1、微生物学实验微生物学实验武汉工业学院武汉工业学院生物与制药工程学院生物与制药工程学院课程组人员课程组人员:缪礼鸿缪礼鸿 胡申才胡申才 代江红代江红 周帼萍周帼萍 曾驰曾驰制作人员制作人员:胡申才胡申才 一、课一、课 程程 简简 介介 微生物学实验课是微生物学课程教学中的一个重要环微生物学实验课是微生物学课程教学中的一个重要环节。本课程总计节。本课程总计4848学时，使用教材是沈萍主编的学时，使用教材是沈萍主编的微生物学微生物学实验实验（第三版）。通过本课程的学习，使学生了解微生物（第三版）。通过本课程的学习，使学生了解微生物学的基本知识；巩固和加深所学理论知识；掌握微生物学最学的基本知识；巩固
2、和加深所学理论知识；掌握微生物学最基本的操作技能。同时，通过实验，培养学生培养学生独立基本的操作技能。同时，通过实验，培养学生培养学生独立思考和理论联系实际能力；养成实事求是、严肃认真的科学思考和理论联系实际能力；养成实事求是、严肃认真的科学态度，以及敢于创新的开拓精神；并在实验中进一步提高学态度，以及敢于创新的开拓精神；并在实验中进一步提高学生的科学素质修养。生的科学素质修养。二、二、微生物与实际应用微生物与实际应用微生物与发酵工程微生物与发酵工程微生物与环境工程微生物与环境工程微生物与农业微生物与农业微生物与医学领域微生物与医学领域微生物与食品工业微生物与食品工业三、微生物学与三、微生物学
3、与NobelNobel奖奖 到目前为止，几十项到目前为止，几十项NobelNobel生理学和医生理学和医学奖，化学奖都与微生物学有关学奖，化学奖都与微生物学有关 参考：沈萍教授参考：沈萍教授微生物学微生物学绪论部分绪论部分 NobelNobel获奖者全书获奖者全书四、如何进行微生物学实验四、如何进行微生物学实验 严肃认真严肃认真 科学态度科学态度 分析问题分析问题 搞清原理搞清原理五、微生物实验安排与考核五、微生物实验安排与考核基础实验：基础实验：80%80%，1 12 2次，一次考试次，一次考试自主设计实验：自主设计实验：20%20%设计实验方案设计实验方案 实验操作实验操作 总结总结 汇报
4、汇报课堂纪律课堂纪律 严格遵守实验室规章制度 严肃课堂纪律 不允许无故旷课、早退（1次）迟到（3次）工作服实验室安全和卫生实验室安全和卫生 安全实验室严禁吸烟。注意用水、防电和防火正确使用化学试剂和仪器u卫生每次实验需留下6位同学值日，协助保持实验室清洁实验一实验一 显微镜使用及简单染色显微镜使用及简单染色实验二实验二 细菌革兰氏染色细菌革兰氏染色实验三实验三 荚膜与芽孢染色荚膜与芽孢染色 实验四实验四 放线菌和蓝细菌的形态观察放线菌和蓝细菌的形态观察实验五实验五 霉菌形态特征霉菌形态特征 实验六实验六 酵母菌形态观察、死活细胞鉴别酵母菌形态观察、死活细胞鉴别 及细胞大小测定及细胞大小测定实验
5、七实验七 微生物的数量测定微生物的数量测定实验八实验八 玻璃器皿的洗涤、包扎、灭菌及玻璃器皿的洗涤、包扎、灭菌及 无菌操作台的使用无菌操作台的使用 实实 验验 内内 容容实验九实验九 培养基的配制和灭菌培养基的配制和灭菌实验十实验十 芽孢杆菌的分离纯化及观察芽孢杆菌的分离纯化及观察实验十一实验十一 抗稻瘟霉的芽孢杆菌的分离及筛选抗稻瘟霉的芽孢杆菌的分离及筛选实验十二实验十二 食品或水中大肠菌群的检测食品或水中大肠菌群的检测实验十三实验十三 微生物生长曲线的测定微生物生长曲线的测定实验十四实验十四 细菌质粒的接合转移与检测细菌质粒的接合转移与检测实验十五实验十五 微生物菌种保藏技术微生物菌种保藏
6、技术显微镜概述显微镜概述 微生物的个体微小，必须借助显微镜才能观察到。因微生物的个体微小，必须借助显微镜才能观察到。因此，显微镜就成为微生物学研究工作者不可缺少的基本工此，显微镜就成为微生物学研究工作者不可缺少的基本工具。所以，了解显微镜的种类、结构、功能和正确地掌握具。所以，了解显微镜的种类、结构、功能和正确地掌握不同显微镜的使用方法是很有必要的。不同显微镜的使用方法是很有必要的。显微镜可分为光学显微镜和电子显微镜两大类。光学显微镜可分为光学显微镜和电子显微镜两大类。光学显微镜有普通光学显微镜、相差显微镜、微分干涉差显微显微镜有普通光学显微镜、相差显微镜、微分干涉差显微镜、暗视野显微镜、紫外
7、光显微镜、偏光显微镜和荧光显镜、暗视野显微镜、紫外光显微镜、偏光显微镜和荧光显微镜。下面主要介绍普通光学显微镜。微镜。下面主要介绍普通光学显微镜。实验一实验一 显微镜使用及显微镜使用及微生物形态观察微生物形态观察一、目的要求一、目的要求1.1.学习显微镜的结构、功能和使用方法。学习显微镜的结构、功能和使用方法。2.2.学习并掌握油镜的原理和使用方法。学习并掌握油镜的原理和使用方法。基础知识基础知识 尼康E-600显微镜 二、显微镜的基本结构及油镜的二、显微镜的基本结构及油镜的工作原理工作原理1.1.普通生物显微镜普通生物显微镜由由3 3部分构成：部分构成：照明系统：包括光源和聚光器。照明系统：
8、包括光源和聚光器。光学放大系统：由物镜和目镜组光学放大系统：由物镜和目镜组成，是显微镜的主体。成，是显微镜的主体。机械装置：用于固定材料和观察机械装置：用于固定材料和观察方便，包括镜台方便，包括镜台(载物台载物台)、调节、调节器和、物镜转换器器和、物镜转换器(旋转器旋转器)。与其他物镜不同，油镜需在载玻片与镜头之间与其他物镜不同，油镜需在载玻片与镜头之间加滴镜油，原因有二：加滴镜油，原因有二：1.增加照明亮度增加照明亮度 油镜的放大倍数可达油镜的放大倍数可达100 x，教具很短，直，教具很短，直径很小，但所需要的光照强度却最大。为径很小，但所需要的光照强度却最大。为了不使通过的光线有所损失，必
9、须造又精了不使通过的光线有所损失，必须造又精于加入与玻璃的折射率（于加入与玻璃的折射率（n=1.55）相仿的）相仿的镜油。通常用香柏油（镜油。通常用香柏油（n=1.52）.2.增加显微镜的分辨率增加显微镜的分辨率 油镜的分辨率可达到油镜的分辨率可达到0.2m左右。左右。2.2.显微操作技术显微操作技术 尼康尼康NT-88NENT-88NE显微操作显微操作/注射仪注射仪 显微镜的分辨率显微镜的分辨率:也称为分辨力，它是指能把两个物点辨清的最小距离，也称为分辨力，它是指能把两个物点辨清的最小距离，分辨距离越大，则分辨率越低。所以，分辨率是以分辨分辨距离越大，则分辨率越低。所以，分辨率是以分辨 距离
10、来表示的。距离来表示的。其计算公式为其计算公式为:D=0.61:D=0.61入入/N/NA NA NA A=n=n sina/2 sina/2 式中式中D D为分辨率，为分辨率，A A为光波波长，为光波波长，N NA A为物镜的数值孔径为物镜的数值孔径(镜口率镜口率)。在物镜上，有镜口率在物镜上，有镜口率(N.A.)(N.A.)的标志，它反应该镜头的标志，它反应该镜头分辨力的大小，其数字越大，表示分辨率越高，各物分辨力的大小，其数字越大，表示分辨率越高，各物镜的镜口率如下表：镜的镜口率如下表：物镜物镜 镜口率镜口率(N.A.)(N.A.)工作距离工作距离(mm)(mm)10 10 0.25 5
11、.40 0.25 5.40 40 40 0.65 0.39 0.65 0.39 100 100 1.30 0.11 1.30 0.11 显微镜的总放大倍数显微镜的总放大倍数等于目镜和物镜放大倍数的乘积，公式为:M=K1xK2 焦点深度焦点深度:显微镜调焦到看清标本某一显微镜调焦到看清标本某一点时，不仅是这一物点，而且它的上下两点时，不仅是这一物点，而且它的上下两侧也能看清楚两侧的厚度叫做侧也能看清楚两侧的厚度叫做焦点深度焦点深度。看到标本的全厚度，必须调节螺旋仔细地看到标本的全厚度，必须调节螺旋仔细地从上到下进行观察从上到下进行观察。三、三、实验步骤实验步骤(一一)显微镜的使用显微镜的使用 1
12、.1.观察前的准备工作观察前的准备工作 (1)(1)观察者要养成显微镜镜检的工作习惯，观察时观察者要养成显微镜镜检的工作习惯，观察时要双眼同时睁开，一边观察一边进行记录或描绘。要双眼同时睁开，一边观察一边进行记录或描绘。(2)(2)观察时所用的材料、药品和各种器具要预先准观察时所用的材料、药品和各种器具要预先准备好。备好。(3)(3)显微镜在使用之前应检查一下它的各个部件是显微镜在使用之前应检查一下它的各个部件是否完整和正常，并对载物台、目镜、物镜以及聚光器否完整和正常，并对载物台、目镜、物镜以及聚光器上端透镜进行必要的清洁工作。然后进行合轴调节。上端透镜进行必要的清洁工作。然后进行合轴调节。
13、瞳瞳 距距 调调 节节2.2.显微镜的调节显微镜的调节屈屈 光光 度度 调调 节节调节调节粗粗 调调 松松 紧紧 调调 节节 旋旋 钮钮聚聚 光光 镜镜 中中 心心 调调 节节孔径光栏调节孔径光栏调节N.A聚=(0 0.6-06-0.8 8)N.A物操作步骤如下操作步骤如下:(1 (1）可变光栏的中心对准聚光镜的中心。如果可变光栏的水）可变光栏的中心对准聚光镜的中心。如果可变光栏的水平是固定的，则装配时已保证它与聚光镜合轴，不必调整平是固定的，则装配时已保证它与聚光镜合轴，不必调整;如果如果可变光栏的水平位置可以移动，则应把可变光栏关到最小，使它可变光栏的水平位置可以移动，则应把可变光栏关到最
14、小，使它的中心孔对准聚光镜下方的透镜中心。的中心孔对准聚光镜下方的透镜中心。(2)(2)载物台上放置观察标本，把聚光器上升到它上端透镜平载物台上放置观察标本，把聚光器上升到它上端透镜平面稍低于载物台平面的高度，并将它的可变光栏开到最大，用低面稍低于载物台平面的高度，并将它的可变光栏开到最大，用低倍物镜，进行调焦到能看见标本，可调反射镜使视野得到最亮和倍物镜，进行调焦到能看见标本，可调反射镜使视野得到最亮和最均匀最均匀 的照明，或把光栏关小，最亮的照明区正处在视野的中的照明，或把光栏关小，最亮的照明区正处在视野的中央。央。(3)(3)转到高倍镜，并调焦到看清标本，然后去掉标本，拔出转到高倍镜，并
15、调焦到看清标本，然后去掉标本，拔出目镜，眼睛直接向镜筒观察，并把可变目镜，眼睛直接向镜筒观察，并把可变 光栏关小，看其亮点是光栏关小，看其亮点是否在视野中心，如果不是，就要转动聚光器的调节螺旋，把亮点否在视野中心，如果不是，就要转动聚光器的调节螺旋，把亮点调到视野中调到视野中 央，再慢慢开启可变光栏，使视野看到光栏边缘和央，再慢慢开启可变光栏，使视野看到光栏边缘和聚光镜的边缘相接为止。聚光镜的边缘相接为止。3.3.观察操作观察操作(1)(1)低、高倍镜的使用低、高倍镜的使用:先把低倍的物镜用粗调焦螺旋下降至离盖玻片先把低倍的物镜用粗调焦螺旋下降至离盖玻片0.5cm0.5cm处，然后一边观察视野
16、一边上升物镜，直至看到图像，再将标本移处，然后一边观察视野一边上升物镜，直至看到图像，再将标本移到视野中心，用细调焦螺旋把物镜调至最清晰处，若要用高倍镜观察时，到视野中心，用细调焦螺旋把物镜调至最清晰处，若要用高倍镜观察时，把所要进一步放大观察的部位移至视野中央，直接顺时针转换成高倍物镜，把所要进一步放大观察的部位移至视野中央，直接顺时针转换成高倍物镜，然后用细调焦螺旋调焦，至看清物像。然后用细调焦螺旋调焦，至看清物像。（1 1）不准擅自拆卸显微镜的任何部件）不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。以免损坏。（2 2）镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，）镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布
17、，以保证光洁度以保证光洁度（3 3）观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，）观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当目视接目镜时，特别在使用油最后用油镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。损伤镜面。（4 4）拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜）拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿，更不可倾斜拿。座，不可单手拿，更不可倾斜拿。（5 5）显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生）显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐蚀镜片霉菌而腐蚀镜片。4 4、显微镜保养和使用中的注意事项、显
18、微镜保养和使用中的注意事项（二）（二）简单染色简单染色1.1.定义定义 是只用一种染料使细菌着色以显示其形是只用一种染料使细菌着色以显示其形态，不能辨别细菌细胞的构造，通常采用态，不能辨别细菌细胞的构造，通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红 等）等）使其着色。使其着色。Simple stains 菌种：菌种：培养培养12-16h的枯草杆菌（的枯草杆菌（Bacillus subtilis），培养），培养24小时的大肠杆菌小时的大肠杆菌（Escherichia coli）染色液和试剂：染色液和试剂：草酸铵结晶紫染液、卢草酸铵结晶紫染液、卢哥氏碘液、哥氏碘液、
19、95%酒精、蕃红染液、复红、酒精、蕃红染液、复红、乙醚酒精溶液、香柏油、无菌水乙醚酒精溶液、香柏油、无菌水 器材：器材：废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜等。酒精灯、擦镜纸、显微镜等。2.2.实验器材实验器材1 1、简单染色、简单染色3.3.实验方法：实验方法：制片制片染色染色水洗水洗干燥干燥镜检镜检（1）制片：）制片：取菌种培养物取菌种培养物常规涂片常规涂片、自然、自然干燥、加热固定；干燥、加热固定；注意无菌注意无菌操作操作（2）染色：）染色：将固定过的涂片放在废液缸上的搁将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上，加复红染色架上，加复红染色1-2mi
20、n。（3）水洗：）水洗：用水洗去涂片上的染色液。用水洗去涂片上的染色液。（4）干燥：）干燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或用将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。吸水纸吸干。（5）镜检：）镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。细菌的形态。四、记录实验结果四、记录实验结果 绘图绘图五、五、思考题思考题 1.1.使用油镜时，为使么选用香柏油或液体石蜡作使用油镜时，为使么选用香柏油或液体石蜡作为物镜与
21、玻片间的介质？其他液体行吗？为物镜与玻片间的介质？其他液体行吗？2.2.油镜用毕后，为什么必须把镜油擦净？用过多油镜用毕后，为什么必须把镜油擦净？用过多的二甲苯或用酒精擦镜有什么危害？的二甲苯或用酒精擦镜有什么危害？3.3.什么是物镜的同焦现象？他在显微镜观察中有什么是物镜的同焦现象？他在显微镜观察中有什么意义？什么意义？4.4.观察时为什么要用左眼，并且两眼都应睁开？观察时为什么要用左眼，并且两眼都应睁开？（一）实验目的（一）实验目的（二）实验原理（二）实验原理（三）实验器材（三）实验器材（四）实验方法（四）实验方法（五）注意事项（五）注意事项（六）实验作业（六）实验作业实验二实验二 细菌革
22、兰氏染色细菌革兰氏染色（一）实验目的（一）实验目的1 1、学习微生物涂片、染色的操作技术；、学习微生物涂片、染色的操作技术；2 2、掌握细菌单染色和革兰氏染色的方法；、掌握细菌单染色和革兰氏染色的方法；3 3、初步掌握无菌操作技术；、初步掌握无菌操作技术；4 4、掌握革兰氏染色反应原理、操作步骤和、掌握革兰氏染色反应原理、操作步骤和意义。意义。1.1.革兰氏染色法革兰氏染色法 是是18841884年由丹麦病理学家年由丹麦病理学家C.GramC.Gram所创立所创立的。革兰氏染色法是细菌学上最常用的鉴别的。革兰氏染色法是细菌学上最常用的鉴别染色法，因为通过此法染色，可将细菌鉴别染色法，因为通过此
23、法染色，可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌（为革兰氏阳性菌（G G+）和革兰氏阴性菌（）和革兰氏阴性菌（G G-）两大类。两大类。（二）实验内容及原理（二）实验内容及原理1234？结晶紫结晶紫碘液碘液酒精酒精复红复红革兰氏染色的机理：革兰氏染色的机理：主要由于两类细菌的主要由于两类细菌的细胞壁成分和结构不同细胞壁成分和结构不同。1 1、菌种：、菌种：培 养培 养 12-16h的 枯 草 杆 菌的 枯 草 杆 菌（Bacillus subtilis），培养），培养24小时的大肠小时的大肠杆菌（杆菌（Escherichia coli）2 2、染色液和试剂：、染色液和试剂：草酸铵结晶紫染液、草酸铵结晶紫染液
24、、卢哥氏碘液、卢哥氏碘液、95%酒精、蕃红染液、复红、酒精、蕃红染液、复红、乙醚酒精溶液、香柏油、无菌水乙醚酒精溶液、香柏油、无菌水 3 3、器材：、器材：废液缸、洗瓶、载玻片、接种废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜等。杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜等。（三）实验器材（三）实验器材1 1、革兰氏染色、革兰氏染色制片制片初染初染（结晶紫（结晶紫1min）水洗水洗媒染媒染（碘液（碘液1min）水洗水洗脱色脱色（乙醇（乙醇20-30s）水洗水洗复染复染（番红（番红2min）水洗水洗干燥干燥观察观察(四）实验方法：四）实验方法：crystal violet stain wash with
25、 water Stain with grams iodine solution Decolorize by adding 95%alcohol 革兰氏阴性杆菌革兰氏阴性杆菌革兰氏阳性杆菌革兰氏阳性杆菌 Counterstain with Safranin 将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净：将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净：a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。b.用擦镜纸沾少许用擦镜纸沾少许乙醚乙醚-乙醇混合乙醇混合液将镜头擦液将镜头擦2-3次。次。c.再用干净的擦镜纸将镜头擦再用干净的擦镜纸将镜头擦2-3次。注意擦镜头时次。注意擦镜头时向一个方向擦拭。将显微镜小心轻
26、拿，按号放入显向一个方向擦拭。将显微镜小心轻拿，按号放入显微镜柜中。微镜柜中。观察后的染色玻片用废纸将香柏油擦干观察后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净，放入回收容器内。净，放入回收容器内。（1010）实验完毕后的处理）实验完毕后的处理 1、载玻片要洁净无油迹。涂片时，滴水不、载玻片要洁净无油迹。涂片时，滴水不要过多，挑菌量宜少，涂片要均匀，菌膜要过多，挑菌量宜少，涂片要均匀，菌膜宜薄。宜薄。2、革兰氏染色成败的关键是、革兰氏染色成败的关键是酒精脱色酒精脱色。？（五）注意事项（五）注意事项 3、染色过程中勿使染色液干涸。、染色过程中勿使染色液干涸。4、选用幼龄的细菌。、选用幼龄的细菌。（六）实验作
27、业（六）实验作业 绘出绘出枯草杆菌枯草杆菌和和大肠杆菌大肠杆菌的形态图，并注明的形态图，并注明两菌的革兰氏染色的反应性。两菌的革兰氏染色的反应性。1你认为哪些环节会影响革你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？键的环节是什么？2当你对一株未知菌进行革当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确证你的染色兰氏染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠？技术操作正确，结果可靠？（一）实验目的（一）实验目的（二）实验原理（二）实验原理（三）实验器材（三）实验器材（四）实验方法（四）实验方法（五）注意事项（五）注意事项（六）实验作业（六）实
28、验作业（一）实验目的（一）实验目的1 1、继续学习微生物标本的制作方法；、继续学习微生物标本的制作方法；2 2、掌握芽孢、荚膜染色的基本原理及方法、掌握芽孢、荚膜染色的基本原理及方法;3 3、巩固无菌操作技术。、巩固无菌操作技术。（二）实验原理（二）实验原理 芽孢、荚膜染色法都是利用细菌各部位芽孢、荚膜染色法都是利用细菌各部位（分）的构造不同，它们对染料的亲和力也不（分）的构造不同，它们对染料的亲和力也不同。因此，可以采用各种特殊染色方法，使细同。因此，可以采用各种特殊染色方法，使细菌细胞的不同构造能在显微镜下显示出来，便菌细胞的不同构造能在显微镜下显示出来，便于观察和区别。于观察和区别。芽孢
29、芽孢 又称内生孢子（又称内生孢子（endospore），是某），是某些细菌（革兰氏染色阳性杆菌）生长到一定时些细菌（革兰氏染色阳性杆菌）生长到一定时间（对数期后期），在细胞内形成一个圆形、间（对数期后期），在细胞内形成一个圆形、椭圆形或圆柱形的结构。椭圆形或圆柱形的结构。芽孢有的长在中央或近中央，圆形或芽孢有的长在中央或近中央，圆形或椭圆形，芽孢的大小，位置，在分类鉴定椭圆形，芽孢的大小，位置，在分类鉴定上有一定的意义，它仅仅是芽孢细菌生活上有一定的意义，它仅仅是芽孢细菌生活史的一个环节，它还是检验培养基灭菌彻史的一个环节，它还是检验培养基灭菌彻底不彻底的依据。底不彻底的依据。中央芽孢中央芽孢
30、偏端芽孢偏端芽孢游离芽孢游离芽孢末端芽孢末端芽孢芽孢染色原理芽孢染色原理 芽孢壁厚、透性低，着色和脱色均较芽孢壁厚、透性低，着色和脱色均较困难，当用弱碱性染料（孔雀绿）在加热的困难，当用弱碱性染料（孔雀绿）在加热的情况下进行染色时，使染料不仅进入菌体也情况下进行染色时，使染料不仅进入菌体也可进入芽孢内，可进入芽孢内，进入菌体的染料经水洗后被进入菌体的染料经水洗后被脱色，当用对比度大的复染色剂（蕃红液）脱色，当用对比度大的复染色剂（蕃红液）染色后，芽孢仍保留初染剂的颜色，是芽孢染色后，芽孢仍保留初染剂的颜色，是芽孢和菌体更易区分。菌体呈红色而芽孢呈绿色。和菌体更易区分。菌体呈红色而芽孢呈绿色。荚
31、膜荚膜是包围在细菌细胞外的一层粘液状或胶是包围在细菌细胞外的一层粘液状或胶状物质，其成分为多糖、糖蛋白或多肽。由状物质，其成分为多糖、糖蛋白或多肽。由于荚膜与染料的亲和力弱、不易着色；而且于荚膜与染料的亲和力弱、不易着色；而且可以溶于水，易在用水冲洗时被除去。可以溶于水，易在用水冲洗时被除去。荚膜虽不是细胞的荚膜虽不是细胞的主要结构，但它是细胞主要结构，但它是细胞外碳源和能源性贮藏物外碳源和能源性贮藏物质，并能保护细胞免受质，并能保护细胞免受干燥的影响，同时能增干燥的影响，同时能增加某些病原菌的致病能加某些病原菌的致病能力，使之抵御宿主吞噬力，使之抵御宿主吞噬细胞的吞噬。细胞的吞噬。荚膜染色原
32、理荚膜染色原理 由于荚膜与染料的亲和力弱、不易着由于荚膜与染料的亲和力弱、不易着色；而且可以溶于水，易在用水冲洗时被色；而且可以溶于水，易在用水冲洗时被除去。通常用除去。通常用负染色法负染色法染色，染色，使细菌和背使细菌和背景着色，背景与菌体之间形成一透明区即景着色，背景与菌体之间形成一透明区即荚膜，便于观察，由于荚膜很薄，容易变荚膜，便于观察，由于荚膜很薄，容易变形，在制片是一般不用加热固定。形，在制片是一般不用加热固定。1、菌种：、菌种：蜡样芽孢杆菌约蜡样芽孢杆菌约2 d 营养琼脂斜营养琼脂斜面培养物；褐球固氮菌面培养物；褐球固氮菌(Azotobacter chroococcus)约约2
33、d 无氮营养基琼脂斜面培无氮营养基琼脂斜面培养物。养物。2、染色液和试剂：、染色液和试剂：5孔雀绿水溶液、孔雀绿水溶液、0.5蕃红溶液、碳素墨水、甲醇、生理盐水蕃红溶液、碳素墨水、甲醇、生理盐水等；等；3、器材：、器材：试管夹、酒精灯、接种针、载试管夹、酒精灯、接种针、载玻片、显微镜、香柏油、乙醚酒精、擦镜玻片、显微镜、香柏油、乙醚酒精、擦镜纸等。纸等。（三）实验器材（三）实验器材制片制片染色染色（孔雀绿（孔雀绿5min）水洗水洗复染复染（蕃红花红（蕃红花红2-3min）水洗水洗干燥干燥镜检镜检1 1、芽孢染色、芽孢染色(四）实验方法：四）实验方法：切勿煮干切勿煮干芽孢染色结果芽孢染色结果（芽
34、孢呈绿色，营养体及芽孢囊呈红色）（芽孢呈绿色，营养体及芽孢囊呈红色）2 2、荚膜染色、荚膜染色（湿墨水法）（湿墨水法）（1）制备菌和墨水混合液：）制备菌和墨水混合液：加一滴墨水于洁加一滴墨水于洁净的载玻片上，然后挑取少量褐球固氮菌与之净的载玻片上，然后挑取少量褐球固氮菌与之充分混合均匀；充分混合均匀；（2）加盖玻片：）加盖玻片：将一洁净盖波片盖在混合液将一洁净盖波片盖在混合液上，然后在盖波片上放一张滤纸，轻轻按压以上，然后在盖波片上放一张滤纸，轻轻按压以吸去多余的混合液；吸去多余的混合液；（3）镜检：）镜检：用低倍镜和高倍镜观察。用低倍镜和高倍镜观察。荚膜染色结果荚膜染色结果 背景灰色，菌体较
35、暗，在其周围呈现一明亮的透背景灰色，菌体较暗，在其周围呈现一明亮的透明圈即荚膜。明圈即荚膜。1、供芽孢染色用的菌种应控制菌龄，使大部、供芽孢染色用的菌种应控制菌龄，使大部分芽孢仍保留在菌体上为宜。分芽孢仍保留在菌体上为宜。2、染色加热过程要及时补充染液，切勿让涂、染色加热过程要及时补充染液，切勿让涂片干涸。片干涸。3、荚膜染色涂片不要用加热固定，以免荚膜、荚膜染色涂片不要用加热固定，以免荚膜皱缩变形。皱缩变形。4、涂片不要用力过猛，不要滴加水，以防破、涂片不要用力过猛，不要滴加水，以防破坏其荚膜原形。坏其荚膜原形。（五）注意事项（五）注意事项（六）实验作业（六）实验作业 1 绘出表示绘出表示芽
36、孢杆菌芽孢杆菌的形态特征，注意芽的形态特征，注意芽孢的形状、着生位置及芽孢囊的形态特征。孢的形状、着生位置及芽孢囊的形态特征。2 绘图说明你所观察到的细菌的菌体和荚绘图说明你所观察到的细菌的菌体和荚膜的形态。膜的形态。1若涂片中观察到的只是大量游离芽孢，若涂片中观察到的只是大量游离芽孢，很少看到芽孢囊及营养细胞，你认为这是什么很少看到芽孢囊及营养细胞，你认为这是什么原因原因?2组成荚膜的成分是什么组成荚膜的成分是什么?涂片一般用涂片一般用什么固定方法，为什么什么固定方法，为什么?实验四实验四 放线菌和蓝细菌形态的观察放线菌和蓝细菌形态的观察 目的要求目的要求 实验材料实验材料 实验程序实验程序
37、 思考题思考题一、目的要求一、目的要求 学习观察放线菌的基本方法学习观察放线菌的基本方法 加深理解放线菌的形态特征加深理解放线菌的形态特征二、实验原理二、实验原理 群体和个体形态群体和个体形态 形态观察方法形态观察方法I 放线菌形态的观察放线菌形态的观察Filamentous Actinomycetes Typical appearance of a streptomycete growing on agar slants The colors are due to the production of pigmentsFilamentous Actinomycetes Antibiotic a
38、ction of soil microorganisms on a crowded platestreptomycetesBacillusFilamentous Actinomycetes Stages in the conversion of a streptomycetes(链霉菌)aerial hypha into spores(conidia)Various typesof spore-bearingstructures in thestreptomycetesFilamentous Actinomycetes Several spore-bearing structures of a
39、ctinomycetes:Streptomyces.Filamentous Actinomycetes A young colony of an actinomycete of the genus Nocardia(奴卡(氏)(放线)菌属)1 1、插片染色法、插片染色法2828插片培养插片培养4 4-6d6d，轻轻取出盖玻，轻轻取出盖玻片，片，直接观察直接观察镜检。镜检。观察菌丝和孢子丝自然生长的性状，观察菌丝和孢子丝自然生长的性状，其中包括气生菌丝（较粗）、基内其中包括气生菌丝（较粗）、基内菌丝（较细）和孢子丝的形状，如菌丝（较细）和孢子丝的形状，如分枝状况及孢子丝的卷曲等，并绘分枝状况及孢
40、子丝的卷曲等，并绘图说明。图说明。首先寻找插在培养基的界面分界线，首先寻找插在培养基的界面分界线，观察营养菌丝、气生菌丝形态及分观察营养菌丝、气生菌丝形态及分枝情况。枝情况。调节亮度调节亮度直接镜检直接镜检 （二）观察方法（二）观察方法2.2.印片染色法印片染色法 微热载玻片印片微热载玻片印片 固定固定 石炭酸复红染色石炭酸复红染色1 1min min 水洗晾干油镜水洗晾干油镜三、三、实验材料实验材料 放线菌放线菌培养物：培养物：天蓝色链霉菌天蓝色链霉菌4 4天培养天培养物。物。显微镜、载玻片、接种环、解剖针、显微镜、载玻片、接种环、解剖针、解剖刀、酒精灯、镊子等。解剖刀、酒精灯、镊子等。酒精
41、、蒸馏水等。酒精、蒸馏水等。四、实验步骤四、实验步骤1.1.印片法：印片法：（1 1）接种培养）接种培养 用高氏用高氏1 1号培养基平板，常规划线接种，号培养基平板，常规划线接种，2828下培养下培养4-74-7天。天。（2 2）印片）印片 用灭菌的小刀用灭菌的小刀(或刀片或刀片)挑取有单一菌落的培养基一挑取有单一菌落的培养基一小块，放在洁净的载玻片上。用镊子取一洁净载玻片，在火小块，放在洁净的载玻片上。用镊子取一洁净载玻片，在火馅上稍微加热，然后把玻片盖放在带菌落的培养基小块上，馅上稍微加热，然后把玻片盖放在带菌落的培养基小块上，再用小镊子轻轻压几下，使菌落的部分菌丝体（气生菌丝，再用小镊子
42、轻轻压几下，使菌落的部分菌丝体（气生菌丝，孢子丝或孢子）压在载玻片上。孢子丝或孢子）压在载玻片上。（3 3）固定：载玻片有印迹的一面向上，通过酒精灯火焰三次固）固定：载玻片有印迹的一面向上，通过酒精灯火焰三次固定。定。（4 4）染色）染色 用石炭酸复红覆盖印迹，染色用石炭酸复红覆盖印迹，染色1-2min1-2min后水洗。后水洗。（5 5）镜检）镜检 干后用油镜观察。干后用油镜观察。1.异形胞异形胞是由营养细胞组成的，一般比营养细胞大，在光学显微镜是由营养细胞组成的，一般比营养细胞大，在光学显微镜下观察，细胞内是空的。形成异形胞时，细胞内的贮藏颗下观察，细胞内是空的。形成异形胞时，细胞内的贮藏
43、颗粒溶解，光合作用片层破碎，形成新的膜，同时分泌出新粒溶解，光合作用片层破碎，形成新的膜，同时分泌出新的细胞壁物质于细胞壁外边。的细胞壁物质于细胞壁外边。与营养细胞的区别是：壁厚；细胞质中的颗粒物质溶解，与营养细胞的区别是：壁厚；细胞质中的颗粒物质溶解，呈均匀状态；原来的类囊体膜解体，形成新膜；颜色呈淡呈均匀状态；原来的类囊体膜解体，形成新膜；颜色呈淡黄色或透明状。黄色或透明状。异形胞的功能：一是将藻丝细胞分隔成藻殖段进行营养繁异形胞的功能：一是将藻丝细胞分隔成藻殖段进行营养繁殖；二是细胞内含固氮酶，可直接固定大气中的氮。殖；二是细胞内含固氮酶，可直接固定大气中的氮。I I 蓝细菌形态的观察蓝
44、细菌形态的观察异形胞异形胞厚壁厚壁孢子孢子思考题思考题 在用插片法观察气生菌丝和孢子丝的形态时，在用插片法观察气生菌丝和孢子丝的形态时，要注意些什么？要注意些什么？一、实验目与基本要求：一、实验目与基本要求：学习并掌握观察霉菌形态的基本学习并掌握观察霉菌形态的基本方法，了解常见霉菌的基本特征。方法，了解常见霉菌的基本特征。二、实验内容：二、实验内容：1 1观察霉菌菌落形态。观察霉菌菌落形态。2 2用显微镜观察霉菌装片。用显微镜观察霉菌装片。3 3制作霉菌装片并观察其形态制作霉菌装片并观察其形态。实验五实验五 霉菌形态特征霉菌形态特征三、实验步骤三、实验步骤（一）菌落特征的观察（一）菌落特征的观
45、察 用肉眼观察生长在琼脂平板上的各种霉菌菌落，用肉眼观察生长在琼脂平板上的各种霉菌菌落，并根据下列要求对每种霉菌的菌落特征加以描述。并根据下列要求对每种霉菌的菌落特征加以描述。1.1.菌落的大小：局限生长或蔓延生长，菌落的直径和菌落的大小：局限生长或蔓延生长，菌落的直径和高度。高度。2.2.菌落的颜色：正面和背面的颜色，培养基的颜色变菌落的颜色：正面和背面的颜色，培养基的颜色变化。化。3.3.菌落的形态：棉絮状、网状、疏松或紧密、同心轮菌落的形态：棉絮状、网状、疏松或紧密、同心轮纹、放线状的皱褶等。纹、放线状的皱褶等。霉霉菌菌菌菌落落各种曲霉的菌落各种曲霉的菌落各种病原真菌的菌落各种病原真菌的
46、菌落青霉的菌落青霉的菌落青霉的菌落青霉的菌落霉菌菌丝霉菌菌丝 A、无隔菌丝无隔菌丝 B有隔菌丝有隔菌丝隔膜隔膜（二）个体形态特征的观察（二）个体形态特征的观察1.1.乳酸石炭酸制片法观察乳酸石炭酸制片法观察 （1 1）制片：在干净的载玻片上加一滴乳）制片：在干净的载玻片上加一滴乳酸石炭酸，用接种针从菌落边缘处取小量酸石炭酸，用接种针从菌落边缘处取小量带有孢子的菌丝置于液体中，再小心地把带有孢子的菌丝置于液体中，再小心地把菌丝放开，然后用盖玻片盖上，注意不要菌丝放开，然后用盖玻片盖上，注意不要产生气泡。产生气泡。（2 2）镜检：）镜检：1 1）毛霉和黑根霉的孢子的形状、颜色、大）毛霉和黑根霉的孢
47、子的形状、颜色、大小、孢子囊、中轴体的形状，有无假根和小、孢子囊、中轴体的形状，有无假根和葡萄菌丝。葡萄菌丝。2 2）黑曲霉的分生孢子的形状、颜色、大小、）黑曲霉的分生孢子的形状、颜色、大小、顶囊的形状、小梗排列隔膜。顶囊的形状、小梗排列隔膜。3 3）青霉的分生孢子的形状、颜色、大小、）青霉的分生孢子的形状、颜色、大小、小梗的排列方式，菌丝的隔膜。小梗的排列方式，菌丝的隔膜。（3 3）将观察结果绘图，并注意各部分名称。）将观察结果绘图，并注意各部分名称。霉菌的静孢子霉菌的静孢子左：毛霉的孢子囊；中：孢子囊壁破裂，露出静左：毛霉的孢子囊；中：孢子囊壁破裂，露出静孢子；右：囊轴孢子；右：囊轴 曲霉
48、的分生孢子梗和顶曲霉的分生孢子梗和顶囊上的分生孢子囊上的分生孢子青霉的帚状分生孢子梗和分生孢子青霉的帚状分生孢子梗和分生孢子曲霉的分生孢子头彩图曲霉的分生孢子头彩图霉菌的厚垣孢子霉菌的厚垣孢子2.2.插片培养观察：插片培养观察：（1 1）插片培养：将已灭菌的盖玻片斜插入）插片培养：将已灭菌的盖玻片斜插入培养基平板上，一半露在外面，然后沿盖玻培养基平板上，一半露在外面，然后沿盖玻片与培养基交接处接种霉菌孢子悬液。片与培养基交接处接种霉菌孢子悬液。2424到到2626度恒温培养度恒温培养2 2到到4 4天。天。（2 2）制片、镜检：以无菌操作取下盖玻片，）制片、镜检：以无菌操作取下盖玻片，有菌面朝
49、下，放在滴有一滴棉兰染液的载玻有菌面朝下，放在滴有一滴棉兰染液的载玻片上。片上。四、实验报告四、实验报告绘制镜检形态图绘制镜检形态图 1 1毛霉和根霉形态图，示各部。毛霉和根霉形态图，示各部。2 2青霉和曲霉形态图，示各部青霉和曲霉形态图，示各部五、问题和思考五、问题和思考 1 1什么叫载玻片湿室培养什么叫载玻片湿室培养?它适用于观它适用于观察怎样的微生物，有何优点察怎样的微生物，有何优点?2 2湿室培养时为何用湿室培养时为何用20%20%甘油作保湿剂甘油作保湿剂?（一）实验目的（一）实验目的（二）实验原理（二）实验原理（三）实验器材（三）实验器材（四）实验方法（四）实验方法（五）注意事项（五
50、）注意事项（六）实验作业（六）实验作业（一）实验目的（一）实验目的1 1、观察酵母菌的细胞形态及出芽生殖方式；、观察酵母菌的细胞形态及出芽生殖方式；2 2、学习掌握区分酵母菌死、活细胞的染色、学习掌握区分酵母菌死、活细胞的染色方法；方法；3 3、掌握酵母菌的一般形态特征及其与细菌、掌握酵母菌的一般形态特征及其与细菌的区别。的区别。（二）实验原理（二）实验原理 酵母菌是多形的、不运动的单细胞真酵母菌是多形的、不运动的单细胞真核微生物。核微生物。无性繁殖主要是无性繁殖主要是出芽生殖出芽生殖。本实验通过用本实验通过用美蓝染色浸片美蓝染色浸片来观察来观察生活的酵母形态和出芽生殖方式。生活的酵母形态和出
