1、Western Blot 介绍 蛋白质印迹的发明者一般认为是美国斯坦福大学的乔治斯塔克（George Stark）。在尼尔伯奈特（Neal Burnette）于1981年所著的分析生物化学（Analytical Biochemistry）中首次被称为Western Blot。蛋白免疫印迹(Western Blot)是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF 膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现己广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。（1 1）贴壁细胞蛋白样品收集）贴壁细胞蛋白样品收集 A 收集培养瓶或六孔
2、板中的培养液转移至离心管中。B 加入PBS冲洗2-3遍，再将PBS转移至离心管中，离心收集细胞。C 将细胞培养瓶或六孔板置于冰上，然后将离心好的离心管中的液体小心倾尽并放置于冰中，加入含PMSF的RIPA裂解液200l于离心管中并移至对应的培养瓶中，摇晃培养瓶使裂解液与贴壁的细胞充分接触，冰上裂解30min。D 裂解结束后用细胞刮将贴壁的细胞刮下并转移至1.5 ml EP管中，再用超声破碎仪破碎细胞后，4下12000rpm离心15min，吸取上层液体于新的离心管中，弃掉沉淀。收集蛋白样品收集蛋白样品(Protein sample preparation)(Protein sample prep
3、aration)分多次将细胞收至一个管中（2 2）蛋白含量测定（福林）蛋白含量测定（福林-酚法酚法）目前常用比色法测定样品蛋白的含量：Bradford法（考马斯亮蓝法）、Lowry法（福林-酚试剂法）、BCA法等。1、配制BSA标准溶液：0、25、50、100、150、200、300 g/mL（用PBS配制）。样品液：取原液2 L至200 L（用PBS配制）。2、操作：先取一块新的96孔板，于630nm下测光密度值，取溶液/样品40L和E液40L，每个浓度点均作三复孔，振荡混匀。37C反应10 min后，加入福林酚试剂（1:15稀释）160L，振荡混匀，37C反应30 min。630 nm下测
4、光密度值。以标准蛋白浓度对光密度值作出标准曲线，计算待测样品蛋白浓度。1、配制下层胶（分离胶）静置1h后制上层胶（浓缩胶）2、配制上层胶（浓缩胶）加完后插上梳子，静置1h(1)SDS-PAGE凝胶配制 制胶制胶操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。加完分离胶后胶，加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。分离胶充分凝固就倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。插梳子时要使梳子保持水平。制胶过程注意事项：制胶过程注意事项：(2)(2)上样与电泳上样与电泳 将制备好的样品溶解后，把蛋白样品直接上样到将制备好的样品溶解后
5、，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGESDS-PAGE胶加样孔内即可。跑上层胶，胶加样孔内即可。跑上层胶，70V 35Ma/70V 35Ma/块块 45 min45 min；跑下层胶，；跑下层胶，100V 35Ma/100V 35Ma/块胶块胶 1 h1 h左右。左右。转膜转膜(Transfer)(Transfer)半干转移法半干转移法 将凝胶和固相基质象三明治一样夹在用缓冲液湿润滤纸间。将凝胶和固相基质象三明治一样夹在用缓冲液湿润滤纸间。|纸纸|胶胶|膜膜|纸纸|槽式湿转法槽式湿转法 将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中。将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液
6、中。|海绵海绵|纸纸|胶胶|膜膜|纸纸|海绵海绵|转膜注意事项转膜注意事项滤纸、胶、膜之间滤纸、胶、膜之间不能有气泡不能有气泡。滤纸、胶、膜的滤纸、胶、膜的大小大小和和摆放顺序摆放顺序。胶和膜上要做好胶和膜上要做好标记标记，识别正反面和上下，识别正反面和上下 。PVDFPVDF膜需要膜需要100%100%甲醇预处理，后续操作中膜必须保持湿润。甲醇预处理，后续操作中膜必须保持湿润。转膜条件：转膜条件：推荐：推荐：100V 100V，1212小时；根据蛋白大小以及胶厚度的小时；根据蛋白大小以及胶厚度的不同而不同。不同而不同。蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤膜，换水几次。只用于放射性标
7、记抗体或放射性标记A蛋白探针的Western印迹过程。封闭封闭(Blocking)(Blocking)将转印膜浸泡到封闭液中，将膜上没有结合将转印膜浸泡到封闭液中，将膜上没有结合蛋白质的区域结合上蛋白质，目的是蛋白质的区域结合上蛋白质，目的是使抗体与特异的使抗体与特异的蛋白质结合。蛋白质结合。封闭液封闭液l 5%5%TBSTTBST脱脂奶粉溶液（脱脂奶粉溶液（30ml30ml）l 牛血清白蛋白溶液牛血清白蛋白溶液(BSA)(BSA)摇床上缓慢摇动封闭，室温摇床上缓慢摇动封闭，室温2 h2 h或或4 4过夜。过夜。一抗孵育一抗孵育(Primary antibody incubation)(Pri
8、mary antibody incubation)把把NCNC膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，加入稀释好的一膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，加入稀释好的一抗，室温或抗，室温或4 4在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如果一抗在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如果一抗孵育一小时效果不佳，可以孵育一小时效果不佳，可以4 4缓慢摇动孵育过夜。或更据抗缓慢摇动孵育过夜。或更据抗体的说明选择适当的孵育温度和时间。体的说明选择适当的孵育温度和时间。回收一抗。加入回收一抗。加入TBSTTBST液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-5-1010分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤分钟。吸尽洗涤液后
9、，再加入洗涤液洗涤5-105-10分钟。共洗分钟。共洗涤涤3 3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。次数。注：注：WesternWestern结果通常需要提供内参作为对照，通常可以选用结果通常需要提供内参作为对照，通常可以选用TubulinTubulin抗体抗体或或ActinActin抗体抗体，进行内参检测。，进行内参检测。二抗孵育二抗孵育(Secondary antibody inucubation)(Secondary antibody inucubation)NCNC膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，加入稀释好的膜放在密闭
10、塑料袋或者培养皿中，加入稀释好的荧光二抗，荧光二抗，3737 缓慢摇动孵育一小时。二抗需根据一缓慢摇动孵育一小时。二抗需根据一抗进行选择，例如，一抗是小鼠来源的抗进行选择，例如，一抗是小鼠来源的IgGIgG，则二抗需选，则二抗需选择抗小鼠择抗小鼠IgGIgG的二抗。的二抗。回收二抗。加入回收二抗。加入TBSTTBST液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤涤5-105-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤5-105-10分分钟。共洗涤钟。共洗涤3 3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数
11、。间并增加洗涤次数。蛋白检测蛋白检测(Detection of proteins)(Detection of proteins)DABDAB显色法显色法 ECLECL显色原理显色原理：(二抗用二抗用HRPHRP标标记记)反应物为过氧化物反应物为过氧化物+鲁米诺，鲁米诺，如果遇到如果遇到HRPHRP即发光，可使胶片曝即发光，可使胶片曝光显影。光显影。化学发光显色法化学发光显色法(ECL ECL)uECLECL化学发光显色化学发光显色 比较常用，结果容易控制，但是被催化是比较常用，结果容易控制，但是被催化是 灵敏度差一点灵敏度差一点uDABDAB显色显色 比较灵敏，是比较灵敏，是HRPHRP最敏感
12、的底物最敏感的底物电解质电解质-电解质可促进抗原抗体复合物的形成，因电解质可促进抗原抗体复合物的形成，因此常选用各种缓冲液做为抗体的稀释液。此常选用各种缓冲液做为抗体的稀释液。酸碱度酸碱度-抗原抗体反应需要适宜的抗原抗体反应需要适宜的pHpH值环境，一般值环境，一般为为pH6.0-8.0pH6.0-8.0。温温 度度-温度升高可使反应加速，但温度高于温度升高可使反应加速，但温度高于5656时，可导致抗原抗体的解离，甚至变性。时，可导致抗原抗体的解离，甚至变性。影响抗原抗体反应的因素影响抗原抗体反应的因素背景太高背景太高抗体浓度过高抗体浓度过高封闭不充分封闭不充分膜没有均匀浸湿膜没有均匀浸湿膜或
13、者缓冲液污染膜或者缓冲液污染抗体与封闭剂出现抗体与封闭剂出现交叉反应交叉反应 杂交前检测一抗、二抗的杂交前检测一抗、二抗的工作浓度工作浓度延长封闭时间或更换封闭延长封闭时间或更换封闭液液转膜前用甲醇将膜完全浸转膜前用甲醇将膜完全浸湿湿拿取膜与吸水纸时要戴手拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液套，更换新鲜转膜缓冲液检测一抗、二抗与封闭剂检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应是否有交叉反应非特异条带多非特异条带多抗体浓度过高抗体浓度过高膜没有均匀浸湿膜没有均匀浸湿膜或者缓冲液污染膜或者缓冲液污染封闭不充分封闭不充分抗体与封闭剂出现抗体与封闭剂出现交叉反应交叉反应 杂交前检测一抗、二抗杂交前检
14、测一抗、二抗的工作浓度的工作浓度转膜前用转膜前用100%100%甲醇将膜甲醇将膜完全浸湿完全浸湿拿取膜与吸水纸时要戴拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓手套，更换新鲜转膜缓冲液冲液检测一抗、二抗与封闭检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应剂是否有交叉反应蛋白带型条状蛋白带型条状上样过量上样过量样品沉淀样品沉淀样品中的污染样品中的污染制胶不佳制胶不佳 降低上样量降低上样量加大样品中的加大样品中的SDSSDS浓度浓度离心样品离心样品确保灌胶均匀确保灌胶均匀 条带模糊条带模糊 蛋白样品部分变性蛋白样品部分变性蛋白样品部分还原蛋白样品部分还原电泳时间过长电泳时间过长 完全变性蛋白完全变性蛋白确保加入
15、足够的确保加入足够的DTTDTT或或-巯基乙醇巯基乙醇观察指示剂染料，掌握观察指示剂染料，掌握恰当的电泳时间恰当的电泳时间哑铃型条带或哑铃型条带或 “微笑微笑”条带条带上样体积过大导致不完上样体积过大导致不完全堆积全堆积电泳过程中电场不均匀电泳过程中电场不均匀分离胶表面不齐分离胶表面不齐 使用恰当上样体积使用恰当上样体积如果蛋白浓度已知，如果蛋白浓度已知，上样时确保对称上样时确保对称制胶时使分离胶表面制胶时使分离胶表面水平水平无条带的原因无条带的原因 蛋白样品制备蛋白样品制备 检查胶：考马斯亮蓝染胶检查胶：考马斯亮蓝染胶 检查膜：丽春红检查膜：丽春红S S染色染色 抗体滴度太低抗体滴度太低 显色显色 试剂放置太久或存放条件不正确试剂放置太久或存放条件不正确 谢谢 谢谢！谢谢
