1、1 1 2 21：无菌工艺模拟的重要性2：GMP对无菌工艺模拟的要求3：无菌工艺模拟验证的设计4：培养结果的评价5：发现污染后调查6：模拟灌装常见问题讨论3 3 4 4定义：无菌工艺模拟：无菌工艺模拟试验就是指采用微生物培养基替代产品（无菌粉末分装的培养基灌装试验实际是将产品替代品溶入培养基中，不是直接替代产品）对无菌工艺进行评估的验证技术。5 5药品检验药品检验局限性？局限性？6 6从药品审评的角度来看，药品检验不仅是对于所设定的质量检查项目的考核，更是对药品生产工艺的全面考察。药品生产中任何检验手段都是有局限性的，因此，严格控制并把握好药品生产的每个过程，同时把这种细致体现在质量标准及药品
2、检验中，才能生产出质量无懈可击的药品。7 7无菌生产工艺样无菌生产工艺样品被污染的随机品被污染的随机性，无法确定最性，无法确定最差点。差点。取样数量的局限取样数量的局限性，并不是每个性，并不是每个单位制剂都能进单位制剂都能进行检查。行检查。8 8目的：评估在既定无菌生产环境和过程控制条件下生产无菌产品的能力 证明指定的无菌工艺设计和变更是否可行 证明无菌工艺过程中的相关操作是否可行 评估无菌工艺人员的操作水平（资格确认组成部分）证明符合GMP的要求 发现无菌工艺过程中潜在的微生物污染因素9 91010第四十七条 无菌生产工艺的验证应包括培养基模拟灌装试验。应根据产品的剂型以及培养基的选择性、澄
3、清度、浓度和灭菌的适用性选择培养基。应尽可能模拟常规的无菌生产工艺，包括所有对产品的无菌特性有影响的关键操作，及生产中可能出现的各种干预和最差条件。培养基模拟灌装试验的首次验证，每班次应连续进行3次合格的试验。空气净化系统、设备、生产工艺及人员重大变更后，应重复进行培养基模拟灌装试验。培养基模拟灌装试验通常应按生产工艺每班次半年进行1次，每次至少一批。1111 培养基灌装容器的数量应足以保证评价的有效性。批量较小的产品，培养基灌装的数量应至少等于产品的批量。培养基模拟灌装试验的目标是零污染，应遵循以下要求：（1）灌装数量少于5000支时，不得检出污染品；（2）灌装数量在5000至10000支时
4、：1.有1支污染，需调查，可考虑重复试验；2.有2支污染，需调查后，进行再验证。（3)灌装数量超过10000支时：1.有1支污染，需调查；2.有2支污染，需调查后，进行再验证。（4）发生任何微生物污染时，均应进行调查。12121313无菌工艺模拟试验的方法按照生产工艺特点一般可以分为：溶液灌装、悬浮液制剂灌装、冻干产品灌装、粉末灌装和无菌霜剂、乳膏剂、乳剂、凝胶灌装等 溶液灌装、悬浮液制剂灌装、溶液灌装、悬浮液制剂灌装、冻干产品灌装、粉末灌装。冻干产品灌装、粉末灌装。1414概况概况（冻干产品为例）（冻干产品为例）洗瓶机干热隧道隔离柜冻干机轧盖机转移瓶塞灌装机容器1515内源性的影响因素系统设
5、备工艺过程物料和中间体的质量外源性的影响因素人员 1616评价结果，确定实际生产中（如灌装前的调试、加入无菌原辅材料、无菌连接、评价结果，确定实际生产中（如灌装前的调试、加入无菌原辅材料、无菌连接、灌装和密封）产品污染的可能性。灌装和密封）产品污染的可能性。对装有培养基的密闭容器进行培养以检查微生物的生长。对装有培养基的密闭容器进行培养以检查微生物的生长。将培养基暴露于设备、容器胶塞密封系统的表面和关键环境条件中，并模拟实际将培养基暴露于设备、容器胶塞密封系统的表面和关键环境条件中，并模拟实际生产完成工艺操作。生产完成工艺操作。1717在培养基灌装设计中，工艺条件的选择应选取合理的“最差条件”
6、，用最差条件来对工艺流程、设备和整个体系进行挑战。最差条件是指在工艺允许范围内正常生产时可能遇到的最差情况，并不包括由于偏差引起的超出工艺要求的特殊情况。如果在最差条件下能获得好结果，说明在比最差情况要好的实际生产中，无菌保证的可靠性更有保证。最差条件最差条件-在在SOPSOP范围内，由工艺参数的上、下限和相范围内，由工艺参数的上、下限和相关因素组成的一个或一系列条件。与理想条件相比时关因素组成的一个或一系列条件。与理想条件相比时，最最差条件使产品或者生产工艺失败的几率为最大，差条件使产品或者生产工艺失败的几率为最大，但这类最但这类最差条件不一定必然导致产品或工艺的不合格。差条件不一定必然导致
7、产品或工艺的不合格。18183.1培养基和培养温度的选择3.2灌装装量及规格的选择3.3灌装的持续时间3.4灌装速度与瓶子规格3.5人员数量3.6人为干预19193.7剔废原则3.8储存时间3.9环境监测及取样3.10验证的频率3.11抑菌作用的避免2020培养基的选择适应广谱微生物生长，包括细菌和真菌较好的澄明度，较小的粘度易于除菌过滤常用培养基：大豆胰蛋白肉汤（TSB）厌氧培养基仅在特殊情况下使用培养温度的选择先在2025最少培养7天，然后在3035的范围继续培养7天。2121灌装装量每只容器的灌装体积不少于总容积的1/3同样，灌装体积也不宜过大既要考虑到瓶倒转或旋转时，培养基可以完全接触
8、到容器内表面，避免由于培养基灌装量偏少造成微生物不能生长的情况出现，亦可保证避免空气不足造成微生物不能生长。2222灌装规格的选择一般来说培养基灌装可以针对规格最大和最小的容器进行，除非其他不同规格容器的灌装工艺有很大差别。在初始验证时可以进行两次最大规格容器和一次最小规格容器的灌装挑战。在以后的周期性半年度灌装可以轮换，每次挑战一种规格。2323最保守的设计：在培养基灌装试验中，模拟用时最长的瓶子满批量生产所需要的时间，其中包括正常的干扰时间（换班、设备维修）。其他的设计：1.在生产完成后接着进行无菌工艺模拟验证2.为了减少灌装瓶数，在每批生产刚开始及结束前均灌装培养基，中间空运行灌装机以达
9、到所需要的时间 在任何情况下模拟了与实际生产不相同的情况，都要有记录，并解释原因 在正常生产过程中所需的最长时间，包括可能发生的事件，人员的换班等，应予以模拟2424为模拟较差条件，生产线运行速度及灌装时间与产品生产批次相比，均需进行调整；最快速度灌装最小容器（操作困难）；最慢速度灌装最大容器（使暴露时间最长）。2525培养基灌装时模拟无菌区可能容纳最多的人数无菌区工作人员至少每年参与一次培养基灌装不是每个人员都要参与最差条件的模拟2626正常的（灌装线装配，称量调节，加胶塞，处理倒瓶，取样，环境监测）非正常的（设备故障，灌装线堵塞，轨道调节，拆卸/替换破损的部件）SOP中应列出哪些干扰是容许
10、的，非正常的干扰至少每年模拟一次干扰的次数应该等于正常生产时发生的次数不应挑战干扰而避免干扰2727灌装过程中正常产品的灌装装量控制精度需要很高，但培养基灌装时，只要符合最低灌装，而不应该丢弃。但如果密闭系统不完整，必须丢弃。培养基灌装容器的数量应当足以保证评价的有效性。在培养基灌装完成后，应对密封好的最终产品进行检査。所有完好的灌装样品都应培养，对于与密封性无关缺陷（如外观缺陷）的灌装样品也应进行培养，不得剔除。有密封性缺陷的样品可作废品剔除，但应当记录剔除数量和原因。在培养过程中，任何发现损坏的样品也应列入培养基灌装的批记录数据中。如果要将这类已培养的样品从最后的结果判定计算中剔除，则必需
11、充分说明理由，并在培养基灌装报告中对偏差做出解释。2828灌装设备、灌装部件、储罐、无菌物料、药液在实际灌装前能够放置的最长时间 1.灌装设备、灌装部件、储罐、无菌物料需要再灭菌（除菌）的时间间隔 2.产品从无菌过滤到灌装加塞完成所需要的时间2929培养基灌装试验的环境条件应充分体现生产操作的实际情况。不应采取特别的生产控制和预防措施，制造特别良好的工艺环境，这样会导致不准确的评估结论，造成工艺条件良好的假象。不用人工创造极端的环境条件（如对净化空调系统重新调整，使其在最差的状态下运行）进行验证，对于环境最差条件的挑战应当是在工艺允许的苛刻条件范围内对环境受干扰程度（如生产现场人员最多、生产活
12、动频率最高）的挑战。3030新建的或生产工艺、设备、人员等重大变更后的无菌工艺生产线，必须经至少连续三批合格的培养基灌装试验。常规生产条件下的再验证频率，培养基模拟试验通常按生产工艺每班次半年进行1次，每次至少一批。3131培养基灌装模拟使用促进微生物生长的培养基来挑战评估污染风险。因此抑菌因素应当在培养基灌装时予以考虑，必须避免污染微生物在模拟过程中被杀死造成假阴性的结果。模拟试验中需要注意的抑菌因素有温度、培养基p H、消毒剂、惰性气体和真空度等。3232物料的准备、储存过程风险点风险点解释解释控制方法控制方法配制溶液的注射用水温度髙于70髙温会抑制微生物生长将配制培养基的注射用水冷却到室
13、温，在室温下（2 0 25)配制正常生产溶液p H 偏高或偏低酸性或碱性环境不利于微生物生长培养基的p H调整到适合微生物生长的范围配制好的溶液在低温下保存低温会抑制微生物生长培养基在储存容器中常温保存3333灌装 风险点风险点解释解释控制方法控制方法生产过程中使用惰性气体(如氮气）保护产品大多数需氧微生物，惰性气体有一定的抑菌作用用压缩空气或空气来代替惰性气体培养基灌装量偏少西林瓶内壁不能被完全接触，微生物不能生长10ml西林瓶灌装至少2 4m l培养基，以保证足够量培养基用于微生物和西林瓶接触和培养3434中间过程风险点风险点解释解释控制方法控制方法对设备的清洗、消毒和灭菌消毒剂会杀灭微生
14、物对设备的清洗、消毒和灭菌在灌装前后进行，灌装前进行消毒要避免设备上的消毒剂残留正常生产时消毒剂（如喷洒消毒酒精，对操作人员手部消毒）的使用消毒剂会杀灭微生物对于模拟试验过程中消毒剂（如喷洒消毒酒精）的使用，应该注意不能超出正常生产时的使用频率，不能将消毒剂直接接触到培养基上班次轮换，清场消毒消毒剂会杀灭微生物对于两班次灌装，中间不进行消毒清场。3535冻干风险点风险点解释解释控制方法控制方法抽真空过低真空度有抑菌作用。过低真空度还会导致培养基失水灌装好的西林瓶放人冻干机，放置适当时间后模拟冻干过程（时间需适中，防止损失过多水分而影响微生物生长的特性。在模拟冻干过程中需要抽真空引发空气流动，再
15、通过无菌空气达到气流平衡（推荐的抽真空值为至少500mbar,这样的操作一般为2 次）低温冷冻低温会抑制微生物生长不达到冷冻条件，保持常温36363737培养温度应适宜于一般微生物及环境分离菌的恢复生长。例如先在2025最少培养7天，然后在3035的范围继续培养7天。应由经过培训并有检査培养基灌装瓶污染经验的人员对样品进行逐个目视检査。在检查中，所有被怀疑受到污染的样品，应立即交给微生物专业人员进行鉴定处理。为检出微生物的生长，最好用清晰透光的容器或具有类似物理性质的容器，而不用琥珀色（黄色）或其他不透明容器。3838（一）灌装数量少于5000支时，不得检出污染品。（二）灌装数量在5000至1
16、0000支时：1.有1支污染，需调查，可考虑重复试验；2.有2支污染，需调查后，进行再验证。（三）灌装数量超过10000支时：1.有1支污染，需调查；2.有2支污染，需调查后，进行再验证。（四）发生任何微生物污染时，均应当进行调查。3939培养基灵敏度检查实验：使用完成14天培养的灌装前期培养基样品 用枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠球菌、铜绿假单胞菌、黑曲霉和环境菌作为阳性菌 将每个菌种准备含100cfu/0.1ml的菌液，每个菌种接种2支培养基样品，同时并平板计数 对真菌在20-25C下培养，对细菌在30-35 C下培养，每天检查，5天内需有生长迹象40404141环境微生物监测数据
17、，空气悬浮粒子监测数据CIP设备，清洁、消毒程序的执行情况培养基、设备和零件的灭菌工艺，灭菌釜的校正情况高效过滤器检测(空气悬浮粒子水平，过滤器检漏，风速测量，密封系统检查，使用年限等)除菌过滤器完好性房间气流型式与压差人员操作技术培训情况4242以往产品无菌检查实验结果人员卫生状况监测数据培养基灌装实验中的干预方式分析该区域近期是否有过维修活动，生产线的改造情况该生产线培养基灌封实验历史数据已灭菌物品的储存条件培养基灌封过程中的异常事件阳性污染菌与环境监测污染菌的鉴别4343污染可能来源于液体培养基污染可能来源于液体培养基(如与培养基贮罐非无菌连接，如与培养基贮罐非无菌连接，在循环管路中受到
18、污染，微生在循环管路中受到污染，微生物持续繁殖物持续繁殖)。在灌装结束时，。在灌装结束时，应注意保持培养基贮罐处于无应注意保持培养基贮罐处于无菌密闭状态，在储罐内取样测菌密闭状态，在储罐内取样测 试，可以核实这样的假设。试，可以核实这样的假设。灌装过程灌装过程(时间或灌装数量时间或灌装数量)污污染染 率率在灌装过程中污染率上升在灌装过程中污染率上升 4444污污染染 率率灌装过程灌装过程(时间或灌装数量时间或灌装数量)表明污染仅发生在试验初表明污染仅发生在试验初期，可能污染来自起始的期，可能污染来自起始的生产设备中（生产设备中（胶塞容器胶塞容器/轨道轨道,计量泵计量泵/针头针头)，在，在灌装过
19、程中污染被部分或灌装过程中污染被部分或全部全部“清洗掉清洗掉”。在灌装过程中污染率下降在灌装过程中污染率下降 4545污污染染 率率灌装过程灌装过程(时间或灌装数量时间或灌装数量)出现一个尖峰（在短时段的出现一个尖峰（在短时段的一些产品被污染）可能与在一些产品被污染）可能与在灌装过程中不正确操作或干灌装过程中不正确操作或干预导致的污染有关。很关键预导致的污染有关。很关键的是必须知道被污染产品灌的是必须知道被污染产品灌装的准确时间，以及当时实装的准确时间，以及当时实施的干预措施（灌装操作过施的干预措施（灌装操作过程的录像是非常有用的），程的录像是非常有用的），样会比较容易调查到原因。样会比较容易
20、调查到原因。在灌装过程中污染率出现尖峰在灌装过程中污染率出现尖峰4646污污染染 率率灌装过程灌装过程(时间或灌装数量时间或灌装数量)同样可能是某个如果错误同样可能是某个如果错误的干预措施所造成的，不的干预措施所造成的，不同的是该污染影响到液体同的是该污染影响到液体的管路的管路/回路时（如培养基回路时（如培养基贮罐的变化，泵或针的替贮罐的变化，泵或针的替换），导致微生物持续换），导致微生物持续繁繁殖。殖。污染率出现尖峰后，呈上升趋势污染率出现尖峰后，呈上升趋势 4747污污染染 率率灌装过程灌装过程(时间或灌装数量时间或灌装数量)非常不幸的是，这种现象是非常不幸的是，这种现象是最常出现的，也是
21、最难调查最常出现的，也是最难调查的。如果这种现象在多次试的。如果这种现象在多次试验中反复出现，可能说明这验中反复出现，可能说明这个工艺存在不确定因素，需个工艺存在不确定因素，需要采取根本的措施（如要采取根本的措施（如 更更衣衣/着装、消毒剂和气流模着装、消毒剂和气流模式的改变式的改变)。孤立事件孤立事件(试验中少数污染试验中少数污染)48484949如何判断哪些灌装样品不需要进行培养？破损，影响到密封性的样品 完整性测试（泄漏测试）失败的样品 文件中明确规定予以丢弃的中控测试样品 设备自动剔除的样品 文件中明确规定，每次干扰后应予手工剔除的样品（规定应详细、明确，并需证明其可操作性和稳定可信性）。剔除的样品应进行记录注明丢弃原因5050是否需要厌氧工艺的模拟灌装实验？如果工艺中存在冲氮气等惰性气体操作时；如果在培养基灌装培养的样品中检出厌氧菌。5151培养基灌装试验中的样品在培养过程中是否需要进行翻转？不需要。培养基灌装的样品应在开始培养前进行操作，使培养基充分接触到内部各个表面，开始培养后不应再进行翻转等干扰。5252什么情况下，可以认为培养基灌装试验无效？阳性对照失败；工艺过程中在无菌操作区发生重大偏差，如停电，高效过滤器损坏等。
