1、2022-12-16苹果转基因研究苹果转基因研究 田爽2022-12-16 转基因苹果转基因苹果v苹果为世界四大水果之一，是我国的第一大水果，苹果为世界四大水果之一，是我国的第一大水果，在国民经济中占有重要地位。在国民经济中占有重要地位。v但是，由于果树育种周期长、遗传背景复杂，传但是，由于果树育种周期长、遗传背景复杂，传 统的杂交育种方式很难选育出集各种优良品质于统的杂交育种方式很难选育出集各种优良品质于一身的品种一身的品种 v近年来随着社会的发展和进步，培育优质的苹果近年来随着社会的发展和进步，培育优质的苹果新品种成为民众的迫切要求。新品种成为民众的迫切要求。2022-12-16v 基因工
2、程的发展为苹果品种的遗传改良提供了新的技术方法，基因工程的发展为苹果品种的遗传改良提供了新的技术方法，缩短育种周期，提高育种效率，为苹果遗传育种研究、利用缩短育种周期，提高育种效率，为苹果遗传育种研究、利用各种遗传种质资源开辟了一条新的技术途径各种遗传种质资源开辟了一条新的技术途径 转基因苹果转基因苹果2022-12-16究竟怎样定义转基因苹果？究竟怎样定义转基因苹果？转基因苹果研究进展如何？转基因苹果研究进展如何？它存在哪些问题？它存在哪些问题？转基因苹果转基因苹果2022-12-16主要内容主要内容v定义定义v发展历史发展历史 v研究现状研究现状 v研究进展研究进展 v存在问题存在问题20
3、22-12-16v转基因技术就是将人工分离和修饰过的基因导转基因技术就是将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰，这一技术引起生物体的性状的可遗传的修饰，这一技术称之为转基因技术（称之为转基因技术（Transgene technology）1 定义定义2022-12-16“转基因技术转基因技术”（Genetically Modified Technology）v是指使用基因工程或分子生物学技术是指使用基因工程或分子生物学技术(不包不包括传统育种、细胞及原生质体融合、杂交、括传统育种、细胞及原生质体融
4、合、杂交、诱变、体外受精、体细胞变迁及多倍体诱诱变、体外受精、体细胞变迁及多倍体诱导等技术导等技术)，将遗传物质导入活细胞或生物，将遗传物质导入活细胞或生物体中，产生基因重组现象，并使之表达并体中，产生基因重组现象，并使之表达并遗传的相关技术遗传的相关技术2022-12-16 2 发展历史发展历史 自自1988年首例使用农杆菌转化成的转基因年首例使用农杆菌转化成的转基因果树核桃诞生以来，随后，果树核桃诞生以来，随后，1989年年James等采用农杆菌介导的叶盘共培养法获得了转基因等采用农杆菌介导的叶盘共培养法获得了转基因绿袖绿袖(Greensleeves)苹果，报告基因新霉素苹果，报告基因新霉
5、素磷酸转移酶基因和胭脂碱合成酶基因磷酸转移酶基因和胭脂碱合成酶基因 1992年程家胜等在国内报道了获得转基因的年程家胜等在国内报道了获得转基因的苹果试管苗，与苹果试管苗，与James等一样，用绿袖作为受等一样，用绿袖作为受体植株，农杆菌介导法，不同的是抗卡那霉素的体植株，农杆菌介导法，不同的是抗卡那霉素的标记基因为氨基葡糖磷酸转移酶标记基因为氨基葡糖磷酸转移酶APH(3)I基基因，报道基因为葡萄糖苷酸酶基因因，报道基因为葡萄糖苷酸酶基因 2022-12-162 发展历史发展历史v植物转基因的方法主要有农杆菌介导法、基因枪植物转基因的方法主要有农杆菌介导法、基因枪法、激光法、花粉管通道法等。在植
6、物上转化成法、激光法、花粉管通道法等。在植物上转化成功的例子中，功的例子中，80%是由农杆菌介导转化的是由农杆菌介导转化的。2 发展历史发展历史2 发展历史发展历史2 发展历史发展历史2022-12-163.1 苹果转基因的受体基因型苹果转基因的受体基因型 近年来，在全世界果树研究者的努力下，转基因苹果近年来，在全世界果树研究者的努力下，转基因苹果已取得不小的成就，用于苹果遗传转化研究的受体基因已取得不小的成就，用于苹果遗传转化研究的受体基因型越来越多，除了绿袖，主要还有型越来越多，除了绿袖，主要还有 红元帅、新乔纳金、嘎拉、金冠、红元帅、新乔纳金、嘎拉、金冠、M26、皇家嘎拉、皇家嘎拉、El
7、star、Braeburn、Merlijin、乔纳金、富士、王林、乔纳金、富士、王林、金矮生、辽伏、元帅、粉红佳人以及金矮生、辽伏、元帅、粉红佳人以及M7和八楞海棠等和八楞海棠等3 研究现状研究现状2022-12-16 3 研究现状研究现状3.2 导入的外源基因导入的外源基因v 目前为止，导入的外源基因有目前为止，导入的外源基因有GUS基因、基因、GFP基因、基因、Bt基因、基因、LFY基因、基因、npt基因、基因、CpTI基因、杀菌肽基因、基因、杀菌肽基因、抗菌肽抗菌肽MB39基因基因、FT基因、硫堇蛋白基因、硫堇蛋白Rs-afpl基因、基因、ALS基因基因(抗除草剂抗除草剂)、rol基因基
8、因(生长素合成酶基因生长素合成酶基因)、光、光敏色素敏色素B基因、基因、LeIRT、Ferrition等等v 其中抗性基因分别提高了苹果的抗虫性、抗病性和抗除其中抗性基因分别提高了苹果的抗虫性、抗病性和抗除草剂的能力；草剂的能力；rol基因的导入使苹果苗在田间表现矮化；基因的导入使苹果苗在田间表现矮化；光敏色素光敏色素B基因使苹果的生长量和干重不同程度减少基因使苹果的生长量和干重不同程度减少2022-12-16 同时，对转化材料的选择不再停留在最初的抗性材料同时，对转化材料的选择不再停留在最初的抗性材料筛选上，筛选上，GUS组织化学检测及分子水平的检测组织化学检测及分子水平的检测(PCR或或S
9、outhern杂交杂交)技术被普遍采用。由于技术被普遍采用。由于GUS基因基因可以在农杆菌中表达，而农杆菌在转化后的离体培养可以在农杆菌中表达，而农杆菌在转化后的离体培养中至少能存活中至少能存活12个月而不表现生长，所以个月而不表现生长，所以GUS阳性阳性结果不能准确反映初步转化频率结果不能准确反映初步转化频率 于是，另外一种报道基因于是，另外一种报道基因绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白(GFP)被被用于苹果的遗传转化用于苹果的遗传转化 3 研究现状研究现状2022-12-16v 作为荧光标记分子，作为荧光标记分子，GFP既具有敏感的标既具有敏感的标记检测率，又没有放射性的危害。记检测率，又没有放射性
10、的危害。GFP检检测方便，荧光稳定，易于构建载体且对活测方便，荧光稳定，易于构建载体且对活细胞无毒害，对目的基因的功能也没有影细胞无毒害，对目的基因的功能也没有影响，转化后细胞可以继续传代。目前，响，转化后细胞可以继续传代。目前，GFP被改造作为转基因植物的遗传标记，被改造作为转基因植物的遗传标记，成为监测生物体内基因表达的的十分重要成为监测生物体内基因表达的的十分重要的报告因子的报告因子v 另外，许多实验研究表明甘露糖另外，许多实验研究表明甘露糖/PMI筛筛选体系以选体系以pmi为安全标记基因，可以实现为安全标记基因，可以实现对转化细胞安全、高效的正向选择。对转化细胞安全、高效的正向选择。3
11、 研究现状研究现状2022-12-16 3.3 外源基因导入的方法外源基因导入的方法 v 直接导入法直接导入法 化学物质导入法、电穿孔发、脂质体法、微注射化学物质导入法、电穿孔发、脂质体法、微注射法、基因枪法（微弹轰击法）和花粉管通道法等法、基因枪法（微弹轰击法）和花粉管通道法等 v 间接导入法间接导入法 土壤农杆菌转化系统和植物病毒载体系统土壤农杆菌转化系统和植物病毒载体系统 3 研究现状研究现状2022-12-163.3 外源基因导入的方法外源基因导入的方法 在苹果基因转化中主要应用电穿孔法、基因枪在苹果基因转化中主要应用电穿孔法、基因枪法和农杆菌介导法。农杆菌介导法以其简便、法和农杆菌介
12、导法。农杆菌介导法以其简便、高效成为应用最广泛的转化方法高效成为应用最广泛的转化方法。3 研究现状研究现状2022-12-163.4 转基因苹果的鉴定转基因苹果的鉴定 v 遗传转化的最终目的是获得能稳定表达且遗传外源目的遗传转化的最终目的是获得能稳定表达且遗传外源目的基因的转化植株，这就需要不断观察和检测转基因植株基因的转化植株，这就需要不断观察和检测转基因植株在田间的表现在田间的表现v 目前使用的转基因植物的鉴定方法有目前使用的转基因植物的鉴定方法有:分子检测、免疫技分子检测、免疫技术、利用生理生化指标、标记基因和生物鉴定法术、利用生理生化指标、标记基因和生物鉴定法 3 研究现状研究现状20
13、22-12-163 研究现状研究现状3.4 转基因苹果的鉴定转基因苹果的鉴定全面检测需要：全面检测需要：v 1 检测插入外源基因：先做个普通检测插入外源基因：先做个普通PCR检测，传统的要检测，传统的要 southern杂交检测插入几个拷贝，现在可以用杂交检测插入几个拷贝，现在可以用Real-Time 检测拷贝数；检测拷贝数；v 2 表达量检测：表达量检测：RT-PCR，northern杂交，杂交，Real-Time RT-PCR；v 3 蛋白水平检测：蛋白水平检测：western杂交杂交v 4 报告基因检测：报告基因检测：Gus，GFP/YFP/RFP等等 2022-12-16 4 研究进展
14、研究进展2022-12-16 4 研究进展研究进展4.1 农杆菌介导法农杆菌介导法v 现在，农杆菌介导法的发展潮流是提高转化效率和扩大现在，农杆菌介导法的发展潮流是提高转化效率和扩大转化范围。转化范围。v 常见的影响农杆菌转化频率的因素有三大类：侵染力常见的影响农杆菌转化频率的因素有三大类：侵染力,抗抗生素生素,基因基因型。型。2022-12-164 研究进展研究进展侵染力侵染力v农杆菌的侵染力取决于本身的特性及其受体植株农杆菌的侵染力取决于本身的特性及其受体植株的敏感性。细菌的菌株对转化频率的影响很大。的敏感性。细菌的菌株对转化频率的影响很大。最常用的致瘤农杆菌菌株是最常用的致瘤农杆菌菌株是
15、LBA4404，EHAl05和和EHA101，也常用，也常用A208SE，A136，C58/Z707最常用的发根农杆菌菌株则是最常用的发根农杆菌菌株则是1855NCPPB和和ATCCl5834。2022-12-164 研究进展研究进展v抗生素抗生素 抗生素的浓度，种类对转化都会产生影响。常用的卡那霉素，抗生素的浓度，种类对转化都会产生影响。常用的卡那霉素，用量用量50100g/ml，因物种不同而异，卡那霉素的浓度，因物种不同而异，卡那霉素的浓度和加入时间须根据外植体和物种的不同进行预先实验和加入时间须根据外植体和物种的不同进行预先实验v基因型基因型 基因型是影响苹果遗传转化率的重要因素，其特异
16、性一般认基因型是影响苹果遗传转化率的重要因素，其特异性一般认为与材料的生理状态有关，不同株系间进行转化有差别，且为与材料的生理状态有关，不同株系间进行转化有差别，且同一属间差异也往往较大。转化细胞能否高效再生是基因转同一属间差异也往往较大。转化细胞能否高效再生是基因转化的主要障碍，受到所用组织的很大影响。化的主要障碍，受到所用组织的很大影响。2022-12-164 研究进展研究进展4.2 电穿孔法电穿孔法 这种方法也被称为电激法。在使用电穿孔法的研究报告这种方法也被称为电激法。在使用电穿孔法的研究报告中，大多数的研究报告是转化原生物质的报告。中，大多数的研究报告是转化原生物质的报告。4.3 微
17、弹轰击法微弹轰击法 此法也称基因枪法，最近发展很快。可用于基因枪法的此法也称基因枪法，最近发展很快。可用于基因枪法的植物组织、器官相当广泛，常用的材料是悬浮培养的细植物组织、器官相当广泛，常用的材料是悬浮培养的细胞、营养胚或合子胚、愈伤组织、花粉粒、花轴、叶柄、胞、营养胚或合子胚、愈伤组织、花粉粒、花轴、叶柄、幼叶、子叶。幼叶、子叶。2022-12-16 4 研究进展研究进展4.4花粉管通道法花粉管通道法 花粉管通道法是一种较老的植物转化方法花粉管通道法是一种较老的植物转化方法,是我国科学家周是我国科学家周光宇在光宇在1983年首次在年首次在“Methods in En-zymology”报道
18、的研究成果报道的研究成果4.5 吸胀法吸胀法 花粉管途径法和吸胀法的最大优点就是简单易行，花粉管途径法和吸胀法的最大优点就是简单易行，不需要贵重、复杂的设备，无须离体培养就可获不需要贵重、复杂的设备，无须离体培养就可获得再生植株。得再生植株。2022-12-16 5 存在问题存在问题v 首先，因为离体材料再生体系的不完善，苹果转基因技首先，因为离体材料再生体系的不完善，苹果转基因技术尽管发展的很迅速，但是有些品种由于基因型不同，术尽管发展的很迅速，但是有些品种由于基因型不同，再生率不高，因此不能进行遗传转化再生率不高，因此不能进行遗传转化v 其次，是关于基因沉默和丢失的问题，外源基因整合到其次
19、，是关于基因沉默和丢失的问题，外源基因整合到受体以后经常表现出不表达或者丢失等现象，这是一个受体以后经常表现出不表达或者丢失等现象，这是一个很普遍的问题很普遍的问题v 另外，移栽成活率不高，即使获得转化植株，但由于移另外，移栽成活率不高，即使获得转化植株，但由于移栽不能成活，致使不能大面积应用生产，理论与实际难栽不能成活，致使不能大面积应用生产，理论与实际难以结合以结合2022-12-16 5 存在问题存在问题目前，苹果转基因研究进入瓶颈阶段。目前，苹果转基因研究进入瓶颈阶段。v 第一，转化方法单一，主要使用农杆菌介导法第一，转化方法单一，主要使用农杆菌介导法v 第二，转基因技术的转化效率很低
20、第二，转基因技术的转化效率很低 Puite等用农杆菌介导的嘎拉、金帅、等用农杆菌介导的嘎拉、金帅、E1star的转化效率分别为的转化效率分别为0.7%8.0%，0.2%6.0%,0.4%0.8%；2022-12-16 5 存在问题存在问题v所以，苹果想要成功的进行转基因，必须根据自身所以，苹果想要成功的进行转基因，必须根据自身品种的遗传性状，借鉴其他类似植物成功的经验和品种的遗传性状，借鉴其他类似植物成功的经验和方法，探索适用于苹果遗传转化的新方法和提高转方法，探索适用于苹果遗传转化的新方法和提高转化效率的办法。化效率的办法。2022-12-16Thank you for your attentionO(_)O
