1、第十六章第十六章基因诊断的概念：基因诊断的概念：以以DNA和和RNA为诊断材料，为诊断材料，应用分子生物学技术方法，应用分子生物学技术方法，直接检查基因的结构、或表直接检查基因的结构、或表达是否异常，对人体状态和达是否异常，对人体状态和疾病作出诊断的方法。疾病作出诊断的方法。用途用途诊断下列两种类型疾诊断下列两种类型疾病：病：1、内源基因的变异、内源基因的变异2、外来生物的入侵、外来生物的入侵 基因结构的异常基因结构的异常基因致病基因致病 基因表达的异常基因表达的异常第一节第一节 基因诊断基因诊断一、基因诊断的特点：一、基因诊断的特点：1.特异性高，针对性强：特异性高，针对性强：使用基因探针通
2、过分子杂使用基因探针通过分子杂交进行高特异性分析以基因作为检测对象，属于交进行高特异性分析以基因作为检测对象，属于病因诊断或发病原因分析。病因诊断或发病原因分析。2.灵敏度高灵敏度高:用放射性同位素、酶或化学发光试剂用放射性同位素、酶或化学发光试剂标记探针，有很高的检测灵敏度，标记探针，有很高的检测灵敏度，PCR扩增也有扩增也有很高的灵敏度。很高的灵敏度。3.早期诊断：早期诊断：无临床表现无临床表现4.取样方便：取样方便：不受组织时相限制不受组织时相限制5.安全高效：安全高效：不必培养高危病菌病毒，还可分亚型不必培养高危病菌病毒，还可分亚型6.适应范围广：适应范围广：可检测内源性基因和外来基因
3、。可检测内源性基因和外来基因。二、基因诊断的内容和技术二、基因诊断的内容和技术n直接诊断直接诊断_致病基因明确致病基因明确n间接诊断间接诊断_致病基因不明确，致病基因不明确，基因连锁分析基因连锁分析n分子基础分子基础基因结构异常基因结构异常 基因表达异常基因表达异常（1）DNA序列测定序列测定（2）核酸分子印迹杂交）核酸分子印迹杂交（3）聚合酶链反应（）聚合酶链反应（PCR）单链构象多态性检测单链构象多态性检测PCR-SSCP 限切酶酶谱分析限切酶酶谱分析PCR-RFLP 随机引物分析随机引物分析 PCR-RAPD（4）DNA芯片技术芯片技术基因诊断的常用技术类型基因诊断的常用技术类型1、点突
4、变的诊断、点突变的诊断nPCR结合点杂交结合点杂交n DNA芯片技术芯片技术n 限制性片断长度多态性分析法限制性片断长度多态性分析法RFLP针对不同突变类型的基因诊断针对不同突变类型的基因诊断技术技术 正常基因：设计寡核苷酸探针正常基因：设计寡核苷酸探针MGGTACGATGCGGTTAACGCGCCATGCTACGCCAATTGCGC 突变基因：设计寡核苷酸探针突变基因：设计寡核苷酸探针N GGTACGATGTGGTTAACGCGCCATGCTACACCAATTGCGC M NM NM NM N杂交的结果：杂交的结果：（）受检者）受检者DNA与与 N 杂交，与杂交，与M不杂交：突不杂交：突变基
5、因纯合子变基因纯合子 （）与）与M、N都能杂交：突变基因杂合子都能杂交：突变基因杂合子 （）与）与M 杂交，与杂交，与N不杂交：没有这种突变不杂交：没有这种突变基因基因（）M、N均不杂交：可能是新突变均不杂交：可能是新突变（2）诊断未知的点突变）诊断未知的点突变 常用检测方法：常用检测方法：PCR-SSCP DNA芯片芯片 测序测序PCR-SSCP检测法检测法单链构象多态性单链构象多态性Single strand conformation polymorphismSSCP 基本原理基本原理 单链单链DNA在中性溶液中可形在中性溶液中可形成一定的空间构象，构象与其碱成一定的空间构象，构象与其碱基
6、顺序相关。因此当单链基顺序相关。因此当单链DNA中中碱基变异碱基变异时，如碱基替换，它的时，如碱基替换，它的空间构象空间构象也发生一定变化。这种也发生一定变化。这种现象称为单链构象多态性。现象称为单链构象多态性。单链单链DNA在非变性聚丙烯在非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，其迁移率酰胺凝胶中电泳时，其迁移率不仅与不仅与链长链长有关，还与单链有关，还与单链 DNA的的空间构象空间构象有关，因此碱有关，因此碱基变异引起的构象变化也可改基变异引起的构象变化也可改变单链变单链DNA的电泳迁移率。的电泳迁移率。ssDNAdsDNA高温变性，快速冰浴高温变性，快速冰浴野生型野生型DNA突变型突变型DNASS
7、CP原理示意图原理示意图慢慢快快点样孔点样孔2、少数核苷酸缺失或插入突、少数核苷酸缺失或插入突变的诊断变的诊断方法同点突变的诊断方法同点突变的诊断3、大片断缺失或插入突变的诊断、大片断缺失或插入突变的诊断 常采用常采用PCR法法致病基因致病基因引物引物1 引物引物2 引物引物3引物引物4 4、基因重排（染色体易位）的、基因重排（染色体易位）的诊断诊断 常采用常采用PCR法法引物引物1 引物引物2 引物引物35、基因扩增的诊断、基因扩增的诊断 常采用常采用Southern印迹杂印迹杂交定量法交定量法 关于多态性分析关于多态性分析 基因组的核酸分子碱基排列顺序基因组的核酸分子碱基排列顺序在同种生物
8、的不同个体之间或等位基在同种生物的不同个体之间或等位基因之间存在差异的现象称为基因多态因之间存在差异的现象称为基因多态性。性。DNA多态性可分为位点多态性多态性可分为位点多态性和重复序列多态性两种。和重复序列多态性两种。1、限制性片段长度多态性、限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism,RFLP）分）分析析 DNA分子中某些碱基的变分子中某些碱基的变异（即位点多态性）可使某种异（即位点多态性）可使某种限制性核酸内切酶的切点消失限制性核酸内切酶的切点消失或出现新的切点，因此用同一或出现新的切点，因此用同一种限制性核酸内切酶消化不同种限
9、制性核酸内切酶消化不同个体的个体的DNA分子时，会产生各分子时，会产生各不相同的限制性片段类型。这不相同的限制性片段类型。这种现象称为限制性片段长度多种现象称为限制性片段长度多态性。态性。限制酶酶切位点的改变造限制酶酶切位点的改变造成的成的RFLP可分为两种情况：可分为两种情况：限制酶识别位点发生单限制酶识别位点发生单个碱基置换，导致酶切位点消个碱基置换，导致酶切位点消失或获得，此称为失或获得，此称为点多态性点多态性。这种多态性只有两个等位片断，这种多态性只有两个等位片断，即多态位点的有或无。即多态位点的有或无。限制酶识别位点之间的限制酶识别位点之间的DNA序列缺失、插入或重组，序列缺失、插入
10、或重组，限制酶识别序列不发生变化，限制酶识别序列不发生变化，但它在基因组中的位置发生但它在基因组中的位置发生了变化。这种多态性可以有了变化。这种多态性可以有两个或两个以上的等位片断。两个或两个以上的等位片断。RFLP分析法分析法 限制酶酶切图谱直接分析法限制酶酶切图谱直接分析法 RFLP间接分析法间接分析法（1）限制酶酶切图谱直接分析法）限制酶酶切图谱直接分析法 限制酶酶切限制酶酶切SouthernSouthern印印迹杂交。迹杂交。PCR PCR限制酶酶切限制酶酶切应用应用RFLP诊断镰刀状红细胞性贫血诊断镰刀状红细胞性贫血正常人正常人 珠蛋白基因珠蛋白基因 GAGHbS的的 珠蛋白珠蛋白m
11、RNA Glu正常人正常人 珠蛋白肽链珠蛋白肽链GUGHbS的的 珠蛋白肽链珠蛋白肽链ValHbS的的 珠蛋白基因珠蛋白基因 6CAC正常人正常人 珠蛋白珠蛋白mRNA 6CTCMst酶切位点酶切位点CCTNAGGCCTNTGGMst酶酶AT替换替换HbA-CCT GAG GAG-HbS-CCT GTG GAG-MstMstMst1.1kb0.2kb1.3kb1.1kb1.3kb0.2kbSSASFAARFLP法检测法检测HbSSS:HbS纯合子纯合子AS:HbS杂合子杂合子AA:正常正常F:被检胎儿被检胎儿(放射性自显影图谱放射性自显影图谱)（2）RFLP间接分析法间接分析法RFLP连锁分析
12、法连锁分析法 甲型血友病甲型血友病 疾病种类：疾病种类：X染色体连锁性染色体连锁性遗传病遗传病 缺陷基因：凝血因子缺陷基因：凝血因子基因基因 主要临床表现：出血性疾病主要临床表现：出血性疾病 应用应用PCR-RFLP连锁分析法连锁分析法诊断甲型血友病诊断甲型血友病 用一对引物扩增凝血因子用一对引物扩增凝血因子基因第基因第1818外显子内的一个外显子内的一个142bp142bp片片断，该片断含一个断，该片断含一个BclBcl多态性位多态性位点。酶解后，如果存在点。酶解后，如果存在BclBcl酶切酶切位点，则产生位点，则产生99bp99bp和和43bp43bp两个片两个片断；如果不存在则只有断；如
13、果不存在则只有142bp142bp一个一个片断。研究证明，片断。研究证明，142bp142bp片断与甲片断与甲型血友病基因连锁。型血友病基因连锁。142bp99bp正常男性女性携带者先证者胎儿绒毛样品2、DNA重复序列多态性分析重复序列多态性分析（三）基因表达异常的诊断（三）基因表达异常的诊断1、mRNA的定量分析的定量分析（1）相对定量）相对定量 斑点杂交斑点杂交 RT-PCR（2）绝对定量）绝对定量2、mRNA长度分析长度分析 Northern印迹杂交印迹杂交 RT-PCR 三、遗传病的基因诊断三、遗传病的基因诊断 1、直接诊断策略、直接诊断策略 2、间接诊断策略、间接诊断策略 （一）血红
14、蛋白病（一）血红蛋白病 1.异常血红蛋白病异常血红蛋白病 1、DNA检测与分析检测与分析（1）PCR-限制酶谱分析法限制酶谱分析法（2）Southern印迹杂交分析法印迹杂交分析法 2、RNA检测与分析检测与分析 RT-PCR镰状细胞贫血病（镰状细胞贫血病（sickle cell aneamia）Mst II 酶切位点酶切位点 CCTNAGG GGANTCC点突变点突变T ACCANAGGGGTNTCC 酶切酶切 凝胶电泳凝胶电泳 Southern block 珠蛋白基因探针杂交珠蛋白基因探针杂交 2.地贫地贫(1)-地贫地贫1）DNA检测与分析检测与分析（a）RFLP（b）PCR2）RNA检
15、测与分析检测与分析 RT-PCR（2）-地贫的基因诊断地贫的基因诊断1)DNA检测与分析检测与分析（1）PCR-探针法探针法（2）PCR-RFLP连锁分析法连锁分析法（3）DNA芯片技术芯片技术2)RNA检测与分析检测与分析 RT-PCR C地中海贫血地中海贫血 珠蛋白基因珠蛋白基因3端缺失端缺失0.6 kbBgl IIBgl II A C（二）血友病（二）血友病Anfactor VIII 基因缺陷（碱基因缺陷（碱基取代、缺失或插入等）基取代、缺失或插入等）n基因产物基因产物凝血因子凝血因子VIII 无无活性或不稳定活性或不稳定，导致凝血，导致凝血障碍障碍。nPCR扩增因子扩增因子VIII基因
16、基因的的18号外显子号外显子142 bp片段片段nBcl I 限制酶限制酶 酶切位点在酶切位点在基因内基因内18号外显子号外显子3 端端n电泳染色电泳染色,分析片段的分析片段的家系分布家系分布,作出产前诊断作出产前诊断142 bp 99 bp父父 母母 儿儿 胎儿胎儿 (先证者先证者)(女女)四、四、肿瘤的基因诊断肿瘤的基因诊断一一)肿瘤基因诊断的策略肿瘤基因诊断的策略1、检测肿瘤标记基因或、检测肿瘤标记基因或mRNA2、检测肿瘤相关基因、检测肿瘤相关基因3、检测肿瘤相关病毒基因、检测肿瘤相关病毒基因（二）（二）肿瘤相关基因的检测肿瘤相关基因的检测 ras癌基因的检测癌基因的检测1、常见突变类
17、型：、常见突变类型：点突变（点突变（突变热点在突变热点在12、13、61位密码子的位密码子的编码区）编码区）2、常用检测方法、常用检测方法（1）PCR-ASO（2）PCR-SSCP抑癌基因抑癌基因p53的检测的检测1、常见突变类型：、常见突变类型：点突变点突变突变热点在突变热点在58号外显子号外显子，有少量插，有少量插入或缺失入或缺失2、常检测方法、常检测方法（1）PCR-SSCP（2）PCR结合序列分析结合序列分析（3）PCR-RFLP五、感染性疾病的基因诊断五、感染性疾病的基因诊断n目前应用最多是目前应用最多是PCR法法，不仅可，不仅可检测病检测病原体的原体的DNA（如乙肝病毒、巨细胞病毒
18、、（如乙肝病毒、巨细胞病毒、乳头瘤病毒、结核杆菌等），而且可乳头瘤病毒、结核杆菌等），而且可检检测测RNA病原体病原体（RT-PCR检测艾滋病病检测艾滋病病毒、丙肝病毒等）。毒、丙肝病毒等）。应用范围应用范围1.可快速准确查出致病病原体可快速准确查出致病病原体;2.适于早期诊断、带菌带毒者和潜适于早期诊断、带菌带毒者和潜 在感染的发现；在感染的发现；3.大规模病原流行病学的现场筛查大规模病原流行病学的现场筛查4.病原体抗药性的快速敏感试验病原体抗药性的快速敏感试验;5.对微生物的科属种进行准确分类对微生物的科属种进行准确分类 鉴定鉴定;。六六 基因诊断在法基因诊断在法医学中的应用医学中的应用n
19、PCR结合DNA指纹技术nSouthern blot 应用nDNA指纹分析血迹中的血迹中的DNA第二节第二节 基因治疗基因治疗Gene therapy基因治疗的概念基因治疗的概念 基因治疗是指把目的基因导入人体，基因治疗是指把目的基因导入人体，通过在特定靶细胞中表达该细胞本来不通过在特定靶细胞中表达该细胞本来不表达或低表达、或已异常突变而不表达表达或低表达、或已异常突变而不表达的基因，或采用特定方式关闭、抑制异的基因，或采用特定方式关闭、抑制异常表达基因，达到治疗疾病目的的治疗常表达基因，达到治疗疾病目的的治疗方法。方法。一、基因治疗的必要条件一、基因治疗的必要条件（1）用传统治疗无效或效果不
20、佳；）用传统治疗无效或效果不佳；（2）发病的分子机制已阐明，且目的基因已经克隆且对）发病的分子机制已阐明，且目的基因已经克隆且对其产物有详尽的了解，；其产物有详尽的了解，；（3）目的基因能在体外操作，能有效的导入靶细胞；能）目的基因能在体外操作，能有效的导入靶细胞；能在靶细胞中一段时间或长期稳定驻留；在靶细胞中一段时间或长期稳定驻留；（4）导入基因能有适度表达；）导入基因能有适度表达；（5）基因导入方法和所用载体对靶细胞安全无害；）基因导入方法和所用载体对靶细胞安全无害；（6）目的基因的表达不需严格控制，或能够人为控制；）目的基因的表达不需严格控制，或能够人为控制；（7）人类的基因治疗需经过严
21、格审批）人类的基因治疗需经过严格审批二、基因治疗的主要策略二、基因治疗的主要策略（一）基因修复或基因矫正（一）基因修复或基因矫正 n矫正突变碱基，精确的原位修复矫正突变碱基，精确的原位修复n最理想，难以实现最理想，难以实现(二二)基因置换基因置换 指将特定的目的基因导入特定的细胞，指将特定的目的基因导入特定的细胞，通过定位重组，以导入基因置换基因组通过定位重组，以导入基因置换基因组内的原有缺陷基因内的原有缺陷基因 基因打靶技术（同源重组）基因打靶技术（同源重组）（三）基因增补（三）基因增补1、概念、概念通过导入外源基因是靶细胞表达其本身不通过导入外源基因是靶细胞表达其本身不表达的基因。表达的基
22、因。2、基因添加的两种类型、基因添加的两种类型（1）针对特定的缺陷基因导入其相应正）针对特定的缺陷基因导入其相应正常基因常基因（2）向靶细胞中导入靶细胞中本来不表）向靶细胞中导入靶细胞中本来不表达的基因达的基因（四）基因干预（四）基因干预采取特定的方式抑制某个基因的表达，或采取特定的方式抑制某个基因的表达，或通过破坏某个基因使之不表达通过破坏某个基因使之不表达1.反义核酸技术反义核酸技术2.核酶核酶3.RNA干扰技术（干扰技术（RNAi)三、基因治疗的基本程序（一）目的基因的选择和制备（二）靶细胞的选择（三）基因的导入（三）基因的导入（基因转移技术）（基因转移技术）基因治疗的方式：基因治疗的方
23、式：n体内法：体内直接转移基因法体内法：体内直接转移基因法 n回体法：靶细胞介导的基因治疗回体法：靶细胞介导的基因治疗基因导入的方式n病毒载体法n非病毒载体法逆转录病毒载体逆转录病毒载体1、逆转录病毒载体的结构、逆转录病毒载体的结构LTRLTRgagpolenv在包装细胞中包装成假病毒在包装细胞中包装成假病毒LTRLTRneuAmprori E2、包装细胞、包装细胞3、逆转录病毒载体的特点、逆转录病毒载体的特点（1）结构和感染过程与普通逆）结构和感染过程与普通逆转录病毒相似；转录病毒相似；（2）可使靶细胞变成稳定表达）可使靶细胞变成稳定表达目的基因的转化细胞；目的基因的转化细胞；（3）感染靶细
24、胞后不扩散；）感染靶细胞后不扩散；（4）假病毒感染靶细胞的效率）假病毒感染靶细胞的效率非常高；非常高；（5）不感染非增殖细胞。）不感染非增殖细胞。4、安全性问题、安全性问题（1）感染的可能性）感染的可能性（2）污染的可能性）污染的可能性（3）在靶细胞基因组中的整合）在靶细胞基因组中的整合（二）腺病毒载体（二）腺病毒载体1、结构、结构E1A E1BE2BE2AE4E3L1L52、特点、特点（1）宿主范围广）宿主范围广（2）腺病毒蛋白表达不以宿主）腺病毒蛋白表达不以宿主增殖为必要条件增殖为必要条件（3）可获得高病毒效价）可获得高病毒效价（4）重组体非常稳定）重组体非常稳定（5）不会引起肿瘤）不会引
25、起肿瘤（6）有较高的安全性）有较高的安全性（7）无包膜，不易被补体灭活，）无包膜，不易被补体灭活，可直接在体内应用可直接在体内应用（8）不整合入染色体）不整合入染色体（三）腺相关病毒载体（三）腺相关病毒载体1、结构、结构ITRITRREPCAP2、特点、特点（1）能够进行位点特异性整合）能够进行位点特异性整合（2）无致病性）无致病性（3）载体结构简单）载体结构简单（4）稳定）稳定（5）不引起肿瘤形成）不引起肿瘤形成（四）单纯疱疹病毒载体（四）单纯疱疹病毒载体1、结构、结构a b U1 bacUs c a2、特点、特点（1）滴度高）滴度高（2）容量大）容量大（3）增殖细胞和非增殖细胞均可感染）增
26、殖细胞和非增殖细胞均可感染（4）不整合，但可长期存在并可稳定表达）不整合，但可长期存在并可稳定表达基因转移的非生物学方法基因转移的非生物学方法（一）脂质体（一）脂质体（二）直接注射法（二）直接注射法（三）受体介导基因转移技术（三）受体介导基因转移技术（四）其他方法（四）其他方法（四）转染靶细胞的筛选和导（四）转染靶细胞的筛选和导入基因的鉴定入基因的鉴定1、选择靶细胞应考虑因素、选择靶细胞应考虑因素（1）组织特异性细胞；）组织特异性细胞；（2）易获得、寿命长）易获得、寿命长（3）离体细胞易受外源遗传物）离体细胞易受外源遗传物质转化；质转化；（4）易成活。）易成活。2、常用、常用 靶细胞靶细胞（1
27、）造血细胞）造血细胞（2）皮肤成纤维细胞）皮肤成纤维细胞（3）肝细胞）肝细胞（4）血管内皮细胞）血管内皮细胞（5）淋巴细胞）淋巴细胞（6）肌肉细胞）肌肉细胞（7）肿瘤细胞）肿瘤细胞（8）其他细胞）其他细胞四、基因治四、基因治疗的应用研疗的应用研究究（一）单基因遗传病的基因治疗（一）单基因遗传病的基因治疗腺苷脱氨酶缺乏症腺苷脱氨酶缺乏症缺陷基因：腺苷脱氨酶基因缺陷基因：腺苷脱氨酶基因主要临床表现：免疫缺陷主要临床表现：免疫缺陷基因治疗方法：基因治疗方法：逆转录病毒载体逆转录病毒载体 包装细胞包装细胞 骨髓造血干细胞骨髓造血干细胞 回输体内回输体内血友病（二）肿瘤的基因治疗研究（二）肿瘤的基因治疗研究策略策略（一）修正肿瘤相关基因的功能（一）修正肿瘤相关基因的功能1、恢复抑癌基因的功能、恢复抑癌基因的功能2、纠正癌基因的表达、纠正癌基因的表达（二）导入特定的基因产生肿瘤（二）导入特定的基因产生肿瘤特异的药物敏感性特异的药物敏感性（三）肿瘤的免疫基因治疗（三）肿瘤的免疫基因治疗复习题复习题一、名词一、名词基因诊断、基因治疗、基因诊断、基因治疗、-地中海贫血、地中海贫血、-地中海贫血、基因转染、基因打靶。地中海贫血、基因转染、基因打靶。二、问题二、问题1、基因诊断的优点和应用如何？基因诊断的优点和应用如何？2、基因治疗的概念、策略和基本步骤是什么？、基因治疗的概念、策略和基本步骤是什么？
