1、 第一节第一节 结晶技术概述结晶技术概述一、结晶的概念一、结晶的概念1.1 概念概念n结晶是从液相或气相中产生形状一定、分子（或原子、结晶是从液相或气相中产生形状一定、分子（或原子、离子）有规则排列的晶体的现象。离子）有规则排列的晶体的现象。n结晶可以从液相或汽相中生成，但工业结晶操作主要是结晶可以从液相或汽相中生成，但工业结晶操作主要是以液体原料为对象。改变溶液的某些条件，使溶液中的以液体原料为对象。改变溶液的某些条件，使溶液中的溶质分子有规则排列并以结晶态析出的过程称作结晶。溶质分子有规则排列并以结晶态析出的过程称作结晶。n有时把有时把析出的晶体析出的晶体称作结晶。称作结晶。n晶体的化学成
2、分均一，具有各种对称的形状，离子和分晶体的化学成分均一，具有各种对称的形状，离子和分子在空间晶格的结点上呈规则排列。子在空间晶格的结点上呈规则排列。固体有结晶结晶和无定形无定形两种状态。n相同点相同点：都是新相生成的过程，是利用溶质之间溶解度的差别都是新相生成的过程，是利用溶质之间溶解度的差别进行分离纯化的一种扩散分离操作。进行分离纯化的一种扩散分离操作。n区别区别：结晶是内部结构的质点元做三维有序规则排列、形结晶是内部结构的质点元做三维有序规则排列、形状一定的固体粒子。而沉淀则是无规则排列的、无定状一定的固体粒子。而沉淀则是无规则排列的、无定型粒子。型粒子。结晶的纯度远高于沉淀，结晶的形成需
3、在严密控制结晶的纯度远高于沉淀，结晶的形成需在严密控制的操作条件下进行。的操作条件下进行。1.2 1.2 结晶与沉淀的比较结晶与沉淀的比较 AFMAFM下的抗生素晶体下的抗生素晶体 AFMAFM下的抗生素晶体层下的抗生素晶体层 谷氨酸结晶谷氨酸结晶n结晶是溶质自动从过饱和溶液中析出，形成新相的过程。n结晶过程是一个表面化学反应过程。n这一过程不仅包括溶质分子凝聚成固体，还包括这些分子有规律地排列在一定晶格中，过程与表面分子化学键力变化有关。1.3 1.3 结晶过程的实质结晶过程的实质n结晶是一种历史悠久的分离技术，5000年前中国人已开始利用结晶原理制造食盐。广泛用于化学工业，在氨基酸、有机酸
4、、抗生素生产过程中已成为重要的分离纯化手段。n大多数固体产品都是以结晶的形式出售的，因此，在产品的制造过程中一般都要利用结晶技术。1.4 1.4 结晶历史和应用结晶历史和应用对生化制药来说1、结晶是一种纯化手段；纯化手段；2、是一种固化手段固化手段(从溶液中取得固体溶质）；3、分子呈规则性排列的晶体是生物活性物质高级结构以及结构与功能关系的研究材料研究材料。结晶在生化制药中的重要意义结晶在生化制药中的重要意义n结晶理论是通过无机盐的结晶现象研究发展起来的，其基本原理也适用于生物产物的结晶，但生物大分子的结晶和简单无机盐的结晶并非完全相同，生物大分子的结晶要比小分子结晶生物大分子的结晶要比小分子
5、结晶困难。困难。1.5 1.5 生物大分子结晶特点生物大分子结晶特点（1）生物大分子的运动和规则排列要比小分子物质困难得多，）生物大分子的运动和规则排列要比小分子物质困难得多，需要的时间和能量也较多。需要的时间和能量也较多。n多糖、蛋白质、酶和核酸等由于分子量大，结构复杂，不易定向聚集。生物大分子都是由相同或相似的小分子“单体”缩合而成。如蛋白质和酶由20种氨基酸通过肽键组成，多糖类由一种或数种单糖通过糖苷键组成，两大类核酸由4种核苷酸通过磷酸二酯键连接而成。n要求：要求：一方面溶液条件的变化不宜太快、太剧烈，另一方一方面溶液条件的变化不宜太快、太剧烈，另一方面在分子有序排列十分困难时还要提供
6、结晶的面在分子有序排列十分困难时还要提供结晶的“模板模板”即即晶种。晶种。（2）生物大分子具有形成晶体的能力，但这种能力与大分）生物大分子具有形成晶体的能力，但这种能力与大分子结构和外形有很大关系。子结构和外形有很大关系。n一般来说，支链较少、对称的分子比支链多、不对称的分一般来说，支链较少、对称的分子比支链多、不对称的分子容易结晶；子容易结晶；n分子量小，易结晶。分子量越大越难结晶，分子量小，易结晶。分子量越大越难结晶，n例如大多数球蛋白和酶蛋白比较容易结晶，一些大小均匀例如大多数球蛋白和酶蛋白比较容易结晶，一些大小均匀的病毒特别是植物球状病毒，也比较容易得到结晶，高度的病毒特别是植物球状病
7、毒，也比较容易得到结晶，高度不对称的核酸大分子，与蛋白质相比则较难结晶不对称的核酸大分子，与蛋白质相比则较难结晶(在一定在一定条件下，小心操作，也可获得一定结晶度的固体条件下，小心操作，也可获得一定结晶度的固体)。n还有一些结构复杂，不对称的核酸、蛋白质和多糖类，迄还有一些结构复杂，不对称的核酸、蛋白质和多糖类，迄今仍未能获得晶体。今仍未能获得晶体。（3）生物大分子的晶体常含有结晶水。）生物大分子的晶体常含有结晶水。n如许多蛋白质和酶的结晶水含量常达10%50%。麻仁蛋白、溶菌酶的晶体水分分别占晶体重量39.2%和48%，而原肌球蛋白的长角片晶中水占总重90%，可见水在蛋白质晶体中占的比重相当
8、大。（4）生物大分子有共晶现象存在。）生物大分子有共晶现象存在。n如猪糜胰蛋白酶的共结晶体。它是我国生物化学家戚正武首先报道的。猪糜蛋白酶与猪胰蛋白酶的混格晶体分子比为3：2。多次重结晶不能将二者分开。二、结晶操作的特点二、结晶操作的特点（1 1）只有同类分子或离子才能排列成晶体，因此结晶）只有同类分子或离子才能排列成晶体，因此结晶过程有良好的过程有良好的选择性。选择性。（2 2）通过结晶，溶液中大部分的杂质会留在母液中，）通过结晶，溶液中大部分的杂质会留在母液中，再通过过滤、洗涤，可以得到再通过过滤、洗涤，可以得到纯度较高的晶体。纯度较高的晶体。（3 3）结晶过程具有成本低、设备简单、操作方
9、便等特）结晶过程具有成本低、设备简单、操作方便等特点，广泛应用于氨基酸、有机酸、抗生素、维生素、点，广泛应用于氨基酸、有机酸、抗生素、维生素、核酸等产品的精制。核酸等产品的精制。三、结晶基本原理三、结晶基本原理(结晶过程结晶过程)3.1 溶解度、饱和溶液、过饱和溶液溶解度、饱和溶液、过饱和溶液 向恒温溶剂(如水)中加入溶解性固体溶质，溶质在溶剂中发生溶解现象，溶剂中溶质的浓度不断上升。如果固体溶质的加入量与溶剂相比足够多，一定时间后，溶剂中溶质的浓度不再升高，溶质在固液之间达到平衡状态。此时溶液中的溶质浓度称为该溶质的溶解度溶解度(solubility)或饱和浓度饱和浓度。该溶液称为该溶质的饱
10、和溶液。饱和溶液：饱和溶液：当溶液中溶质浓度等于该溶质在同等条件下当溶液中溶质浓度等于该溶质在同等条件下的饱和溶解度时，该溶液称为饱和溶液。的饱和溶解度时，该溶液称为饱和溶液。过饱和溶液：过饱和溶液：溶质浓度超过饱和溶解度时，该溶液称之溶质浓度超过饱和溶解度时，该溶液称之为过饱和溶液。为过饱和溶液。n溶解度是温度的函数。溶解度是温度的函数。n一般在说某物质在特定溶剂中的溶解度时，并不是给出一般在说某物质在特定溶剂中的溶解度时，并不是给出一个数值，而是给出一系列数值，这系列数值用一条曲一个数值，而是给出一系列数值，这系列数值用一条曲线来表示，即温度线来表示，即温度-溶解度曲线，又叫溶解度曲线，又
11、叫饱和曲线饱和曲线。n大多数物质的溶解度随温度的升高显著增大，也有一些大多数物质的溶解度随温度的升高显著增大，也有一些物质的溶解度对温度的变化不敏感，少数物质物质的溶解度对温度的变化不敏感，少数物质(如螺旋霉如螺旋霉素素)的溶解度随温度升高而显著下降。的溶解度随温度升高而显著下降。n以上溶解度情况是指以上溶解度情况是指大颗粒晶体即普通晶体溶质的饱和大颗粒晶体即普通晶体溶质的饱和浓度。浓度。从热力学理论可知，与微小液滴的饱和蒸汽压从热力学理论可知，与微小液滴的饱和蒸汽压高于正常液体的饱和蒸汽压等现象的原理一样。高于正常液体的饱和蒸汽压等现象的原理一样。微小晶体的溶解度高于普遍大颗粒晶体的溶解微小
12、晶体的溶解度高于普遍大颗粒晶体的溶解度。度。lncs/c=2Vm/RTrc式1 Cs-半径为rc小晶体的溶解度；C-普通晶体的溶解度-晶体与溶液间的表面张力；结晶界面张力 rc-小晶体的半径；R-气体常数；T-绝对温度 Vm晶体的摩尔体积这一现象可用下述热力学公式表达：这一现象可用下述热力学公式表达：微小晶体的半径越小，溶解度越大。微小晶体的半径越小，溶解度越大。这一热力学现象已被许多实验结果所证实。例如，粒径为0.3m的Ag2CrO4，晶体比普遍晶体的溶解度高10%。粒径为0.1m的BaSO4，晶体比普遍晶体的溶解度高80%。溶质只有在过饱和溶液中才能析出；但溶质只有在过饱和溶液中才能析出；
13、但并非在任何过饱和溶液都会结晶。并非在任何过饱和溶液都会结晶。n那么，过饱和溶液达到什么程度才会出那么，过饱和溶液达到什么程度才会出现结晶呢？现结晶呢？溶液过饱和的程度用过饱和度过饱和度表示设过饱和度=cs/c 式式2 又称过饱和系数。又称过饱和系数。根据式(1)lnc/c=2Vm/RTrc可以推导出rc=2Vm/Rtln 式式3式3表示与某一过饱和溶液呈相平衡的微小晶体半径，为此呈相平衡的微小晶体半径，为此过饱和度下的过饱和度下的临界晶体半径临界晶体半径。越大，对应的越大，对应的rc越小越小。由式3知，即使因溶质分子的碰撞有微小晶体析出，如果晶体半径rcs，即该微小晶体会自动溶解。换句话说，
14、虽然此时溶质的浓度对普通晶体是过饱和的(ccs)，但对于半径为r(rc)的微小晶体仍是不饱和的。宏观上表现为晶体并未形成。宏观上表现为晶体并未形成。由由rc=2Vm/Rtln可看出，可看出，rc随随的增大而降低。的增大而降低。临界晶体半径临界晶体半径rc表示：表示：在某一饱和度下，在某一饱和度下，rrc的晶体溶解度小于的晶体溶解度小于cs，自动生长。，自动生长。纯净的过饱和溶液可维持在一定的过饱和度范围纯净的过饱和溶液可维持在一定的过饱和度范围内（过饱和度不够大时）无结晶析出。内（过饱和度不够大时）无结晶析出。这种在一定过饱和度范围内维持无结晶析出的状这种在一定过饱和度范围内维持无结晶析出的状
15、态称为介稳状态或亚稳状态。态称为介稳状态或亚稳状态。但是，如果向其中加入颗粒半径大于但是，如果向其中加入颗粒半径大于rc的晶体，的晶体，晶体就会自动生长，直至到其半径与溶质浓度之晶体就会自动生长，直至到其半径与溶质浓度之间符合式间符合式(1)为止。为止。n由于由于rc随随的增大而降低，当的增大而降低，当足够大时，足够大时，rc已非常已非常微小，此时溶质分子微小，此时溶质分子(原子、离子原子、离子)会合的机率又大会合的机率又大大增加，分子间的碰撞极易形成半径大于大增加，分子间的碰撞极易形成半径大于rc的微小的微小晶体。晶体。n即当过饱和度达到一定程度时，极易形成很多微小即当过饱和度达到一定程度时
16、，极易形成很多微小晶体。晶体。n当当超过某一特定值时，过饱和溶液中就会自发形超过某一特定值时，过饱和溶液中就会自发形成大量晶核，这种现象称为成核成大量晶核，这种现象称为成核。n这一特定浓度值与温度之间的关系表示在曲线图上这一特定浓度值与温度之间的关系表示在曲线图上即为超溶解度曲线，或称第二超溶解度曲线。即为超溶解度曲线，或称第二超溶解度曲线。图图2 2 过饱和与超溶解度曲线过饱和与超溶解度曲线A A一稳定区；一稳定区；B B一第一介稳区；一第一介稳区；C C一第二介稳区；一第二介稳区；D D不稳区不稳区l l一溶解度曲线；一溶解度曲线；2 2一第一超溶解度曲线；一第一超溶解度曲线；3 3一第二
17、超溶解度曲线一第二超溶解度曲线 第二超溶解度曲线与溶解度曲线之间的区域称为第二超溶解度曲线与溶解度曲线之间的区域称为介稳区或介稳区或亚稳区亚稳区，第二超溶解度曲线以上的区域能够自发成核，称，第二超溶解度曲线以上的区域能够自发成核，称为为不稳区不稳区(1iable zone)。在介稳区又存在一定的过饱和浓度，在该浓度以下极难自在介稳区又存在一定的过饱和浓度，在该浓度以下极难自发形成结晶，这一浓度与温度之间的关系表示在图发形成结晶，这一浓度与温度之间的关系表示在图2上即上即为第一超溶解度曲线。为第一超溶解度曲线。因此介稳区又分两部分：即第一超溶解度曲线与溶解度曲因此介稳区又分两部分：即第一超溶解度
18、曲线与溶解度曲线之间的线之间的第一介稳区第一介稳区；第二超溶解度曲线与第一超溶解度；第二超溶解度曲线与第一超溶解度曲线之间的曲线之间的第二介稳区第二介稳区。必须指出，第一和第二超溶解度曲线并非严格的热力学平必须指出，第一和第二超溶解度曲线并非严格的热力学平衡曲线。除热力学因素衡曲线。除热力学因素式式(1)外，还受实验条件的影响，外，还受实验条件的影响，如搅拌强度、冷却或蒸发速度以及溶液纯度等。如搅拌强度、冷却或蒸发速度以及溶液纯度等。在图在图2所示的各个区域内的结晶现象可归纳如下：所示的各个区域内的结晶现象可归纳如下：A：稳定区，即不饱和区。：稳定区，即不饱和区。在该区域任意一点溶液均是稳在该
19、区域任意一点溶液均是稳定的；在此区域内即使有晶体存在也会自动溶解；定的；在此区域内即使有晶体存在也会自动溶解；在曲线在曲线1和曲线和曲线3之间的区域为亚稳定区，此刻如不采取一之间的区域为亚稳定区，此刻如不采取一定的手段（如加入晶核），溶液可长时间保持稳定；加入定的手段（如加入晶核），溶液可长时间保持稳定；加入晶核后，溶质在晶核周围聚集、排列，溶质浓度降低，并晶核后，溶质在晶核周围聚集、排列，溶质浓度降低，并降至曲线降至曲线1；介于饱和溶解度曲线和过饱和溶解度曲线之间的区域，可介于饱和溶解度曲线和过饱和溶解度曲线之间的区域，可以进一步划分刺激结晶区和养晶区。以进一步划分刺激结晶区和养晶区。B：第
20、一介稳区，即第一过饱和区。：第一介稳区，即第一过饱和区。在此区域内不会自发在此区域内不会自发成核，但当加入结晶颗粒时，结晶会生长，但不会产生新成核，但当加入结晶颗粒时，结晶会生长，但不会产生新晶核。这种加入的结晶颗粒称为晶种晶核。这种加入的结晶颗粒称为晶种(seed crystals)。C：第二介稳区，即第二过饱和区，：第二介稳区，即第二过饱和区，在此区域内也不会自发在此区域内也不会自发成核，但加入晶种后，在结晶生长的同时会有新晶核产生。成核，但加入晶种后，在结晶生长的同时会有新晶核产生。在曲线在曲线3的上半部的区域称为不稳定区，在该区域任意一点的上半部的区域称为不稳定区，在该区域任意一点溶液
21、均能自发形成结晶，溶液中溶质浓度迅速降低至曲线溶液均能自发形成结晶，溶液中溶质浓度迅速降低至曲线1（饱和）；（饱和）；D：不稳区：不稳区，是自发成核区域，瞬时出现大量微小晶核，发，是自发成核区域，瞬时出现大量微小晶核，发生晶核泛滥。生晶核泛滥。在不稳区内自发成核，造成晶核泛滥，形成大量微小结晶，在不稳区内自发成核，造成晶核泛滥，形成大量微小结晶，产品质量难于控制，并且结晶的过滤或离心回收困难。产品质量难于控制，并且结晶的过滤或离心回收困难。因此，工业结晶操作均在介稳区内进行，其中主要是第一介因此，工业结晶操作均在介稳区内进行，其中主要是第一介稳区。稳区。这样，介稳区的宽度数据对工业结晶操作的设
22、计尤为重要。介稳区的宽度常用图所示的最大过饱和浓度cmax或最大过饱和温度(过冷温度)Tmax表示，两者的关系为：Cmax=dcs/dTTmaxn介稳区宽度的测定介稳区宽度的测定常常是结晶操作设计的第一步。常常是结晶操作设计的第一步。n其方法通常是在一定搅拌速度下缓慢冷却或蒸发不其方法通常是在一定搅拌速度下缓慢冷却或蒸发不饱和溶液，在过饱和区域内检测晶核出现的过饱和饱和溶液，在过饱和区域内检测晶核出现的过饱和温度或浓度。温度或浓度。n不稳区晶体生长速度快，晶体尚未长大，溶质浓度不稳区晶体生长速度快，晶体尚未长大，溶质浓度便降至饱和溶解度，此时已形成大量的细小结晶，便降至饱和溶解度，此时已形成大
23、量的细小结晶，晶体质量差；晶体质量差；n因此，工业生产中通常采用加入晶种，并将溶质浓因此，工业生产中通常采用加入晶种，并将溶质浓度控制在养晶区，以利于大而整齐的晶体形成。度控制在养晶区，以利于大而整齐的晶体形成。四、结晶的步骤四、结晶的步骤n过饱和溶液的形成过饱和溶液的形成n晶核的形成晶核的形成n晶体生长晶体生长其中，溶液达到过饱和状态是结晶的前溶液达到过饱和状态是结晶的前提；过饱和度是结晶的推动力。提；过饱和度是结晶的推动力。4.1 过饱和溶液的形成过饱和溶液的形成结晶既然是过饱和的溶质分子规则排列的过程，结晶既然是过饱和的溶质分子规则排列的过程，所以必须为待结晶的溶液创造一个从不饱和到所以
24、必须为待结晶的溶液创造一个从不饱和到过饱和的变化条件。过饱和的变化条件。从式rc=2Vm/RTln可知，在一定的过饱和度下存在临界晶体半径rc，半径大于rc的晶体生长，而半径小于rc的晶体溶解消失。晶核晶核：理论上通常将半径为理论上通常将半径为rc的结晶微粒定义为晶核的结晶微粒定义为晶核胚种胚种：半径小于半径小于rc的结晶微粒称为胚种。的结晶微粒称为胚种。根据晶核的产生机理不同分为根据晶核的产生机理不同分为初级成核和二次成核；初级成核和二次成核；其中初级成核又分为其中初级成核又分为均相成核和非均相成核。均相成核和非均相成核。4.2 晶核的形成晶核的形成（1）初级成核指过饱和溶液中的自发成核现象
25、。）初级成核指过饱和溶液中的自发成核现象。均相成核：在没有外来表面的均相溶液中。非均相成核：在有外来表面的溶液中成核。（2）发生区域：不稳定区）发生区域：不稳定区（D区）区）从rc=2Vm/RTln可知，rc越小越容易自发成核。因此，初级成核在不稳区内发生。无需晶种存在无需晶种存在（3）发生机理）发生机理 胚种及溶质分子相互碰撞的结果。胚种及溶质分子相互碰撞的结果。初级成核初级成核（1）概念：向介稳态过饱和溶液中加入晶种，会有新晶核产）概念：向介稳态过饱和溶液中加入晶种，会有新晶核产生，叫二次成核。生，叫二次成核。n在过饱和度较小的介稳区内不能发生初级成核。但如果向介在过饱和度较小的介稳区内不
26、能发生初级成核。但如果向介稳态过饱和溶液中加入晶种，就会有新的晶核产生。稳态过饱和溶液中加入晶种，就会有新的晶核产生。n工业结晶操作均在工业结晶操作均在晶种的存在晶种的存在下进行。下进行。n因此，工业结晶的成核现象通常为二次成核。因此，工业结晶的成核现象通常为二次成核。（2）二次成核的机理）二次成核的机理 尚不十分清楚尚不十分清楚n一般认为：在有晶体存在的悬浮液中，附着在晶体上的微小一般认为：在有晶体存在的悬浮液中，附着在晶体上的微小晶体或会合分子受到流体流动的剪切作用，以及晶体之间的晶体或会合分子受到流体流动的剪切作用，以及晶体之间的相互碰撞和晶体与器壁的相互碰撞而脱离晶体，形成新的晶相互碰
27、撞和晶体与器壁的相互碰撞而脱离晶体，形成新的晶核。核。剪切力成核和接触成核。剪切力成核和接触成核。（3）二次成核速率：单位时间内在单位体积溶液中生成新晶）二次成核速率：单位时间内在单位体积溶液中生成新晶核的数目核的数目。1、由于这些脱离的微小结晶或会合分子必须大于相应过饱和、由于这些脱离的微小结晶或会合分子必须大于相应过饱和度下的热力学临界半径度下的热力学临界半径rc才能形成晶核，继续生长，因此，才能形成晶核，继续生长，因此，二次成核速率是过饱和度的函数。二次成核速率是过饱和度的函数。2、同时，、同时，微小晶体或会合分子脱离晶体的情况受微小晶体或会合分子脱离晶体的情况受结晶器内流结晶器内流体力
28、学性质和晶体悬浮密度的影响。体力学性质和晶体悬浮密度的影响。二次成核速率是决定二次成核速率是决定结晶产品粒度分布结晶产品粒度分布的首要动力学因素；的首要动力学因素；n成核速度大会导致细小晶体生成。因此，需要避免过量晶核成核速度大会导致细小晶体生成。因此，需要避免过量晶核的产生。的产生。n从热力学的角度，结晶操作中晶核不会消失，而是不断生长。从热力学的角度，结晶操作中晶核不会消失，而是不断生长。但在实际的过饱和溶液中，由于晶核之间相互会合，实际上但在实际的过饱和溶液中，由于晶核之间相互会合，实际上晶核数目是不断减少的。晶核数目是不断减少的。二次成核速率的影响因素二次成核速率的影响因素扩散传质（以
29、浓度差推动力）扩散传质（以浓度差推动力）晶体表面反应（晶格排列）晶体表面反应（晶格排列）两步串联过程两步串联过程（1 1）溶质通过扩散作用穿过靠近晶体表面的一个滞流层，）溶质通过扩散作用穿过靠近晶体表面的一个滞流层，从溶液中转移到晶体的表面；从溶液中转移到晶体的表面；（2 2）到达晶体表面的溶质长入晶面，使晶体增大，同时放）到达晶体表面的溶质长入晶面，使晶体增大，同时放出结晶热；出结晶热；（3 3）结晶热传递回到溶液中；）结晶热传递回到溶液中；根据以上扩散学说，溶质依靠分子扩散作用，穿过晶体根据以上扩散学说，溶质依靠分子扩散作用，穿过晶体表面的滞留层，到达晶体表面；此时扩散的推动力是液表面的滞
30、留层，到达晶体表面；此时扩散的推动力是液相主体的浓度与晶体表面浓度差；相主体的浓度与晶体表面浓度差；而第二步溶质长入晶面，则是表面化学反应过程，此时而第二步溶质长入晶面，则是表面化学反应过程，此时反应的推动力是晶体表面浓度与饱和浓度的差值。反应的推动力是晶体表面浓度与饱和浓度的差值。n溶液达到过饱和状态是结晶的前提；过饱和度溶液达到过饱和状态是结晶的前提；过饱和度是结晶的推动力。是结晶的推动力。（1）杂质）杂质n杂质改变晶体和溶液之间界面的滞留层特性，影响溶质长入晶体、改变晶体外形。n杂质吸附会导致晶体生长缓慢。杂质吸附会导致晶体生长缓慢。（2）搅拌：）搅拌：加速晶体生长、加速晶核的生成；（3
31、）温度：）温度：促进表面化学反应速度的提高，增加结晶速度；（1）自然起晶法）自然起晶法 将溶剂蒸发进入不稳定区形成晶核、当产生一定量的晶种后，加入稀溶液使溶液浓度降至亚稳定区，新的晶种不再产生，溶质在晶种表面生长。（2）刺激起晶法）刺激起晶法 将溶液蒸发至亚稳定区后，冷却，进入不稳定区，形成一定量的晶核，此时溶液的浓度会有所降低，进入并稳定在亚稳定的养晶区使晶体生长。（3）晶种起晶法）晶种起晶法 将溶液蒸发后冷却至亚稳定区的较低浓度，加入一定量和一定大小的晶种，使溶质在晶种表面生长。该方法容易控制、所得晶体形状大小均较理想，是一种常该方法容易控制、所得晶体形状大小均较理想，是一种常用的工业起晶
32、方法。用的工业起晶方法。经过一次粗结晶后，得到的晶体通常还会含有少量杂质。此时工业上常常需要采用重结晶的方式进行进一步精制。重结晶重结晶是利用杂质和结晶物质在不同溶剂和不同温度下的溶是利用杂质和结晶物质在不同溶剂和不同温度下的溶解度不同，将晶体用合适的溶剂再次结晶，以获得高纯度的解度不同，将晶体用合适的溶剂再次结晶，以获得高纯度的晶体的操作。晶体的操作。重结晶的操作过程重结晶的操作过程（1）选择合适的溶剂；）选择合适的溶剂；（2）将经过粗结晶的物质加入少量的热溶剂中，并使之溶解；）将经过粗结晶的物质加入少量的热溶剂中，并使之溶解；（3）冷却使之再次结晶；）冷却使之再次结晶；（4）分离母液；）分
33、离母液；（5）洗涤；）洗涤；（一）（一）浓度浓度结晶必须在超过饱和浓度时超过饱和浓度时才能实现，所以浓度是结晶的首要条件，一定要予以保证。浓度高，结晶收率也高，但浓度太高易生成无定形沉淀。若浓度偏低，则溶质的收率明显降低。对生物大分子而言，浓度控制在对生物大分子而言，浓度控制在3 35 5是比较适宜的。对小分子物是比较适宜的。对小分子物质如氨基酸浓度可适当增大。质如氨基酸浓度可适当增大。（二）（二）纯度纯度 大多数情况下，结晶是同种物质分子的有序堆砌。杂质分子的存在是结晶物质分子规则化排列的空间障碍。所以多数生物大分子需要相当的纯度才能进行结晶。不同的生化物质对结晶时纯度的要求差别很大，但总的
34、不同的生化物质对结晶时纯度的要求差别很大，但总的来说纯度高对结晶是有利的。一般希望结晶母液中目的来说纯度高对结晶是有利的。一般希望结晶母液中目的物的纯度接近或超过物的纯度接近或超过50。杂质浓度较高，对结晶过程的干扰会增大，导致不能结晶，即使结晶完成，也会因结晶体内部或表面混有较多杂质而增加以后纯化的手续。（三）（三）pH值值结晶与溶质的溶解度关系密切。一般说来，生物大分子在等电点附近溶解度低，一般说来，生物大分子在等电点附近溶解度低，有利于达到过饱和使晶体析出。有利于达到过饱和使晶体析出。但有时某些大分子带有少量的净电荷对结晶是有但有时某些大分子带有少量的净电荷对结晶是有利的，尤其是在希望得
35、到较大晶体时。利的，尤其是在希望得到较大晶体时。具体操作时要两方兼顾，灵活掌握，同时还要考虑目的物的稳定性。n结晶时溶剂系统的选择至关重要。好的溶剂能使结晶易于生成、结晶时溶剂系统的选择至关重要。好的溶剂能使结晶易于生成、长大，收率高，纯度也好。长大，收率高，纯度也好。选取溶剂的要求：选取溶剂的要求：溶剂对目的物应完全惰性，对其活力没有影响。溶剂对目的物应完全惰性，对其活力没有影响。对杂质的溶解能力大，使杂质的大多数在结晶完成时仍留在母对杂质的溶解能力大，使杂质的大多数在结晶完成时仍留在母液中。液中。对目的物有相当的溶解能力。溶剂对溶质的溶解度有足够大的对目的物有相当的溶解能力。溶剂对溶质的溶
36、解度有足够大的可调性可调性(如在改变温度，如在改变温度，pH、盐浓度或溶媒浓度时、盐浓度或溶媒浓度时)，既便于晶，既便于晶体的形成、生长，也能得到较高的收率。体的形成、生长，也能得到较高的收率。对于混合溶剂对于混合溶剂(如丙酮与水如丙酮与水)则要求成均相，且对溶质溶解度的则要求成均相，且对溶质溶解度的差异大。以便通过添加其中一种组分来调整溶质的饱和度。差异大。以便通过添加其中一种组分来调整溶质的饱和度。溶剂容易从结晶体上除去。就此而论，挥发性溶剂较好。溶剂容易从结晶体上除去。就此而论，挥发性溶剂较好。溶剂系统中某种无机离子的存在，有时对结晶有促进作用。溶剂系统中某种无机离子的存在，有时对结晶有
37、促进作用。（四）（四）溶剂环境溶剂环境 金属离子与结晶金属离子与结晶一些蛋白质或酶在某些金属离子存在时才表现活性，这类离子的存在往往促进结晶。如DNA聚合酶与Mg2+。也有一些金属离子只是单纯地促进结晶体的生成和长大，与其生物活性似乎没有必然的关系，其中有Ca2+、Zn2+、Mg2+、Co2+、Mn2+等离子。（五）（五）温度温度 从生物活性物质的稳定性而言，一般要求在较低的温度下结晶。这样不易变性失活。而且在许多场合，低温可使溶解度降低而有利于溶质的饱和。通常生物大分子的结晶温度多控制在通常生物大分子的结晶温度多控制在020范围内，对富范围内，对富含有机溶剂的结晶体系则要求更低的温度。含有机
38、溶剂的结晶体系则要求更低的温度。但也有某些酶，如猪糜胰蛋白酶，需要在稍高的温度但也有某些酶，如猪糜胰蛋白酶，需要在稍高的温度(25)下才能较好地析出晶体，这也许是结晶需要能量的缘故。下才能较好地析出晶体，这也许是结晶需要能量的缘故。另外，过低的温度使介质的粘度增加，对大分子的结晶干另外，过低的温度使介质的粘度增加，对大分子的结晶干扰较大。扰较大。（六）（六）时间和晶种时间和晶种 蛋白质等生物大分子因分子量大，立体结构复杂，其结晶过程远比小分子物质困难得多。为了有利于晶体的缓慢生为了有利于晶体的缓慢生长，得到足够多、足够大的结晶物，需要提供一定的结晶长，得到足够多、足够大的结晶物，需要提供一定的
39、结晶时间。时间。大分子的有序排列消耗能量较大，生物大分子的晶核生成大分子的有序排列消耗能量较大，生物大分子的晶核生成和晶体长大都比较缓慢，所以从不饱和到过饱和的调节过和晶体长大都比较缓慢，所以从不饱和到过饱和的调节过程须缓慢进行，以免溶质分子来不及形成晶核而以无定形程须缓慢进行，以免溶质分子来不及形成晶核而以无定形沉淀析出。沉淀析出。即使形成晶核，也会因晶核数量太多，造成晶粒过小。晶体小会导致表面积增大，吸附杂质增多，纯度下降。同时因晶体过小造成分离困难而降低收率。生物大分子的结晶时间差别很大，少则以时计，多则以月计。如早年用于如早年用于X射线衍射研究的胃蛋白酶晶体是用了几射线衍射研究的胃蛋白
40、酶晶体是用了几个月时间才制得的。个月时间才制得的。蛋白质、酶等生物大分子的晶体形状各异。有正六面体(胰岛素)、正八面体(溶菌酶)、菱形(猪糜胰蛋白酶)、针状(弹性蛋白酶)等等。有的蛋白质或酶因结晶条件不同能够形成两种以上的晶型(如溶菌酶)。对一些难以形成晶核的生物大分子，可以向母液中投入少量晶核，加速结晶，提高晶体质量。(一一)盐析结晶法盐析结晶法 这是生化制药中应用得最多的结晶方法。其作用是通过向这是生化制药中应用得最多的结晶方法。其作用是通过向结晶溶液中引入中性盐，逐渐降低溶质的溶解度使其过饱结晶溶液中引入中性盐，逐渐降低溶质的溶解度使其过饱和，经过一定时间后晶体形成并逐渐长大。和，经过一
41、定时间后晶体形成并逐渐长大。引入中性盐的方法主要有两种：引入中性盐的方法主要有两种：（1）向溶液中加入固体盐粉末）向溶液中加入固体盐粉末 在10下分批投入少量硫酸铵细末，边投边搅拌，直至溶液微浑。加盖，室温放置(1525)12天后便见细胞色素C的红色针状结晶体析出。再按每毫升0.02g的量投入硫酸铵粉，数天后结晶完全。（2）向溶液中加入饱和）向溶液中加入饱和盐溶液。盐溶液。这样做便于精确控制，不易造成局部过浓。效果较好。如在弹性蛋白酶结晶时，先将盐析得到的弹性酶沉淀以0.1mol/L pH8.0的碳酸缓冲液溶解，然后在搅拌下逐滴加入饱和硫酸铵溶液，直至微浑，4放置，慢慢形成针状结晶。以上两种方
42、法都是使溶质溶解度发生跳跃式的非连续下以上两种方法都是使溶质溶解度发生跳跃式的非连续下降，下降速度也较快。对一些结晶条件苛刻的蛋白质，降，下降速度也较快。对一些结晶条件苛刻的蛋白质，最好使溶解度的变化最好使溶解度的变化既连续、又缓慢既连续、又缓慢。（二）透析结晶法（二）透析结晶法 为达此目的，透析法最方便。为达此目的，透析法最方便。如糜胰蛋白酶的结晶。将硫酸铵盐析得到的沉淀溶于少如糜胰蛋白酶的结晶。将硫酸铵盐析得到的沉淀溶于少量水，再加入适量含量水，再加入适量含0.25饱和度硫酸铵的饱和度硫酸铵的0.16mol/L，pH6.0的磷酸缓冲液，装入透析袋，在室温下对含的磷酸缓冲液，装入透析袋，在室
43、温下对含0.275饱饱和度硫酸铵的相同磷酸缓冲液透析。每日换外透析液和度硫酸铵的相同磷酸缓冲液透析。每日换外透析液45次，次，12天后可见菱形猪糜胰蛋白酶晶体出现。天后可见菱形猪糜胰蛋白酶晶体出现。这种透析法又称这种透析法又称脱盐结晶法脱盐结晶法。透析法还可用在向结晶液缓慢输入某种离子的场合。如透析法还可用在向结晶液缓慢输入某种离子的场合。如牛胰蛋白酶结晶时，外透析液中有牛胰蛋白酶结晶时，外透析液中有Mg2+存在，它是牛胰存在，它是牛胰蛋白酶结晶的条件。蛋白酶结晶的条件。（三）有机溶剂结晶法（三）有机溶剂结晶法 向待结晶溶液中加入某种有机溶剂，其作用也是向待结晶溶液中加入某种有机溶剂，其作用也
44、是降低溶质的溶解度。降低溶质的溶解度。常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、甲醇、丁醇、异常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、甲醇、丁醇、异丙醇、乙腈、丙醇、乙腈、2，4-二甲基戊二醇二甲基戊二醇(MPO)等。等。（四）等电点结晶法（四）等电点结晶法 等电点结晶法即调整结晶溶液的等电点结晶法即调整结晶溶液的pH值至溶质值至溶质pI附近，降低附近，降低其溶解度，使结晶析出。其溶解度，使结晶析出。如溶菌酶水溶液如溶菌酶水溶液(浓度浓度35)调整调整pH9.510.0后在搅拌后在搅拌下慢慢加入下慢慢加入5的氯化钠细粉，室温的氯化钠细粉，室温(1025）放置）放置12天即可得到美丽的正八面体结晶。天即可得到美丽的正八面
45、体结晶。又如胰岛素的结晶条件是又如胰岛素的结晶条件是10g/L的胰岛素锌盐溶液，内含的胰岛素锌盐溶液，内含柠檬酸柠檬酸l0g，醋酸锌，醋酸锌0.13，丙酮，丙酮16，介质介质pH为为6.0。但有时结晶溶液的但有时结晶溶液的pH值离溶质的值离溶质的pI甚远。论原因，有的是甚远。论原因，有的是考虑到稳定因素，有的是因为在偏离考虑到稳定因素，有的是因为在偏离pI时，溶质分子带有时，溶质分子带有电荷易于吸附某种离子，有利结晶的形成。电荷易于吸附某种离子，有利结晶的形成。（五）（五）温度诱导法温度诱导法蛋白质、酶等生化物质的溶解度大多受温度影响。蛋白质、酶等生化物质的溶解度大多受温度影响。若先将其制成溶
46、液，然后升高或降低温度，使溶若先将其制成溶液，然后升高或降低温度，使溶液逐渐达到过饱和，即可慢慢析出晶体。液逐渐达到过饱和，即可慢慢析出晶体。如猪糜胰蛋白酶：如猪糜胰蛋白酶：先用先用冷蒸馏水冷蒸馏水溶解，调溶解，调pH3.0，然后加饱和硫酸铵溶液使达然后加饱和硫酸铵溶液使达31%饱和度。并调饱和度。并调pH至至6.0，再加少量饱和硫酸铵达微浑，放置于，再加少量饱和硫酸铵达微浑，放置于25，2h后即有晶体生成。后即有晶体生成。（六）微量扩散法（六）微量扩散法微量扩散法的具体做法是将少量结晶样品溶液与微量扩散法的具体做法是将少量结晶样品溶液与相应的沉淀剂一道置于一个密封的空间环境中，相应的沉淀剂一
47、道置于一个密封的空间环境中，通过气相扩散使样品中溶质达到饱和，慢慢长成通过气相扩散使样品中溶质达到饱和，慢慢长成晶体。晶体。提高晶体质量的方法提高晶体质量的方法晶体质量包括三个方面的内容：晶体质量包括三个方面的内容：晶体大小、形状和纯度晶体大小、形状和纯度影响晶体大小的因素：影响晶体大小的因素：过饱和度，温度、晶核质量、搅拌等过饱和度，温度、晶核质量、搅拌等影响晶体形状的因素：影响晶体形状的因素：改变过饱和度、改变溶剂体系、杂质改变过饱和度、改变溶剂体系、杂质影响晶体纯度的因素：影响晶体纯度的因素：母液中的母液中的杂质杂质、结晶速度、晶体粒度及粒度分布、结晶速度、晶体粒度及粒度分布 蒸发结晶釜
48、蒸发结晶釜（1）什么是结晶过程？结晶操作的原理是什么？）什么是结晶过程？结晶操作的原理是什么？（2）结晶操作的特点有哪些？）结晶操作的特点有哪些？（3）凯尔文公式的内容和意义是什么？）凯尔文公式的内容和意义是什么？（4）了解饱和温度曲线和过饱和温度曲线的内容？绘）了解饱和温度曲线和过饱和温度曲线的内容？绘 制饱和温度曲线和过饱和温度曲线，并标明稳定区、制饱和温度曲线和过饱和温度曲线，并标明稳定区、亚稳定区和不稳定区。亚稳定区和不稳定区。（5）在何种条件下，溶液中才有晶体析出？）在何种条件下，溶液中才有晶体析出？（6）影响晶体形成的主要因素有哪些？）影响晶体形成的主要因素有哪些？（7）晶种的作用
49、是什么？）晶种的作用是什么？本章思考题本章思考题（8）过饱和溶液形成的方法有哪些？）过饱和溶液形成的方法有哪些？（9）何为晶体生长的扩散学说？其具体意义何在？）何为晶体生长的扩散学说？其具体意义何在？（10）常用的工业起晶方法有哪些？）常用的工业起晶方法有哪些？（11）影响晶体质量的因素有哪些？）影响晶体质量的因素有哪些？（12）何为重结晶？）何为重结晶？（13）饱和溶液和过饱和溶液的概念）饱和溶液和过饱和溶液的概念（14）结晶的一般步骤是什么？）结晶的一般步骤是什么？（15）解释概念：晶种，晶核，晶型）解释概念：晶种，晶核，晶型,饱和溶液，过饱饱和溶液，过饱和溶液，饱和度和溶液，饱和度（16）粒子大小与溶解度有何关系？）粒子大小与溶解度有何关系？（17）初级成核与次级成核是如何形成的？）初级成核与次级成核是如何形成的？
