1、第一章第一章 蛋白质蛋白质什么是蛋白质（什么是蛋白质（Protein）？）？由由20种左右的种左右的氨基酸氨基酸通过肽键相互连接而成的一类通过肽键相互连接而成的一类具有特定空间构象和生物学活性的高分子化合物具有特定空间构象和生物学活性的高分子化合物蛋白质的生物学意义蛋白质的生物学意义1、是生物体形态结构的物质基础；2、生物体的新陈代谢所包含的化学反应，几乎都是由酶来催化的；3、参与物质的运输；4、生物的运动；5、生物的防御体系。.总而言之，一切生命活动都离不开蛋白质，蛋白总而言之，一切生命活动都离不开蛋白质，蛋白质是生命现象的最基本的物质基础。质是生命现象的最基本的物质基础。所有蛋白质都含有所
2、有蛋白质都含有 C、H、O、N 四种元素，大多数蛋四种元素，大多数蛋白质还含有少量的白质还含有少量的 S，有些蛋白质还含有一些其它元，有些蛋白质还含有一些其它元素，如素，如 P、Fe、Cu、Mo、I、.。各种蛋白质的含氮量都很接近，都在各种蛋白质的含氮量都很接近，都在16%左右，因左右，因此可通过测定生物样品中的含氮量计算出样品中蛋此可通过测定生物样品中的含氮量计算出样品中蛋白质的含量。白质的含量。蛋白质的元素组成蛋白质的元素组成1克氮就相当于克氮就相当于6.25克蛋白质克蛋白质氨基酸（氨基酸（Amino acid）氨基酸的通式氨基酸的通式L-AlanineD-Alanine蛋白质水解得到的氨
3、基酸都是蛋白质水解得到的氨基酸都是L-型型-氨基酸氨基酸中性氨基酸中性氨基酸氨基酸的结构氨基酸的结构酸性氨基酸碱性氨基酸芳香族氨基酸杂环氨基酸L-谷氨酸谷氨酸-半醛半醛脯氨酸脯氨酸氨基酸的分类氨基酸的分类(1)(1)按按侧链侧链R R基的结构基的结构(2)(2)按按侧链侧链R R基的极性基的极性氨基酸的分类氨基酸的分类氨基酸的一般性质氨基酸的一般性质 p一般能溶于水(胱氨酸、半胱氨酸、酪氨酸除外)；p在稀酸、稀碱中溶解性好；p一般不溶于有机溶剂（脯氨酸除外）。溶解性：溶解性：氨基酸的一般性质氨基酸的一般性质 紫外吸收：紫外吸收：Tyr:275-278nmPhe:257-259nmTrp:279
4、-280nm两性解离和等电点两性解离和等电点 氨基酸的形式氨基酸的形式 H2NCHCOOHRH3NCHCOOR-+两性离子形式两性离子形式中性分子形式中性分子形式氨基酸具有酸碱性质，是一类两性电解质氨基酸具有酸碱性质，是一类两性电解质H2NCHCOORH3NCHCOOR-+-+H+As an acid（proton donor）：）：As a base（proton acceptor）：）：H3NCHCOOHRH3NCHCOOR-+H+不同不同pH时氨基酸以不同的离子化形式存在：时氨基酸以不同的离子化形式存在：H3NCHCOOHRH3NCHCOOR-+H+OH-+H+OH-H2NCHCOOR-
5、正离子正离子两性离子两性离子负离子负离子 氨基酸所带静电荷为氨基酸所带静电荷为“零零”时，溶液的时，溶液的pH值称为该氨值称为该氨基酸的等电点（基酸的等电点（isoelectric point），以），以pI表示。表示。H3NCHCOOHRH3NCHCOOR-+H+OH-+H+OH-H2NCHCOOR-H3NCHCOOHRH3NCHCOOR-+H+OH-+H+OH-H2NCHCOOR-H3NCHCOOHRH3NCHCOOR-+H+OH-+H+OH-H2NCHCOOR-H3NCHCOOHRH3NCHCOOR-+H+OH-+H+OH-H2NCHCOOR-H3NCHCOOHRH3NCHCOOR-+H
6、+OH-+H+OH-H2NCHCOOR-H3NCHCOOHRH3NCHCOOR-+H+OH-+H+OH-H2NCHCOOR-如何计算氨基酸的等电点？如何计算氨基酸的等电点？1、R基团不解离的氨基酸pI=(pK1+pK2)/2=(2.34+9.69)/2=6.0K1K2pK1=2.34pK2=9.692、R基团解离的氨基酸K1K2pI=(pK1+pK2)/2pK1=1.88pK2=3.65CH2COOHCH2COOHCH2COO-CH2COO-Asp+Asp+-Asp-Asp-K3pK2=9.60=(1.88+3.65)/2=2.77如何计算氨基酸的等电点？如何计算氨基酸的等电点？pI=(pK2
7、+pK3)/2=(8.95+10.53)/2=9.74pK1=2.18pK2=8.95Lys+Lys+Lys+-Lys-pK3=10.53K1K2(CH2)4NH3+K3(CH2)4NH3+(CH2)4NH3+(CH2)4NH22、R基团解离的氨基酸如何计算氨基酸的等电点？如何计算氨基酸的等电点？Amino acidpIAmino acidpIGly5.97Glu3.22Ala6.0Asn5.41Val5.96Gln5.65Leu5.98Lys9.74Ile6.02Arg10.76Ser5.68Phe5.48Thr6.18Tyr5.66Cys5.07Trp5.89Met5.74His7.59A
8、sp2.77Pro6.30各种氨基酸在各种氨基酸在25时时pI的近似值的近似值氨基酸在电场中移动的行为氨基酸在电场中移动的行为-+用纸色谱用纸色谱-电泳法分离电泳法分离Glu、Lys和和Thr混合液中的三种氨基酸时，混合液中的三种氨基酸时，如何选择：如何选择：1、电泳缓冲液的、电泳缓冲液的pH值；值；2、点样位置。、点样位置。（1 1）与茚三酮的反应）与茚三酮的反应 氨基酸的化学性质氨基酸的化学性质 H+RCHO+CO2+NH3蓝紫色物质蓝紫色物质+=OOO+2OO黄色黄色脯氨酸脯氨酸茚三茚三 酮酮（2 2）与甲醛的反应）与甲醛的反应 氨基酸的化学性质氨基酸的化学性质（3）与）与2，4-二硝基
9、氟苯的反应二硝基氟苯的反应+O2NNO2NH-CH-COOH+HFRNH2-CH-COOHRFO2NNO2DNFBDNP-氨基酸氨基酸的化学性质氨基酸的化学性质 1955年年Sanger用此法首次阐明胰岛素的氨基酸排列顺序用此法首次阐明胰岛素的氨基酸排列顺序 2，4-二硝基氟苯反应的应用二硝基氟苯反应的应用多肽或蛋白质多肽或蛋白质+DNFBDNP-多肽或多肽或DNP-蛋白质蛋白质酸水解酸水解DNP-氨基酸氨基酸+氨基酸氨基酸乙酸乙酯抽提乙酸乙酯抽提DNP-氨基酸氨基酸色谱分析色谱分析鉴定出多肽鉴定出多肽N-端端氨基酸的种类和氨基酸的种类和数目数目(4)(4)与与 5 5一二甲氨基萘一二甲氨基萘
10、-1-1-磺酰氯磺酰氯（dansyl chloride,DNS-Cl）的反应的反应 H2NHCCOOHRNH3CCH3SOOCl+NH3CCH3SOOHNHCCOOHR+HClDNS-ClDNS-氨基酸（有强荧光）（有强荧光）(5)(5)与苯异硫氰酸（酯）的反应与苯异硫氰酸（酯）的反应 H2NCCOOHR+在 弱 碱 中NCSHPITCNCSPTC-氨基酸氨基酸PTH-氨基酸氨基酸NCNCCHHOOHRHSH+NCNCCOHRHSThe Edman degradation苯异硫氰酸（酯）反应的应用苯异硫氰酸（酯）反应的应用蛋白质自动顺序分析仪就是根据蛋白质自动顺序分析仪就是根据Edman 降解
11、法的原理而设计的降解法的原理而设计的(6)与亚硝酸的反应与亚硝酸的反应应用：1、是Van Slyke氏测定氨基氮的理论基础 2、可用来判断蛋白质的水解程度肽（peptide）两个或两个以上的氨基酸通过酰胺键两个或两个以上的氨基酸通过酰胺键(或称肽键或称肽键)相连相连而成的化合物叫作肽。而成的化合物叫作肽。二肽二肽 三肽三肽 四肽四肽 寡肽（寡肽（oligopeptide）多肽（多肽（Polypeptide）十肽十肽肽如何命名？肽如何命名？丙氨酰甘氨酰亮氨酸丙氨酰甘氨酰亮氨酸 AlaGlyLeu (or AlaGlyLeu)CHCOHNCH2COHNCHCOOHH3CNH2CH2CH3CCH3H
12、1谷胱甘肽谷胱甘肽(glutathione,GSH)2GSH GSSG-2H+2H天然存在的某些活性肽天然存在的某些活性肽 -肽键肽键2 2多肽激素多肽激素 3 3脑肽脑肽甲硫氨酸脑啡肽甲硫氨酸脑啡肽H-TyrGlyGlyPhe-Met-OH 亮氨酸脑啡肽亮氨酸脑啡肽H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-OH 思考题思考题(1)组氨酸的pK1(-COOH)是1.82，pK2(咪唑基)是6.00，pK3(-NH3+)是 9.17，它的等电点 是 。(2)实验测得一蛋白质样品的含氮量为12.89%，该样品的蛋白质含量为 。(3)在pH=6时将一个Ala、Arg、Glu的混合液进行 纸上电泳，
13、移向正极的是 ，移向负极的 是 ，留在原处的是 。思考题思考题(4)天然蛋白质中不存在的氨基酸是（）A.鸟氨酸；B.羟脯氨酸；C.半胱氨酸;D.甲硫氨酸；E.丝氨酸(5)下列关于谷胱甘肽的叙述中，错误的是()A.有一个易被氧化的侧链基团；B.有一个与通常肽键不同的-肽键；C.是一种碱性肽;D.它的氧化型是六肽(6)多肽序列自动分析仪是根据（）的原理设计的。A.DNFB法；B.DNS-Cl法；C.氨肽酶法;D.PITC法；E.羧肽酶法思考题思考题(7)蛋白质中的氨基酸均含不对称的碳原子()(8)氨基酸为氨基取代的羧酸，可以直接用酸碱滴定法进行定量测定()(9)生物界中不存在任何的D-型氨基酸()
14、(10)某氨基酸晶体溶于pH=7的水中，所得溶液的pH为6，该氨基酸的pI是大于6还是小于6？(11)计算下列肽的等电点：A:天冬氨酰甘氨酸：末端-COOH(pK=2.10),末端-NH3+(pK=9.07),-COOH(pK=4.53)B:谷胱甘肽：Glu末端-COOH(pK=2.12),末端-NH3+(pK=8.66),甘氨酸-COOH(pK=3.53),-SH(pK=9.62)C:丙氨酰丙氨酰赖氨酰丙氨酸：末端-COOH(pK=3.58)，末端-NH3+(pK=8.01)，-NH3+(pK=10.58)蛋白质的结构蛋白质的结构一级结构一级结构二级结构二级结构三级结构三级结构四级结构四级结
15、构一级结构一级结构二级结构二级结构超二级结构超二级结构结构域结构域三级结构三级结构四级结构四级结构蛋白质的一级结构（蛋白质的一级结构（primary structure）蛋白质多肽链中氨基酸的排列顺序（蛋白质多肽链中氨基酸的排列顺序（sequence）和）和二硫键的位置，一级结构的主要连接键是肽键和二硫二硫键的位置，一级结构的主要连接键是肽键和二硫键。键。1969年正式将蛋白质的一级结构定义为年正式将蛋白质的一级结构定义为:Amino acid sequences have direction.Amino acid sequence of bovine insulin.A 链：21 aaB 链
16、：30 aaThe formation of a disulfide bond from two cysteine residues is an oxidation reaction.一级结构的测定一级结构的测定6、测定每一肽片段的氨基酸序列，推断出完整的肽链的氨基酸序列1、纯化蛋白质样品，测定其分子量；2、水解蛋白质样品，测定其氨基酸组分；3、末端分析，确定肽链数目，及末端氨基酸；4、拆分肽链；5、几种蛋白酶或化学试剂水解产生一些大小不等的重叠肽片段，并分离纯化它们；蛋白质样品的酸水解和碱水解蛋白质样品的酸水解和碱水解 优点：不产生消旋作用，水解完全。缺点：Trp被完全破坏，Gln变为Glu
17、,Asn变为Asp,含羟基的氨基酸部分被破坏。酸水解：酸水解：6N HCl at 110 for 24 hours.碱水解：碱水解：5N NaOH at 110 for 24 hours。优点：Trp不被破坏 缺点：易发生外消旋作用COHCHNSCH2COHCHNSCH2HCOOOHCOHCHNSO3HCH2COHCHNSO3HCH2二硫键的拆分多肽链的专一性水解多肽链的专一性水解溴化氢(CNBr):专一性水解Met的羧基形成的肽键高丝氨酸内酯末端多肽链的专一性水解多肽链的专一性水解胰蛋白酶(trypsin)：但是赖氨酸或精氨酸的羧基与脯氨酸的亚氨基形成的肽键则不被胰蛋白酶水解。专一性水解赖氨
18、酸或精氨酸的羧基形成的肽键。胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)专一性水解疏水性氨基酸，主要是酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的羧基形成的肽键。但不水解脯氨酸的氨基形成的肽键。多肽链的专一性水解多肽链的专一性水解思考题思考题1、有一多肽链经胰蛋白酶水解后得到两条短肽链：和该多肽链如果经胰凝乳蛋白酶水解，则可得到一个五肽：问：这条多肽链的序列是怎样的？2、已知某肽由12个氨基酸组成，如经CNBr水解后得到下列三个肽段：Asp-Gly-Lys；Ala-Tyr-Arg-Asp-Met；Ala-Asn-Lys-Met；如经胰蛋白酶水解也得到三个肽段，把其中的一个肽段用6 N HCl水解后分析得知其氨基酸组成为：Met,Ala，Lys和(Asp)2。请根据上述实验结果推断出该12肽的氨基酸序列，并请列出你的推断思路。思考题思考题 Thank you
