1、实验七实验七 透析法脱盐透析法脱盐 葡聚糖凝胶层析葡聚糖凝胶层析 一、实验目的一、实验目的(1)掌握透析方法进行蛋白质脱盐。掌握透析方法进行蛋白质脱盐。(2)学习凝胶层析的工作原理和操作方法。学习凝胶层析的工作原理和操作方法。二、实验原理二、实验原理 用硫酸铵沉淀蛋白质，如果不除去无机盐，就无法用电泳法，离子交换层析法作进一步分离提纯，也影响酶活力的测定，因此，必须除去无机盐。用透析法、超滤法和分子筛层析的方法可以从蛋白质制剂中除去无机盐。透析是利用蛋白质大分子不能通过半透膜而小分子杂质能通透析是利用蛋白质大分子不能通过半透膜而小分子杂质能通过半透膜的性质，使蛋白质和小分子杂质分开的方法。过半
2、透膜的性质，使蛋白质和小分子杂质分开的方法。常用的半透膜是玻璃纸、火棉胶薄膜等。将待提纯的蛋白质溶液装在半透膜的透析袋里，然后将透析袋放在蒸馏水或低离子强度的缓冲液中，则小分子杂质通过半透膜而被除去，大分子蛋白质则仍留在袋中。n为了缩短透析时间，可以经常换水或流水透析。用4%BaCl2溶液检查透析袋外的溶液是否含有硫酸根离子，当液体中无BaSO4白色浑浊出现时，即表明硫酸铵已被除尽，可以结束透析。n（NH4）2 SO4+BaCl 2 BaSO4+2NH4Cl半透膜袋半透膜袋蛋白质溶液蛋白质溶液透析液透析液磁棒磁棒磁力搅拌器磁力搅拌器透析袋透析袋酶溶液酶溶液蒸馏水蒸馏水加压加压酶溶液酶溶液超滤膜
3、超滤膜支持栅板支持栅板超滤液超滤液图图3-1透析装置透析装置图图3-2超滤装置超滤装置电泳电泳 前前处处理理粗粗分分离离细细分分离离生物组织生物组织 无细胞提取液无细胞提取液破碎、溶破碎、溶解、差速离心解、差速离心选择性沉淀法选择性沉淀法亲和亲和层析层析离子交离子交换层析换层析精制后的蛋白质精制后的蛋白质凝胶凝胶过滤过滤疏水疏水层析层析吸附吸附层析层析n一般蛋白质样品经粗制分级后，体积一般蛋白质样品经粗制分级后，体积较小，杂质大部分被除去。进一步提纯，较小，杂质大部分被除去。进一步提纯，通常使用高分辨率柱层析及电泳方法。通常使用高分辨率柱层析及电泳方法。n另外，结晶也是蛋白质分离纯化的方另外，
4、结晶也是蛋白质分离纯化的方法之一，制备的结晶物常常作为蛋白质法之一，制备的结晶物常常作为蛋白质结构分析之用。结构分析之用。凝胶作为支持剂凝胶作为支持剂凝胶颗粒内部具有多孔网状凝胶颗粒内部具有多孔网状结构。结构。被分离的混合物流被分离的混合物流过层析柱过层析柱时时:凝胶过滤柱层析凝胶过滤柱层析 （分子筛层析）（分子筛层析）大分子先下来大分子先下来小分子后下来小分子后下来分子筛层析分子筛层析原理示意图原理示意图分分子子筛筛层层析析与与洗洗脱脱曲曲线线凝胶颗粒凝胶颗粒收收集集蛋蛋白白质质管管蛋白质混合物蛋白质混合物大分子大分子从柱上面加缓冲溶液从柱上面加缓冲溶液小分子小分子洗脱体积（洗脱体积（Ve）
5、凝胶柱凝胶柱大分子大分子小分子小分子Ve1Ve2V0蛋白质蛋白质Mr=49,000洗出洗出液中液中的蛋的蛋白质白质浓度浓度洗脱体积（洗脱体积（mL）未知未知logMr洗脱体积与相对分子质量的关系洗脱体积与相对分子质量的关系Andrews的经验公式：的经验公式：logMr=K1-K2(Ve/Vo)G-200G-100logMrKav凝胶凝胶的种类和性质的种类和性质 n交联葡聚糖凝胶（交联葡聚糖凝胶（Sephadex)Sephadex)Sephadex G Sephadex G 系列系列 G G 后的数字为凝胶吸水值的后的数字为凝胶吸水值的1010倍。倍。G G 反应凝胶的交联程度、膨胀程度和分部
6、范围。反应凝胶的交联程度、膨胀程度和分部范围。n琼脂糖凝胶（琼脂糖凝胶（SepharoseSepharose；Bio-Gel)Bio-Gel)依靠糖链之间的次级键维持网状结构，琼脂糖密度越依靠糖链之间的次级键维持网状结构，琼脂糖密度越 大，网状结构越密集。大，网状结构越密集。n聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 一种人工合成的凝胶，以丙烯酰胺为单位，由甲叉双一种人工合成的凝胶，以丙烯酰胺为单位，由甲叉双 丙烯酰胺交联而成。交联剂越多，孔隙度越小。商品丙烯酰胺交联而成。交联剂越多，孔隙度越小。商品 名为生物胶名为生物胶P P（Bio-Gel P)Bio-Gel P)。n聚丙乙烯凝胶（聚丙乙烯凝胶（Styrog
7、el)Styrogel)大网孔结构。大网孔结构。表表 葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶(Sephadex)的物理特性的物理特性品 名干胶颗粒直径/m得水值Wf/g.g-1床体积/mL.g-1最适分段分离范围溶胀所需时间/h最大流体静力压/Pa(cmH2O)球蛋白分子质量Da线性葡聚糖分子质量/Da20lOOSephadex G-1O40-1201.00.12-3700700319810(100)Sephadex G-1540-1201.50.22.5-3.515001500319810(100)Sephadex G-25粗中粗细超细100-30050-15020-8010-402.50.24-61000-
8、5000100-5000629810(100)Sephadex G-50粗中粗细超细100-30050-15020-8010-405.00.39-111500-30000500-10000629810(100)Sephadex G-75中粗超细40-12010-407.50.512-153000-700001000-500002434905(50)Sephdex G-100中粗超细40-12010-4010l.015-204000-1500001000-1000004853434(35)Sephadex G-150中粗超细40-12010-40151.520-305000-4000001000
9、-1500007251472(15)Sephadex G-200中粗超细40-12010-40202.030-405000-8000001000-200000725981(10)柱层析实验装置UV monitorRecorderFraction CollectorColumnBufferReservoir柱层析实验装置自动部份收集器自动部份收集器FPLC三、三、实验仪器与试剂实验仪器与试剂 仪器：仪器：50mL；烧杯：；烧杯：500mL；透析袋；透析夹；透析袋；透析夹；移液管：移液管：2mL；吸耳球；试管；吸耳球；试管。试剂：试剂：20mmol/LpH7.8磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液。四、操作方法1 透析除盐 将沉淀溶于少量缓冲液中(以沉淀刚溶解为度)，装入透析袋中，于4条件下透析24小时，除去硫酸铵，透析液为20 mmol/LpH7.6磷酸盐缓冲液。透析后离心10min弃去沉淀。2 纯化后酶液的处理 计量酶液的体积，保留上清液1mL于冰箱中。其余保存在冰箱中供进一步纯化用。
