1、实验室注意事项,安静有序，不要大声喧哗 禁止在实验室喝水吃东西 时刻警惕生物污染 生物污染垃圾放入黄色塑料袋 实验完毕将器材放入指定收集位置 实验结束将自己的实验台打扫干净 每组组长安排2人值日,实验一: 血液标本采集和全血细胞计数,北医三院检验科 Department of Laboratory Medicine , Peking University Third Hospital 乔蕊,Content,血液标本采集（Collection） 全血细胞计数（CBC）,1.血液标本采集 Blood specimen collection,目的: 掌握毛细血管与静脉穿刺采血方法 掌握细胞计数板的使
2、用,血标本采集器材,毛细血管采血 一次性采血针 一次性微量吸管 消毒棉签 安尔碘皮肤消毒剂,静脉穿刺采血 一次性采血针 持针器 止血带 枕垫 消毒棉签 安尔碘皮肤消毒剂 真空采血管,真空采血管 Vacuum tube,静脉穿刺采血 Specimen collection by venipuncture,静脉采血法适用于用血量较多的检查项目。 静脉血标本代表性大，各项成分相对稳定，可反映病人整体状态，可广泛用于各项检查。 如果发生晕针，立即拔针，平卧休息。 体表浅静脉几乎都可以作为采血部位，通常采用肘部静脉。 注意受检者采血的体位、情绪、运动状态、使用某些药物等因素。 真空采血过程无血液外溢和污
3、染，运送方便。封闭状态，无需容器间转移，减少溶血，避免环境暴露的影响。,毛细血管采血 Specimen collection by capillary puncture,实质是微动脉、微静脉和毛细血管的混合血，含有细胞间质和细胞内液。 用血量少，适用于婴儿、大面积烧伤、需频繁采血进行检查的病例。 多选择手指或耳垂部位采血。 穿刺必须够深，使血液自行流出或仅轻施压力即可流出。 微量吸管的容量必须准确，内腔一定要干燥，否则会影响吸血量和导致溶血。,2. 全血细胞计数（CBC）,目的:掌握血细胞计数板的使用方法。 【器材】1. 试管、试管架 2. 5ml吸管、 1ml吸管、吸耳球 3.采血针、微量吸
4、管、胶吸头、干脱脂棉 4.塑料吸管 5.改良牛鲍计数板盖玻片 6.显微镜 【试剂】 红细胞稀释液：枸橼酸钠1g,36%甲醛液1ml,氯化钠0.6g，加蒸馏水至100ml，混匀，过滤2次后备用。 白细胞稀释液：冰乙酸 2.0ml 、 10g/L亚甲蓝 3滴,加蒸馏水至100ml 血小板稀释液(10g/L草酸铵) : 草酸铵10g,EDTA-Na2 0.12g 融于1000ml蒸馏水,Principle,一定倍数稀释的血液或体液，混匀后滴入具有固定体积和精密分划刻度的血细胞计数板中，在显微镜下对所选择方格中的细胞进行计数，再乘以稀释倍数，即可换算成单位体积内的细胞数。,血细胞计数板 Neubaue
5、r hemocytometer,由H型凹槽分为两个同样的计数池。 计数池两侧各有一条支持堤，比计数池平面高出0.1mm。 将特制的专用盖玻片覆盖其上，形成高0.10mm的计数池。,计数池,长、宽各3mm，平均分为9个大格，每个大格面积为1.0mm2容积为0.1mm3( l)。 中央大方格用双线分成25个中方格，其中位于正中及四角的这五个中方格是RBC和PLT计数区。 每个中方格又用单线分为16个小方格，便于计数。 位于四角的四个大方格是WBC计数区，用单线划分为16个中方格，便于计数。,血细胞计数板的使用,充池 静置23min，待细胞下沉 显微镜计数循一定方向逐格进行，以免重复或遗漏。 对压线
6、细胞采用数左不数右，数上不数下的原则。,计算,RBC 5个中方格内RBC数5102001065个中方格内红细胞数1010=红细胞数/L， 报告方式：.1012/L,WBC 4个大方格内WBC数/4 1020106 /L= 白细胞数/L 报告方式：.109/L,实验报告书写,实验一血液标本采集和全血细胞计数 实验目的 实验原理 实验器材 实验步骤 实验结果 实验讨论,实验二: 白细胞分类和网织红细胞检查,内容,静脉血采集 血涂片制备 血涂片染色 白细胞计数 网织红细胞计数,1.血涂片制备 Preparing blood smear,2.Wright-Giemsa staining procedu
7、re,滴加瑞-姬复合染液数滴于血涂片上（以盖住血膜为度），静置约半min，目的在于用染液的甲醇成分固定血细胞。 加相当于染液2倍量的缓冲液充分混匀。 染色约l0min，用水冲去染液，干燥后镜检。,Wright-Giemsa solution ingredients,酸性染料伊红（钠盐）和碱性染料美蓝（氯盐） 伊红钠盐有色部分为阴离子，可与带正电荷的物质结合。 氯化美蓝有色部分为阳离子，可与带负电荷的物质结合。 二者溶解在甲醇中形成可溶性的伊红化美蓝溶液，既可以固定细胞又利于细胞蛋白质选择性地吸附其中有色离子而着色。 氯化美蓝放置久后可氧化为天青，对细胞核染色加强，添上更多色彩，染色效果更好。,
8、Wright-Giemsa staining principle,血红蛋白、嗜酸性颗粒均为碱性物质，故与酸性染料伊红结合而染成红色。 细胞核的核蛋白与原、幼细胞的胞质为酸性物质，故与碱性染料美蓝和天青相结合，染成深蓝色或深紫红色。 中性颗粒与美蓝和伊红同时结合而染为淡紫红色。 瑞氏染粉是由伊红化美蓝组成，对胞质及中性颗粒的着色性极佳，面姬姆萨染粉由天青、伊红组成，对细胞核着色较好，结构显示更清晰。 蛋白质所带电荷随溶液的 pH而定。故为使血片每次染色效果好且趋于一致，需配制pH6.46.8的缓冲液。,3.白细胞分类计数 White blood cell differential count,D
9、C,先用低倍镜选好薄厚适宜、染色良好、细胞分布均匀处，再用油浸镜观察。 通常计数100个白细胞。 按图所示方向移动血涂片，将所遇到的各类白细胞分别记录，直到计数100个白细胞为止。 计算每类白细胞的数目，即其百分数值。,Neutrophils (band) 15% Neutrophils (segmented) 5070% Eosinophils 0.55% Basophils 0-1% Lymphocytes 20-40% Monocytes 38%,血细胞形态学识别规律,原则：核浆兼顾，以核为主 次序：胞体、胞浆、胞核、核仁,Neutrophils,胞体1015m 胞浆量多，淡红色，含许多
10、淡紫红色小颗粒 胞核 band 凹陷的程度超过核直径的一半，核最窄径大于最宽径的1/3，核弯曲成带形、S形、U形、W形等。核染色质粗糙，浓集成小块状，染色不均匀。 Segmented 通常分25叶，彼此间有较细的核丝或较粗的核桥，核最窄径小于最宽径的1/3 。核染色质 粗糙。,Lymphocyte,Large lymphocyte 胞体1218m，圆形。胞浆天蓝色，透明，可有少数较大的嗜苯胺蓝颗粒。胞核类圆形，核染色质固缩成一团，染成紫红色，着色比小淋巴细胞为淡。有时刻隐约可见核仁痕迹。 Small lymphocyte 胞体510m，圆形或椭圆形。胞浆甚少，几近无浆，或在核凹陷侧可见少量蓝色
11、胞浆，颗粒可有可无，常因胞浆过少而看不到颗粒。胞核占细胞的极大部分，圆形或豆形，核染色质凝缩，染成紫红色，无核仁。,Monocytes,胞体圆形或不规则形，1220m 胞浆较多，淡灰蓝色，可见灰尘洋细微红色或红紫色颗粒（嗜苯胺蓝颗粒） 胞核呈肾形、马蹄形或分叶状等，有的扭曲折叠，偶见圆形核的。染色质呈疏松网状，染紫红色。 无核仁，偶见核仁遗迹。,Eosinophils,胞体1018m 充满等大圆形桔红色颗粒 胞核 band 呈弯曲杆状、马蹄形，核最窄径大于最宽径的1/3，核染色质粗糙。 Segmented 多为2叶，呈双逗点状，也有35叶。叶间有核丝或较粗的核桥，核最窄径小于最宽径的1/3 。
12、核染色质 粗糙。,Basophils,胞体1014m ，类圆形 胞浆淡蓝色，常被颗粒所掩盖，颗粒大小不等，形态不规则，染成紫褐色、蓝很色或暗红色，不透明。颗粒染色深浅与分布不一致，有时颗粒可遮盖核。 胞核 band 弯曲成肾形，核染色质粗糙固缩。 Segmented 分叶状，但形态不如中性和嗜酸性粒细胞的核叶清楚。,异型淋巴细胞,型（泡沫型）,型（不规则型）,型（幼稚型）,实验三 红细胞形态的观察,【目的】掌握正常红细胞和各种形态异常红细胞特点。 【原理】血液涂片经瑞士吉姆萨染色后在显微镜下观察，判断红细胞是否出现大小，形态、结构异常。,红细胞形态,红细胞大小不均(anisocytosis),
13、红细胞结构异常 Howell-Jolly body,Cabot ring,球形红细胞 椭圆形红细胞,口形红细胞 棘形红细胞,靶形红细胞,泪滴形红细胞,镰形红细胞,红细胞缗钱状形成,4.网织红细胞计数 Reticulocyte count,目的：了解网织红细胞的活体染色过程、形态学特点、计数方法，掌握其参考值和临床意义。 原理：网织红细胞是晚幼红细胞脱核后到完全成熟的红细胞之间的过渡型细胞。由于其胞质中尚残存核糖体等嗜碱性物质，故经煌焦油蓝染液活体染色后，可见有蓝绿色的点状、线状或网织样结构，故名网织红细胞。其点线状结构愈多，表示细胞越年轻，反之则更近于成熟红细胞。,Procedure,小试管中
14、 加1%煌焦油蓝生理盐水溶液2滴。 在加全血2滴，立即混匀，室温下染色15min。 倾出l小滴以15度角制备薄涂片。 干后，低倍镜下选细胞分布均匀，着色清晰处，油浸镜下进行观察。 为便于计数，可于接目镜筒中放一缩小视野用的具有直径为3mm圆孔的纸片。 计数1000个红细胞，记录其中的网织红细胞数。即可得出网织红细胞的百分数值。 如1000个红细胞中见到6个网织红细胞，则百分率为0.6%,1煌焦油蓝生理盐水溶液： 煌焦油蓝 1.0g 枸橼酸钠 0.4g 氯化钠 0.85g 蒸馏水加到100mI Refernence range Adult 0.51.5% Newborns 2-6%,Reticu
15、locyte,丝球型 鱼网型 破网型 点粒型,Clinical significance,各种增生性贫血时Ret增高，造血功能障碍时Ret 减低。 观察贫血治疗的疗效。 可作为肿瘤化疗、骨髓移植后骨髓造血功能受抑或恢复的观察指标。,3.红细胞沉降率 Erythrocyte sedimentation rate ESR,目的：了解血沉的操作技术及读取方法，掌握其参考值及临床意义。 原理：血液经枸橼酸钠抗凝后，吸于特制的血沉管中，垂直竖立1小时，观察其红细胞下沉的速度，以所暴露出的血浆段的高度（mm）表示。 动态测定法：在计算机控制下通过光电技术定时扫描红细胞与血浆的界面位置。 Male: 015
16、mm/h; Female020mm/h,实习三: 血液分析仪使用及性能评价,血液分析仪 Hematology Analyer,两大功能 细胞计数功能 细胞分类功能 原理 电阻抗法 光散射法,Sysmex KX-21 ：三分群 Beckman Coulter STKS ：五分类,电阻抗原理 Principle of electrical impedance,Coulter principle 根据血细胞相对非导电的性质，悬浮在电解质溶液中的血细胞颗粒，在通过计数小孔时可引起电阻的变化为基础，对血细胞进行计数和体积测定。,电阻抗原理计数 Principle of electrical impeda
17、nce,将等渗电解质溶液稀释的细胞悬液置入不导电的容器中，将小孔管（transducer）插进细胞悬液中。 小孔管内充满电解质溶液，并有一个内电极，小孔管的外侧细胞悬液中有一个外电极。 接通电源后，位于小孔两侧的电极产生稳定的电流。 当细胞通过小孔时，瞬间引起了电压变化而出现一个脉冲信号。 脉冲大小反映细胞体积大小，脉冲数量代表细胞数量。,Sysmex KX-21,电阻抗原理分类（三分群）,不同体积的白细胞通过小孔时产生的脉冲大小有明显差异，根据这些脉冲大小，可对白细胞进行分群。 小细胞区：主要是淋巴细胞 单个核细胞区(也 称作中间细胞) :主要包括单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞 大细胞
18、区：主要是中性粒细胞,容量、电导、光散射检测原理（VCS） Volume conductivity light scantter,Volume：应用电阻抗原理测量细胞体积 Conductivity：根据细胞壁能产生高频电流的性能，采用高频电磁探针，测量细胞内部结构，即以细胞核和细胞质的比例、细胞内颗粒的大小和密度，来辨别体积相同，但性质不同的两个细胞群体。 Light scatter:来自激光的单色光直接扫描进入计数敏感区的每一个细胞，根据细胞产生的不同角度的散射光(1070)，可提供细胞形态、核结构等光散射信息，并能鉴别细胞颗粒的构型和质量（粗颗粒的光散射比细颗粒更强）；光散射可区别粒细胞的
19、类型。,Volume conductivity light scantter,Beckman Coulter STKS,血液分析仪的主要评估项目,1仪器准确度性能评价 2仪器精密度性能评价 3仪器携带污染性能评价 4分析测量范围性能评价 5仪器不同模式可比性评价,准确度验证,A)分析参考物质 B)参加室间质量评价 C) 分割样品对比,仪器准确度性能评价,准确度：测量准确度，是检测结果与被测量真值之间的一致程度 评价材料：scs-1000校准品 评价方法：scs-1000校准品说明书 评价标准：血液分析仪校准要求,仪器精密度性能评估,精密度：指规定条件下所获得的独立检测结果的接近程度。 评价材料
20、：新鲜血或质控 评价方法：取高，中和低三水平的新鲜血连续重复测定10或20次，计算其CV，CV满足下表 评价标准：仪器操作手册,准确度和精密度,仪器携带污染性能评价,携带污染： 评价材料：高，低值新鲜血 评价方法：取高值新鲜血连续测定3次记做（H1，H2，H3），立即用低值血连续测定3次记做（L1，L2，L3）。计算：（L3-L1）/（H3-L3）100% 评价标准： 仪器操作手册,分析测量范围的性能评估,分析测量范围：指患者样本未经任何处理，由检测系统直接测量得到的可靠结果范围 评价材料：高值血，稀释液 评价方法： 1.取高，低值样本按下表比例混合，每个浓度重复测量3次,仪器不同模式可比性评价,评价材料：临床样本，覆盖常见的测量范围 评价方法：至少取5份样本（高，中，低）在参考仪器和比对仪器上做双次测试，分别计算其均值，比对：（参均-比均）/参均100% 评价标准：北京市二级以上医院医学检验科校准和实施指南,
