1、广东医学院广东医学院2003级级硕士研究生开题报告硕士研究生开题报告p16p16在宫颈癌发生中的作用及在宫颈癌发生中的作用及其机制的研究其机制的研究 n 研究生：研究生：邓飞邓飞n 导师：导师：胡新荣胡新荣 教授教授n 时间：时间：2004年年10月月22日日 立题依据立题依据n肿瘤的发生是一个多因素、多步骤的长期过程，其中多个基因的改变导致细胞周期失调，细胞增殖失控在肿瘤形成的过程中发挥了重要作用。np16基因又称MTS1（多肿瘤抑制基因）是人们发现的第一个直接作用于细胞周期，抑制细胞分裂的基因。np16在诸多肿瘤中的改变，使它在肿瘤发生中的作用日益受到人们的重视。一、一、p16p16的基因
2、结构和功能的基因结构和功能 1 1、p16p16的基因结构的基因结构 np16基因定位于9p21，全长8.5kb，由三个外显子和两个内含子构成，三个外显子的长度分别为126、307、11bp，其cDNA全长450bp。p16基因启动子和外显子1、2含有多个可甲基化的5CpG岛。np16基因编码产物p16蛋白，由148个氨基酸构成，为16kd 2 2、p16p16的功能的功能RBE2FRBPPPPE2FINK4Ap16cyclinD1CDK4/6PCDKcyclinD1CDK4/6cyclinD1CDK4/6CDK4/6P竞争性抑制二、二、p16p16与肿瘤与肿瘤 n研究表明，p16基因的缺失、
3、突变和甲基化存在于多种人肿瘤细胞，提示其与肿瘤的发生、发展有着密切的关系。np16除了调节细胞周期，抑制细胞异常增殖以外，还与肿瘤细胞中端粒酶活性的调节和肿瘤细胞的永生化有关。n大量的实验证据使人们相信在大多数肿瘤中p16扮演者抑癌基因的角色。三、三、p16p16与宫颈癌与宫颈癌 n宫颈癌是妇女常见肿瘤之一，其发生机制尚不清楚。对于p16与宫颈癌关系的研究，已成为近几年来宫颈癌发生机制研究中的热点。n同在大多数肿瘤中一样。p16基因也被认为在宫颈癌发生中的扮演着抑癌基因的角色，其主要依据有：n1、宫颈肿瘤组织中，普遍都能检测到p16基因的失活。n2、p16基因及其编码蛋白在体外实验中能抑制宫颈
4、癌细胞系的生长。然而，在对p16的进一步研究中，人们用免疫组化检测临床病例标本的p16蛋白表达后发现，p16蛋白的表达会随着宫颈癌病情的进展而呈现逐渐升高的趋势。这一发现使人们对p16在宫颈癌发生中的作用产生了疑问：（1）p16在宫颈癌发生过程中起什么作用，是否与在其他肿瘤中一样起着抑癌作用。（2）如果p16是抑癌基因，为什么其失活率随宫颈癌的发生而逐渐增加的同时，表达也逐渐升高。以上问题迄今为止，都还没有得到满意合理的解释，国内也缺乏此类相关研究。本实这些验即是针对以上问题展开初步的探讨。实验目的实验目的 1、研究p16在宫颈癌的发生过程的表达趋势。2、研究p16在宫颈癌发生中的作用及机制。
5、拟解决的关键问题拟解决的关键问题1、p16在宫颈癌发生过程中表达是否升高。2、高表达的p16与cyclinD1竞争性结合CDK4/6的能力是否改变。3、p16高表达与pRb磷酸化的关系。4、体外实验中p16表达对cyclinD1与CDK4/6的结合能力及pRb的磷酸化水平的影响。拟采取的研究方法拟采取的研究方法（1）IHC（2）CO-IP、IP、western-blot（3）siRNA转染宫颈癌细胞系技术路线技术路线 一、临床实验1、p16表达的检测：临床病例标本切片、HE同一组织来源不同组织来源癌前病变宫颈癌癌前病变宫颈癌p16P16的表达趋势图像分析IHC2、p16功能检测p16高表达的宫
6、颈癌标本 P16低表达的宫颈癌标本 提取组织块中的蛋白质p16-CDK4/6 pRb-P 对比不同组结果，研究p16表达与pRb磷酸化的关系 对比不同组的结果，研究p16表达升高对其功能的影响。CO-IP、westernIPwestern二、体外实验p16高表达的宫颈癌细胞筛选p16表达缺失的宫颈癌细胞 CyclinD1-CDK4/6pRb-P CyclinD1-CDK4/6pRb-P CO-IP、IP、western-blot 对比分析得出结论siRNA腺病毒转染预期结果预期结果 n1、p16在宫颈癌的发生过程中表达逐渐升高。n2、临床实验中，p16高表达组比低表达组，p16与CDK4/6的结合增加，pRb的磷酸化水平升高。n3、体外实验中，转染前后，cyclinD1与CDK4/6的结合增加，pRb的磷酸化水平降低，进度安排进度安排 n2004.102005.7 临床病理标本的收集。细胞系的筛选，细胞转染及转染后筛选。n2005.82006.1 IHC、CO-IP、IP、western-blot。n2006.22006.4 结果分析，撰写论文，准备答辩。经费预算经费预算 n免疫组化 2000元n免疫沉淀 5000元nWestern-blot 3000元n细胞培养 2000元nsiRNA转染 25000元*n总计 37000元
