。更多的则是采用渔药的安全浓度进行评价。国内外关于药物安全浓度的评价方法，主要有以下几国内外关于药物安全浓度的评价方法，主要有以下几种：种：1.1.经验公式经验公式，即安全浓度，即安全浓度=96h=96h的半数致死浓度（的半数致死浓度（96h 96h LC50LC50）0.10.1 2.2.律纳方法律纳方法（ReineyaReineya），即试验生物），即试验生物1010个或个或2020个在不个在不同的药液浓度中养殖，同的药液浓度中养殖，10d10d能全部存活的药液浓度极为能全部存活的药液浓度极为该渔药的安全浓度。该渔药的安全浓度。3.3.特伦堡
23、（特伦堡（TumbellTumbell）公式）公式 4.Pichering4.Pichering等方法等方法 通过试验得出该渔药对实验动物通过试验得出该渔药对实验动物的最高允许浓度（的最高允许浓度（MATCMATC），然后除以），然后除以96h96h的的LC50LC50，得出，得出其应用系数（其应用系数（AFAF），带入下公式求出安全浓度：），带入下公式求出安全浓度：二、亚急性毒性试验二、亚急性毒性试验 亚急性毒性试验亚急性毒性试验：是为了观察受试动物在：是为了观察受试动物在较长的时间内（较长的时间内（一般在相当于一般在相当于1/101/10左右的左右的生命时间内生命时间内），少量多次地反复接
24、触受试），少量多次地反复接触受试渔药所引起的损害作用或产生的中毒作用。渔药所引起的损害作用或产生的中毒作用。亚急性毒性试验又称短期试验、亚慢性毒亚急性毒性试验又称短期试验、亚慢性毒性试验。性试验。亚急性毒性试验是评价渔药毒性重要和有亚急性毒性试验是评价渔药毒性重要和有效方法之一。效方法之一。进行亚急性毒性试验的进行亚急性毒性试验的目的目的：为了进一步了解受试渔药在受试动物体内有无为了进一步了解受试渔药在受试动物体内有无蓄积作用；蓄积作用；实验动物能否对受试渔药产生耐受性；实验动物能否对受试渔药产生耐受性；测定受试渔药毒性作用的靶器官和靶组织，初测定受试渔药毒性作用的靶器官和靶组织，初步估计出最
25、大无作用剂量及中毒阈剂量，步估计出最大无作用剂量及中毒阈剂量，并确定是否需要进行慢性毒性试验，为慢性毒并确定是否需要进行慢性毒性试验，为慢性毒性试验剂量的选择提供依据。性试验剂量的选择提供依据。亚急性毒性试验亚急性毒性试验常用的试验方法常用的试验方法有：有：1.1.细胞培养细胞培养 如敌百虫、六氯苯、汞、锌对细胞有丝分裂的如敌百虫、六氯苯、汞、锌对细胞有丝分裂的抑制作用；苯能引起细胞染色体损伤和畸变率抑制作用；苯能引起细胞染色体损伤和畸变率增高。测定培养细胞中增高。测定培养细胞中RNARNA的合成，可反应药液的合成，可反应药液或污染物对细胞的毒性作用。或污染物对细胞的毒性作用。2.2.组织病变
26、组织病变 如鱼类接触苯酚，可影响肝脏正常功能，使肝如鱼类接触苯酚，可影响肝脏正常功能，使肝组织空泡化；重金属能破坏鳃组织，使鳃丝上组织空泡化；重金属能破坏鳃组织，使鳃丝上皮肿胀，柱状细胞分解及坏死。皮肿胀，柱状细胞分解及坏死。3.3.生理生化等指标的测定生理生化等指标的测定 如锌能使鱼类血液中淋巴细胞数量减少；有如锌能使鱼类血液中淋巴细胞数量减少；有机磷农药和氨基甲酸酯农药对胆碱酯酶的活机磷农药和氨基甲酸酯农药对胆碱酯酶的活性有特异的抑制作用。性有特异的抑制作用。4.4.对鱼类呼吸活动影响对鱼类呼吸活动影响 一般是通过测定耗氧率、鳃盖活动频率或呼一般是通过测定耗氧率、鳃盖活动频率或呼吸率等指标
27、研究药物对鱼类呼吸活动影响。吸率等指标研究药物对鱼类呼吸活动影响。亚急性毒性的评价方法亚急性毒性的评价方法 是将试验数据汇总成表，进行相应的统是将试验数据汇总成表，进行相应的统计处理和分析，并根据中毒时出现的症计处理和分析，并根据中毒时出现的症状，以及停药后组织和功能损害的发展状，以及停药后组织和功能损害的发展和恢复情况做出综合性评价。和恢复情况做出综合性评价。三、慢性毒性试验三、慢性毒性试验 慢性毒性试验慢性毒性试验：是指向受试动物反复多：是指向受试动物反复多次给药，次给药，连续给药超过连续给药超过90d90d，对水产动物，对水产动物而言，给药时间几乎占去生命周期的大而言，给药时间几乎占去生
28、命周期的大部分时间甚至终生。部分时间甚至终生。慢性毒性试验的目的是为了观察受试动物长期连慢性毒性试验的目的是为了观察受试动物长期连续接触药物对机体的影响。续接触药物对机体的影响。通过实验动物了解药物的毒性反应、剂量与毒性通过实验动物了解药物的毒性反应、剂量与毒性反应的关系、药物毒性的主要靶器官、毒性反应反应的关系、药物毒性的主要靶器官、毒性反应的性质和程度及可逆性等，动物的耐受量、无毒的性质和程度及可逆性等，动物的耐受量、无毒性反应的剂量、毒性反应的剂量及安全范围，毒性反应的剂量、毒性反应的剂量及安全范围，毒性产生时间、达峰时间、持续时间及可能反复产性产生时间、达峰时间、持续时间及可能反复产生
29、毒性反应的时间，有否迟发性毒性反应，有否生毒性反应的时间，有否迟发性毒性反应，有否蓄积性或耐受性等。蓄积性或耐受性等。总之，通过慢性毒性试验，可以了解短期试验所总之，通过慢性毒性试验，可以了解短期试验所不能测得的反应，从而可以确定最大无作用剂量。不能测得的反应，从而可以确定最大无作用剂量。慢性毒性试验的方法与亚急性毒性试验在慢性毒性试验的方法与亚急性毒性试验在试验设计、观察指标等方面基本相同。试验设计、观察指标等方面基本相同。慢性毒性试验一般是在急性毒性试验和亚慢性毒性试验一般是在急性毒性试验和亚急性毒性试验的基础上进行的，根据急性急性毒性试验的基础上进行的，根据急性和亚急性毒性试验数据设置试
30、验浓度。和亚急性毒性试验数据设置试验浓度。试验可从胚胎或鱼苗阶段开始，也可从性试验可从胚胎或鱼苗阶段开始，也可从性腺还未发育成熟的幼鱼开始，一直延续到腺还未发育成熟的幼鱼开始，一直延续到鱼的生长发育成熟，以至产卵孵化。鱼的生长发育成熟，以至产卵孵化。由于试验时间较长，一般需要使用流水装由于试验时间较长，一般需要使用流水装置，以保持药液浓度恒定和鱼类生存的良置，以保持药液浓度恒定和鱼类生存的良好条件。此外，还要注意食物、氧气、好条件。此外，还要注意食物、氧气、pHpH等适宜鱼类的生长条件；等适宜鱼类的生长条件；所得到的存活率、生长率、产卵率和孵化所得到的存活率、生长率、产卵率和孵化率等数据，采取
31、统计的方法进行处理，以率等数据，采取统计的方法进行处理，以此求出渔药对试验对象的最大允许浓度。此求出渔药对试验对象的最大允许浓度。除此之外，除此之外，检测鱼体内的蓄积检测鱼体内的蓄积也有较大的也有较大的价值。有些药物，不仅在试验的第一个生价值。有些药物，不仅在试验的第一个生活周期，而且持续三代仍可检出有蓄积的活周期，而且持续三代仍可检出有蓄积的现象，如现象，如甲基汞甲基汞在鱼体内迅速蓄积，第二在鱼体内迅速蓄积，第二代和第三代的鱼卵和胚胎中均有从亲鱼转代和第三代的鱼卵和胚胎中均有从亲鱼转移下来的大量汞残留。移下来的大量汞残留。由于慢性试验的周期较长，为了缩短周期，由于慢性试验的周期较长，为了缩短
32、周期，可寻可寻找成熟时间短的无脊椎动物作为试验对象找成熟时间短的无脊椎动物作为试验对象，还可，还可探索采用短期毒性试验的方法预测慢性毒性的可探索采用短期毒性试验的方法预测慢性毒性的可能性。能性。慢性毒性试验是毒理学研究中试验周期最长、困慢性毒性试验是毒理学研究中试验周期最长、困难最大、耗资最高、难以进行重复的试验，对于难最大、耗资最高、难以进行重复的试验，对于新药研究成功与否具有重要的作用。新药研究成功与否具有重要的作用。慢性毒性试验是临床前安全性评价的主要内容，慢性毒性试验是临床前安全性评价的主要内容，它还为临床安全用药的剂量设计以及毒副作用监它还为临床安全用药的剂量设计以及毒副作用监测提供
33、参考依据。测提供参考依据。四、特殊毒理学试验四、特殊毒理学试验 特殊毒理学试验特殊毒理学试验也称专门毒性试验，也称专门毒性试验，主要包括主要包括繁殖试验繁殖试验、致畸试验致畸试验、致突变试致突变试验验和和致癌试验致癌试验等。等。1.1.繁殖试验繁殖试验 是检验受试药物对实验动物生殖机能影响的是检验受试药物对实验动物生殖机能影响的一种方法。试验项目有一般生殖毒性试验一种方法。试验项目有一般生殖毒性试验（喂养致畸试验）、传统致畸试验和喂养繁（喂养致畸试验）、传统致畸试验和喂养繁殖试验。殖试验。在水产动物中还广泛应用在水产动物中还广泛应用胚胎毒性试验胚胎毒性试验。试验目的是为了了解药物对实验动物生殖
34、机试验目的是为了了解药物对实验动物生殖机能的影响以及胚胎毒性，并为致畸试验提供能的影响以及胚胎毒性，并为致畸试验提供资料。资料。实验动物为实验动物为小鼠或大鼠小鼠或大鼠，有时也用，有时也用兔兔。一。一般设计般设计3 3个药物剂量组和个药物剂量组和1 1个对照组。最高个对照组。最高剂量应产生轻度毒性反应；最低剂量为治剂量应产生轻度毒性反应；最低剂量为治疗有效剂量的疗有效剂量的2 23 3倍。给药途径与临床用倍。给药途径与临床用药相同。药相同。给药时间：一般生殖毒性试验为雄性交配给药时间：一般生殖毒性试验为雄性交配前前60d60d，雌性交配前，雌性交配前14d14d。繁殖试验为大鼠。繁殖试验为大鼠
35、断奶后开始饲喂受试药物，直到断奶后开始饲喂受试药物，直到90d90d。传统。传统致畸试验为胚胎器官形成期（致畸试验为胚胎器官形成期（7-15d7-15d）开始）开始饲喂受试药物。饲喂受试药物。胚胎毒性胚胎毒性，广而言之是渔药对动物胚胎产生，广而言之是渔药对动物胚胎产生的毒性作用。的毒性作用。如以鱼类作为试验对象，因鱼类胚胎在不同如以鱼类作为试验对象，因鱼类胚胎在不同发育阶段，对药物敏感性会有所不同。其毒发育阶段，对药物敏感性会有所不同。其毒性可以表现出胚胎死亡、胚胎发育迟缓、胚性可以表现出胚胎死亡、胚胎发育迟缓、胚胎畸形及胚胎功能不全等四个方面。胎畸形及胚胎功能不全等四个方面。试验用鱼卵要求对
36、受试药物比较敏感，并且试验用鱼卵要求对受试药物比较敏感，并且便于观察。便于观察。属于半漂浮性的鲢、鳙、草鱼、青鱼的鱼卵属于半漂浮性的鲢、鳙、草鱼、青鱼的鱼卵符合这个要求。符合这个要求。特别是特别是草鱼卵草鱼卵，其卵胚发育初期有明显的蓝，其卵胚发育初期有明显的蓝绿色、比鲢卵胚的淡蓝色（有的略呈淡灰色）绿色、比鲢卵胚的淡蓝色（有的略呈淡灰色）容易观察。容易观察。金鱼、圆尾斗鱼、食蚊鱼等小型观赏鱼类，金鱼、圆尾斗鱼、食蚊鱼等小型观赏鱼类，易于繁殖，便于取材，也可作为渔药毒性测易于繁殖，便于取材，也可作为渔药毒性测试的鱼卵。试的鱼卵。试验鱼数量可以视容器大小，鱼类品种而试验鱼数量可以视容器大小，鱼类品
37、种而定，一般为定，一般为20-10020-100个。个。为了便于观察胚胎发育，可采用透明的玻为了便于观察胚胎发育，可采用透明的玻璃皿，如培养皿、培养缸等作为试验容器，璃皿，如培养皿、培养缸等作为试验容器，但是以能盛溶液但是以能盛溶液200-500ml200-500ml的容器较好。去的容器较好。去用试验的鱼卵，必须首先确定它们是受精用试验的鱼卵，必须首先确定它们是受精卵，一般待发育过原肠中期时方开始毒性卵，一般待发育过原肠中期时方开始毒性试验。试验。胚胎毒性试验处理的方法有两种：胚胎毒性试验处理的方法有两种：一种是以受试药物处理一种是以受试药物处理亲鱼亲鱼，如对产卵的试，如对产卵的试验亲鱼每日定
38、时定量投喂含有一定量渔药的验亲鱼每日定时定量投喂含有一定量渔药的饵料，或者把亲鱼饲养于含有试验渔药的水饵料，或者把亲鱼饲养于含有试验渔药的水中，使其接触吸收药物，或者对亲鱼人工注中，使其接触吸收药物，或者对亲鱼人工注射一定剂量的药物，取其人工授精或自然受射一定剂量的药物，取其人工授精或自然受精的卵使用。精的卵使用。另一种是在正常的另一种是在正常的鱼卵鱼卵，将其直接放入含有，将其直接放入含有受试渔药的溶液中处理。受试渔药的溶液中处理。受试药物的浓度，一般根据受试药物的浓度，一般根据96h96h的的LDLD5050值值为为基础，按其比例递减的方式设计试验浓度，基础，按其比例递减的方式设计试验浓度，
39、但是必须包括鱼卵全部死亡的最小浓度但是必须包括鱼卵全部死亡的最小浓度（LCLC100100）与鱼卵全部存活的最大毒物浓度）与鱼卵全部存活的最大毒物浓度（LCLC0 0），以便能获得半数忍受限、开始致），以便能获得半数忍受限、开始致死浓度及阈浓度等。死浓度及阈浓度等。2.2.致畸试验致畸试验 致畸试验是为了了解受试药物是否致畸试验是为了了解受试药物是否通过母体通过母体对对胚胎发育过程胚胎发育过程(主要是胚胎的器官分化过程主要是胚胎的器官分化过程)产产生不利影响。生不利影响。对鱼类的致畸试验可以利用亲鱼和受精卵进行。对鱼类的致畸试验可以利用亲鱼和受精卵进行。胚胎畸形是观察指标之一。胚胎畸形是观察指
40、标之一。其其致畸原致畸原(teratogens(teratogens)可以从两个方面分析。可以从两个方面分析。一是来自一是来自亲鱼母体亲鱼母体，由于通过母体的血液循环传递至，由于通过母体的血液循环传递至生殖腺，如敌百虫、敌敌畏等许多药物就易于在母体生殖腺，如敌百虫、敌敌畏等许多药物就易于在母体的生殖腺内积累，经卵母细胞的二次成熟分裂，脱离的生殖腺内积累，经卵母细胞的二次成熟分裂，脱离滤泡排卵，产卵受精直至孵化，于卵黄囊吸收阶段方滤泡排卵，产卵受精直至孵化，于卵黄囊吸收阶段方显示出较强的毒性，出现畸形胚胎，导致发育迟缓，显示出较强的毒性，出现畸形胚胎，导致发育迟缓，功能不全以致死亡。功能不全以致
41、死亡。另一方面，由于另一方面，由于受精卵受精卵直接接触外来药物。尤其以卵直接接触外来药物。尤其以卵胚的早期发育阶段，特别是在囊胚期之前，极易引起胚的早期发育阶段，特别是在囊胚期之前，极易引起畸形的现象。畸形的现象。对对哺乳动物哺乳动物具有致畸性的有毒物质能引起具有致畸性的有毒物质能引起胎儿非致死性的组织或机能变化，例如导胎儿非致死性的组织或机能变化，例如导致腭裂、并趾、骨化延缓、肋畸形、肾发致腭裂、并趾、骨化延缓、肋畸形、肾发育不全、畸形足等仔胎畸形。育不全、畸形足等仔胎畸形。致畸试验是在胚胎细胞分化和胎儿组织形成致畸试验是在胚胎细胞分化和胎儿组织形成期给受孕动物饲喂受试药物，然后在分娩期期给
42、受孕动物饲喂受试药物，然后在分娩期观察仔胎是否出现畸形以判定受试药物的毒观察仔胎是否出现畸形以判定受试药物的毒性。性。过早地给予受试药物可能会影响受精卵的着过早地给予受试药物可能会影响受精卵的着床过程，此时胚胎对致畸物的反应往往不敏床过程，此时胚胎对致畸物的反应往往不敏感，过迟给予受试药物，则胚胎发育基本成感，过迟给予受试药物，则胚胎发育基本成熟，致畸作用就可能不会显示出来。熟，致畸作用就可能不会显示出来。实验动物常用实验动物常用小鼠小鼠、大鼠大鼠和和兔兔。剂量分组方法与慢性毒性试验相同，至少应用剂量分组方法与慢性毒性试验相同，至少应用3 3种剂量。一般以最大无作用剂量用于高剂量种剂量。一般以
43、最大无作用剂量用于高剂量组，以其组，以其1 13030左右的剂量用于低剂量组。左右的剂量用于低剂量组。一般小鼠与大鼠于妊娠一般小鼠与大鼠于妊娠6-15d6-15d，兔于妊娠，兔于妊娠6-18d6-18d饲喂受试药物，至妊娠结束前饲喂受试药物，至妊娠结束前1-2d1-2d，以手术方，以手术方法从母体内取出胎儿，检查每个活胎有无外观法从母体内取出胎儿，检查每个活胎有无外观畸形，并进行特殊的固定或染色以检查胎儿脏、畸形，并进行特殊的固定或染色以检查胎儿脏、脑部及骨骼畸形等。脑部及骨骼畸形等。根据各组动物畸胎出现的数量及所产活胎总数，根据各组动物畸胎出现的数量及所产活胎总数，计算计算畸胎发生率畸胎发生
44、率。经统计处理后求出最小致畸。经统计处理后求出最小致畸剂量，并以致畸指数比较不同毒物的致畸强度。剂量，并以致畸指数比较不同毒物的致畸强度。致畸指数致畸指数=A=AB B 式中式中A A母体的母体的LD50LD50 B B最小致畸剂量。最小致畸剂量。一般认为致畸指数在一般认为致畸指数在1010以下的毒物为非致畸物，以下的毒物为非致畸物，10-10010-100者为致畸物；者为致畸物；100100者为强致畸物。者为强致畸物。3.3.致突变试验致突变试验 致突变毒性是指生物细胞的遗传物质出现致突变毒性是指生物细胞的遗传物质出现可被察觉并可遗传的变化，它包括可被察觉并可遗传的变化，它包括基因突基因突变
45、变和和染色体畸变染色体畸变。致突变试验的项目包括致突变试验的项目包括 1 1）微生物回复突变试验、）微生物回复突变试验、2 2）哺乳动物培养细胞染色体畸变试验）哺乳动物培养细胞染色体畸变试验 3 3）微核试验）微核试验1 1）微生物回复突变试验（）微生物回复突变试验（AmesAmes试验）试验）所用微生物为所用微生物为组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌的的TA97TA97、TA98TA98、TAl00TAl00、TAl02TAl02，或大肠杆菌或大肠杆菌WP2WP2的的若干株。上述若干株。上述4 4株鼠伤寒沙门氏菌常用。株鼠伤寒沙门氏菌常用。应在加肝微粒体酶应在加肝微粒体酶(
46、S9)(S9)混合物和不加混合物和不加S9S9的平行条的平行条件下实验，受试动物至少件下实验，受试动物至少5 5个不同剂量，另设阴个不同剂量，另设阴性对照组和阳性对照组。性对照组和阳性对照组。最大剂量可达每皿最大剂量可达每皿5.0 mg5.0 mg，最小剂量不得小于有，最小剂量不得小于有效浓度和药量。效浓度和药量。2 2）哺乳动物培养细胞染色体畸变试验）哺乳动物培养细胞染色体畸变试验 用用哺乳动物原代或传代培养细胞哺乳动物原代或传代培养细胞进行。进行。设设3 3个以上受试药物组，个以上受试药物组，1 1个阴性对照组，个阴性对照组，1 1个个阳性对照组。阳性对照组。最大剂量应以最大剂量应以50%
47、50%细胞生长抑制浓度为准，最细胞生长抑制浓度为准，最低剂量不得小于有效治疗剂量的低剂量不得小于有效治疗剂量的2 23 3倍。倍。3 3）微核试验）微核试验 用用性成熟的小鼠性成熟的小鼠进行。进行。最少设最少设3 3个受试药物剂量组，个受试药物剂量组，1 1个阴性和个阴性和1 1个阳个阳性对照组。性对照组。最大剂量应以最大剂量应以1 12LD2LD5050为准，最小剂量不得小为准，最小剂量不得小于治疗有效剂量的于治疗有效剂量的2 23 3倍。倍。以上以上3 3种试验均应按规定的方法作结果判定。阳种试验均应按规定的方法作结果判定。阳性对照药物应获得阳性结果，溶剂对照的阴性组性对照药物应获得阳性结
48、果，溶剂对照的阴性组应获得阴性结果。否则结果无效；应重新试验。应获得阴性结果。否则结果无效；应重新试验。根据农业部有关根据农业部有关新兽药特殊毒性试验技术要求新兽药特殊毒性试验技术要求规定，致突变试验必须至少做三项试验，其中规定，致突变试验必须至少做三项试验，其中AmesAmes试验和微核试验为必做项目，精子致畸、睾试验和微核试验为必做项目，精子致畸、睾丸精原细胞染色体畸变、显性致死突变试验三项丸精原细胞染色体畸变、显性致死突变试验三项可任选一项，如果前二者任何一项为阳性，均必可任选一项，如果前二者任何一项为阳性，均必做显性致死突变试验。做显性致死突变试验。致癌试验较为复杂，国内因受条件限制，
49、新兽药致癌试验较为复杂，国内因受条件限制，新兽药的特殊毒性试验中暂未列入。的特殊毒性试验中暂未列入。4.4.致癌试验致癌试验 对于化学结构与致癌有关，致突变试验为阳对于化学结构与致癌有关，致突变试验为阳性，或毒性试验提示有可能致癌的药物，必性，或毒性试验提示有可能致癌的药物，必须进行致癌试验。须进行致癌试验。选择实验动物应根据动物对某种受试药物致选择实验动物应根据动物对某种受试药物致癌作用反应的敏感性决定。癌作用反应的敏感性决定。大大鼠鼠或或小鼠小鼠对多种致癌物的反应较敏感，故对多种致癌物的反应较敏感，故致癌试验一般多选用大鼠或小鼠，有时还需致癌试验一般多选用大鼠或小鼠，有时还需要增加一种非啮
50、齿类动物如犬和猴。要增加一种非啮齿类动物如犬和猴。此外，根据试验要求，也可选用其他动物，如雏鸭此外，根据试验要求，也可选用其他动物，如雏鸭对黄曲霉毒素诱发肝癌的作用较敏感，鸡对致食管对黄曲霉毒素诱发肝癌的作用较敏感，鸡对致食管癌因子较为敏感。癌因子较为敏感。选择动物时，应对所选动物的肿瘤自然发生率有所选择动物时，应对所选动物的肿瘤自然发生率有所了解。了解。由于本实验持续时间较长，为使实验动物的肿瘤发由于本实验持续时间较长，为使实验动物的肿瘤发生率与对照组相比具有明显的显著的差异，并考虑生率与对照组相比具有明显的显著的差异，并考虑到试验中途动物可能发生死亡等因素，到试验中途动物可能发生死亡等因素
