1、抗体工程制药抗体工程制药20112011年年6 6月月第一节第一节 概述概述第二节第二节 单克隆抗体单克隆抗体第三节第三节 基因工程抗体基因工程抗体第四节第四节 噬菌体抗体工程噬菌体抗体工程第五节第五节 转基因动物表达抗体转基因动物表达抗体第六节第六节 抗体工程在制药功业上的应用抗体工程在制药功业上的应用第一节第一节 概概 述述一、抗体定义一、抗体定义抗体（抗体（antibody，Ab）：）：指能与相应抗原指能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。免疫球蛋白（免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）:具有具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白抗
2、体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白IgAb化学结构上的概念化学结构上的概念生物学功能上的概念生物学功能上的概念二、抗体工程发展历程二、抗体工程发展历程1890年，年，Behring和北里柴三郎发现白喉抗毒素和北里柴三郎发现白喉抗毒素1937年，年，Tiselius等人用电泳法将血清蛋白分为等人用电泳法将血清蛋白分为白蛋白、甲种（白蛋白、甲种（）球蛋白、乙种（）球蛋白、乙种（）球蛋白、）球蛋白、丙种（丙种（）球蛋白，并证明抗体活性主要存在于）球蛋白，并证明抗体活性主要存在于丙种球蛋白组分。丙种球蛋白组分。1975年，年，Khler and Milstein等首次利用等首次利用B淋巴淋巴细胞杂交瘤
3、技术制备出细胞杂交瘤技术制备出 McAb.在临床上主要用于在临床上主要用于诊断和治疗。诊断和治疗。1984年报道了人年报道了人鼠嵌合抗体鼠嵌合抗体 多克隆抗多克隆抗体体单克隆单克隆抗体抗体基因工程基因工程抗体抗体三、抗体分子的结构与功能三、抗体分子的结构与功能1、酶解片段、酶解片段木瓜蛋白酶 (1)Fab(1)Fab段段2 2个个(2)Fc(2)Fc段段 1 1个个 胃蛋白酶 (1)F(ab)2 段段 1个个 (2)Fc段段 1个个 (1)Fab(1)Fab段段2 2个抗原结合片段个抗原结合片段 fragment with antigen binding (2)Fc段段 1个可结晶片段个可结晶
4、片段 fragment crystallized （1）Porter 木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶 (1)F(ab)2 段段 1个个 结合颗粒性抗原出现凝集反应结合颗粒性抗原出现凝集反应 (2)Fc段段 1个个 无生物学活性无生物学活性（2）Nisonoff 胃蛋白酶胃蛋白酶（1 1）、轻链（）、轻链（light chainlight chain，L L链）链）214214个氨基酸残基，个氨基酸残基，24KD24KD。分为：分为：与与2 2个亚型。个亚型。（2 2）、重链（）、重链（heavy chainheavy chain，H H链）链）450-550450-550个氨基酸残基，个氨基酸残基，55
5、-75KD55-75KD。分为分为5 5类，类，、链。链。IgMIgM，IgGIgG，IgAIgA，IgDIgD，IgEIgE。2、重链和轻链、重链和轻链 3、可变区和恒定区、可变区和恒定区（1 1）可变区（）可变区（Variable regionVariable region，V V区）区）L L链链N N端端 1/21/2处处（VLVL）110110个个aaaa;H H链链N N端端1/5-1/41/5-1/4处处（VHVH）118118个个aaaa。互补决定区互补决定区（complementaritycomplementarity-determining-determining regi
6、on,CDRregion,CDR），），HVR1HVR1，HVR2HVR2，HVR3HVR3又分别称为又分别称为CDR1CDR1，CDR2CDR2，CDR3CDR3骨架区骨架区（framework region,FRframework region,FR）高变区高变区（hypervariablehypervariable region,HVR region,HVR）（2 2）恒定区（）恒定区（constant regionconstant region，C C区）区）L L链链C C端端1/21/2处，处，105105个个aaaa;H H链链C C端端3/4-4/53/4-4/5处，处，331
7、-431331-431个个aaaa。4、功能区、功能区（1 1）L L链：链：2 2个，个，VLVL，CLCL各各1 1（2 2）H H链：链：IgGIgG，IgAIgA，IgDIgD：4 4个（个（V V区区1 1个，个，C C区区3 3个）个）IgMIgM，IgEIgE：5 5个（个（V V区区1 1个，个，C C区区4 4个）个）（3 3）功能区的作用：）功能区的作用：（a a）VLVL和和VHVH：结合抗原决定簇（：结合抗原决定簇（FVFV区）区）（b b）CLCL和和CHCH：具有同种异型的遗传标记：具有同种异型的遗传标记（c c）CH2CH2：结合补体：结合补体（d d）CH3CH
8、3：结合：结合FcFc受体受体单核细胞，巨噬细胞，粒细胞，单核细胞，巨噬细胞，粒细胞，B B细胞，细胞，NKNK细胞细胞C+V2Fab+FcF(ab)2+FcV=FR+HVR=FR+CDRC=CL+CH1+CH2+CH3Ab=CDR1CDR2CDR3第二节第二节 单克隆抗体单克隆抗体 McAb是将抗体产生细胞与具有无限增殖能是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞融合，通过有限稀释法及克隆力的骨髓瘤细胞融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的。由于这种抗体是针对一个抗原决定族的生的。由于这种抗体是针对一个抗原决定族的抗
9、体，又是单一的抗体，又是单一的B淋巴细胞克隆产生的，故淋巴细胞克隆产生的，故称为单克隆抗体。称为单克隆抗体。一、单克隆抗体制备过程一、单克隆抗体制备过程注射抗原注射抗原 B淋巴细胞淋巴细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞细胞融合、筛选细胞融合、筛选杂交瘤细胞杂交瘤细胞细胞培养细胞培养筛选，继续培养筛选，继续培养足够数量的、能产生足够数量的、能产生特定抗体的细胞群特定抗体的细胞群 体外培养体外培养（注射到小鼠腹腔）（注射到小鼠腹腔）体内培养体内培养单克隆抗体单克隆抗体传统传统抗血清抗血清抗抗 原原免免 疫疫所有抗所有抗体体混合混合1 234BALB/c12341 234多克隆抗体制备过程多克隆抗体制备过程1
10、234mmmm12341234单单抗抗细胞融合细胞融合取出脾細胞取出脾細胞+癌細胞癌細胞各抗各抗体体分分开开单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程1 1、抗原与动物免疫、抗原与动物免疫 抗原：颗粒性抗原和可溶性抗原抗原：颗粒性抗原和可溶性抗原免疫动物：免疫动物：BALB/cBALB/c小鼠或小鼠或LouLou大鼠大鼠免疫方法：体内免疫和体外免疫免疫方法：体内免疫和体外免疫2 2、细胞融合与杂交瘤细胞的选择培养、细胞融合与杂交瘤细胞的选择培养 基本方法：取适量脾细胞（基本方法：取适量脾细胞（1*108）与骨髓瘤）与骨髓瘤细胞（细胞（2*1073*107）进行混合，在）进行混合，在PEG作用作用下诱
11、导它们融合，时间控制在下诱导它们融合，时间控制在2min以内，然以内，然后用培养液将后用培养液将PEG融合液缓慢稀释融合液缓慢稀释 用于细胞融和的骨髓瘤细胞应具备融和率高，用于细胞融和的骨髓瘤细胞应具备融和率高，自身不分泌抗体，所产生的杂交瘤细胞分泌抗体的自身不分泌抗体，所产生的杂交瘤细胞分泌抗体的能力强且长期稳定等特点。能力强且长期稳定等特点。PEG的相对分子质量和浓度越大，其促融和率越的相对分子质量和浓度越大，其促融和率越高。但其黏度和对细胞的毒性也随之增大。常用浓高。但其黏度和对细胞的毒性也随之增大。常用浓度为度为40%50%，相对分子质量，相对分子质量4000为佳。相对分子为佳。相对分
12、子质量在质量在4006000，浓度在，浓度在10%60%范围内的范围内的PEG都都能使细胞发生融合。为了提高融合率，在能使细胞发生融合。为了提高融合率，在PEG 溶液溶液中加入中加入DMSO，以提高细胞接触的紧密性，增加融，以提高细胞接触的紧密性，增加融合率。但必须严格限制接触时间。合率。但必须严格限制接触时间。（1 1）细胞融合液中的细胞类型：）细胞融合液中的细胞类型：4 4或或5 5种。种。（2 2）如何去除脾）如何去除脾-瘤以外的融和细胞？瘤以外的融和细胞？HAT培养基：培养基：H（Hypoxanthine）:次黄嘌呤次黄嘌呤A（Aminopterin）：）：氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻氨基
13、喋呤；叶酸拮抗物，阻断断DNA合成主要途径合成主要途径 T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前体核苷酸前体”，供细胞通过替代途径合成供细胞通过替代途径合成DNAHATHAT选择作用：选择作用：淋巴细胞：淋巴细胞：不能生长，不能生长，5 57 7天死亡；天死亡；DNADNA合成合成的主要途径被的主要途径被A A阻断阻断骨髓瘤细胞：骨髓瘤细胞：不能生长，不能生长，5 57 7天死亡；天死亡；HGPRTHGPRT缺乏，缺乏，DNADNA合成的替代途径受阻合成的替代途径受阻 杂交瘤细胞：杂交瘤细胞：长期生长繁殖；利用淋巴细长期生长繁殖；利用淋巴细胞的胞的HGPRT，将，将H合
14、成为嘌呤碱并最终与合成为嘌呤碱并最终与T一一起合成起合成DNA3 3、筛选阳性克隆与克隆化、筛选阳性克隆与克隆化 常用的克隆化方法：有限稀释法和软琼脂法。常用的克隆化方法：有限稀释法和软琼脂法。有限稀释法：把杂交有限稀释法：把杂交瘤细胞悬液稀释后，加入到瘤细胞悬液稀释后，加入到9696孔板孔板，使每孔中在理论上只含有一个细胞。第一，使每孔中在理论上只含有一个细胞。第一次克隆化时也要应用次克隆化时也要应用HTHT培养液，以后的克隆化可用培养液，以后的克隆化可用不含不含HTHT的的RPMI 1640RPMI 1640培养液。培养液。软琼脂法：在培养液中加入软琼脂法：在培养液中加入0.5%0.5%的
15、琼脂糖凝胶，的琼脂糖凝胶，细胞分裂后形成小球样团块，由于培养基是半固体细胞分裂后形成小球样团块，由于培养基是半固体状态，可用吸管吸出，移入状态，可用吸管吸出，移入9696孔板培养。孔板培养。4 4、单抗检测、单抗检测RIARIA（放射免疫测定）（放射免疫测定）ELISAELISA（酶联免疫吸附试验）（酶联免疫吸附试验）FACSFACS（流式细胞仪）（流式细胞仪）IFAIFA（间接免疫荧光法）（间接免疫荧光法）配制方案：配制方案：杂交瘤细胞（杂交瘤细胞（1 15 5）x10 x106 6/ml)+/ml)+细胞冻存液细胞冻存液(30%(30%40%40%牛血清，牛血清，50%50%60%RPMI
16、-164060%RPMI-1640培养液，培养液，10%DMSO)10%DMSO)“慢冻慢冻”：分步冷冻，分步冷冻，30-7030-70液氮液氮“快融快融”：取出立即浸入取出立即浸入37374040水浴中，使其迅速融化、水浴中，使其迅速融化、复苏复苏5 5、杂交瘤细胞的冻存与复苏、杂交瘤细胞的冻存与复苏细胞冷冻的意义：细胞冷冻的意义：防止污染防止污染避免染色体丢失避免染色体丢失防止非分泌细胞的过度生长防止非分泌细胞的过度生长防止细胞密度过高而死亡防止细胞密度过高而死亡 经过反复克隆化获得的抗体阳性杂交瘤细胞株应经过反复克隆化获得的抗体阳性杂交瘤细胞株应立即扩大培养（除及时冻存的细胞外）。因多次
17、传立即扩大培养（除及时冻存的细胞外）。因多次传代易引起染色体逐渐丢失而使细胞产生抗体能力逐代易引起染色体逐渐丢失而使细胞产生抗体能力逐渐减弱甚至消失，还应尽早使用获得的抗体阳性杂渐减弱甚至消失，还应尽早使用获得的抗体阳性杂交瘤细胞株制备单克隆抗体。交瘤细胞株制备单克隆抗体。6 6、单克隆抗体的大量制备、单克隆抗体的大量制备可获得可获得10g/ml的抗体。多采用的抗体。多采用RPMI 1640培养液，培养液，添加添加10%20%胎牛或小牛血清。但由于培养液中含有胎牛或小牛血清。但由于培养液中含有血清成分，总蛋白量可达血清成分，总蛋白量可达100g/ml以上，给纯化带来以上，给纯化带来困难。加入小
18、牛血清又是发生支原体污染的原因，而困难。加入小牛血清又是发生支原体污染的原因，而且批间质量差异太大，直接且批间质量差异太大，直接影响杂交瘤细胞的生长。影响杂交瘤细胞的生长。改良的方法有：无血清改良的方法有：无血清培养法、悬浮培养法、微载体培养法、悬浮培养法、微载体悬浮悬浮培养法。培养法。无血清培养法无血清培养法：利用白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、乙：利用白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺等混合物代替小牛血清。此法虽可减少污染，但醇胺等混合物代替小牛血清。此法虽可减少污染，但产量不高。产量不高。悬浮培养法悬浮培养法：连续悬浮培养的细胞密度可：连续悬浮培养的细胞密度可2*107/ml,收收集的单克隆抗体
19、可达集的单克隆抗体可达400 g/ml。如在培养液中加入微。如在培养液中加入微载体，细胞密度可达载体，细胞密度可达108。（1）体外培养法：）体外培养法：基本程序：接种前基本程序：接种前12周，小鼠腹腔注射周，小鼠腹腔注射0.5ml Pristane（降植烷）或用液体石蜡，然后注射（降植烷）或用液体石蜡，然后注射1*106杂杂交瘤细胞，交瘤细胞，712d便有腹水生成，待生成腹水后再提便有腹水生成，待生成腹水后再提取，离心去细胞沉淀，取上清液冻存。取，离心去细胞沉淀，取上清液冻存。优点：操作简便，比较经济，所得单克隆抗体量多优点：操作简便，比较经济，所得单克隆抗体量多且效价高，还可有效地保存杂交
20、瘤细胞株和分离已污且效价高，还可有效地保存杂交瘤细胞株和分离已污染杂菌的杂交瘤细胞株。染杂菌的杂交瘤细胞株。缺点：小鼠腹水中混有来自小鼠的多种杂蛋白，给缺点：小鼠腹水中混有来自小鼠的多种杂蛋白，给纯化带来难度。纯化带来难度。（2）动物体内诱生法）动物体内诱生法可获得可获得10m/ml的抗体。常用方法的抗体。常用方法。腹腔注射法腹腔注射法7 7、单克隆抗体的纯化、单克隆抗体的纯化根据根据Ig的类和亚类以及用途选择不同的纯化方法：的类和亚类以及用途选择不同的纯化方法：体外诊断试剂体外诊断试剂IgG类类-沉淀处理沉淀处理+亲和层析亲和层析 IgM类类-沉淀处理沉淀处理+凝胶过滤凝胶过滤体内诊断试剂或
21、治疗用药体内诊断试剂或治疗用药-亲和层析亲和层析+阴离子交换阴离子交换层析，注意除去毒素、病毒、核酸等微量的污染物。层析，注意除去毒素、病毒、核酸等微量的污染物。盐析沉淀盐析沉淀亲和层析亲和层析离子交换层析离子交换层析 McAbMcAb的纯化的纯化 8 8、单克隆抗体的性质鉴定单克隆抗体的性质鉴定IgIg类型、亚类测定：类型、亚类测定：双扩法或双扩法或ELISAELISA法法特异性测定：特异性测定：抗原类似物的交叉反应抗原类似物的交叉反应效价测定：效价测定：用腹水或培养液的稀释度表示用腹水或培养液的稀释度表示表位测定：表位测定：几株单抗是否为不同表位特异的几株单抗是否为不同表位特异的,用竞用竞
22、 争抑制争抑制法，相加指数法及微机集群分析法，相加指数法及微机集群分析亲和性测定：亲和性测定：测定亲和常数测定亲和常数K K杂交瘤细胞染色体：杂交瘤细胞染色体：秋水仙素裂解法，小鼠秋水仙素裂解法，小鼠B B细胞染色体细胞染色体4040条，条，SP2/0SP2/0细胞细胞6868条，杂交瘤细胞一般条，杂交瘤细胞一般100100多条多条McAbMcAb靶抗原分子量：靶抗原分子量：常用常用western blotwestern blot单克隆抗体的特性单克隆抗体的特性高度特异性高度特异性高度的均一性和可重复性高度的均一性和可重复性 弱凝集反应和不呈现沉淀反应弱凝集反应和不呈现沉淀反应对环境敏感性对环
23、境敏感性A、McAb均是鼠源性抗体，应用于人体内可产均是鼠源性抗体，应用于人体内可产生人抗鼠抗体（生人抗鼠抗体（HAMA），加速了排斥反应，），加速了排斥反应，在人体内的半衰期只有在人体内的半衰期只有56h，维持有效药物作，维持有效药物作用靶组织时间；用靶组织时间；B、完整的抗体分子的相对分子质量过大，难、完整的抗体分子的相对分子质量过大，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效的治疗浓度。以穿透实体肿瘤组织，达不到有效的治疗浓度。McAb 在免疫导向疗法中存在的问题（障碍）：在免疫导向疗法中存在的问题（障碍）：A、降低、降低McAb的免疫源性；的免疫源性；B、降低、降低McAb的相对分子质量的相对分
24、子质量需要解决的问题：需要解决的问题：解决问题的方法或途径解决问题的方法或途径基因工程技术基因工程技术 1984年报道了人年报道了人鼠嵌合抗体，之后制备鼠嵌合抗体，之后制备出了改型抗体、单链抗体、单域抗体、最小出了改型抗体、单链抗体、单域抗体、最小识别单位等多种类型，基本上消除了抗体的识别单位等多种类型，基本上消除了抗体的鼠源性（免疫源性），相对分子质量只有完鼠源性（免疫源性），相对分子质量只有完整抗体分子的整抗体分子的1/801/3。优点优点 ：在体外在体外“永久永久”地存活并传代地存活并传代用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。适用
25、于以标记抗体为特点的免疫学分析方法体。适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗单克隆抗体的优点与局限性单克隆抗体的优点与局限性局限性局限性 ：固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围反应强度不如多克隆抗体反应强度不如多克隆抗体制备技术复杂、费时费工、价格较高制备技术复杂、费时费工、价格较高第三节第三节 基因工程抗体基因工程抗体基因工程抗体基因工程抗体(Genetic engineering antibody)指用基因工程方法，对抗体的基因进行重组、指用基因工程方法，对抗
26、体的基因进行重组、缺失、修饰改型等，构建载体，在受体细胞中表缺失、修饰改型等，构建载体，在受体细胞中表达，获得抗体。达，获得抗体。将小鼠将小鼠IgIg基因敲除，转染人基因敲除，转染人IgIg基因，在基因，在小鼠体内产生人小鼠体内产生人AbAb，再经杂交瘤技术，产生，再经杂交瘤技术，产生大量完全人源化抗体大量完全人源化抗体一、人源化抗体一、人源化抗体鼠源性单克隆抗体的改造目的和原理鼠源性单克隆抗体的改造目的和原理目的：一是降低免疫源性；目的：一是降低免疫源性；二是降低相对分子量，增加组织通透性二是降低相对分子量，增加组织通透性 原理：抗体同抗原结合的功能决定于抗体分子原理：抗体同抗原结合的功能决
27、定于抗体分子的可变区（的可变区（V V），同种性免疫源性则决定于抗体），同种性免疫源性则决定于抗体分子的稳定区（分子的稳定区（C C）。在基因水平上把鼠源性单）。在基因水平上把鼠源性单克隆抗体的克隆抗体的H H和和L L链的链的V V区基因分离出来，分别与区基因分离出来，分别与人人IgIg的的H H链和链和L L链的链的C C区基因连接，即成为人区基因连接，即成为人鼠鼠嵌合抗体的嵌合抗体的H H和和L L链基因，再共转染骨髓瘤细胞，链基因，再共转染骨髓瘤细胞，就能表达出完整的嵌合抗体就能表达出完整的嵌合抗体.人一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区与人抗体的人一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区与人抗体
28、的恒定区融合而得到的抗体。恒定区融合而得到的抗体。方法：方法：将鼠源单抗的可变区基因克隆出来，连到包含有人将鼠源单抗的可变区基因克隆出来，连到包含有人抗体恒定区基因及表达所需的其它元件抗体恒定区基因及表达所需的其它元件(如启动子、增如启动子、增强子、选择标记等强子、选择标记等)的表达载体上，在哺乳动物细胞的表达载体上，在哺乳动物细胞(如骨髓瘤细胞、如骨髓瘤细胞、CHOCHO细胞细胞)中表达。中表达。特点：特点：减少了鼠源性抗体的免疫原性减少了鼠源性抗体的免疫原性 保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力（一）嵌合抗体（一）嵌合抗体 尽管嵌合抗体的免疫原性已降低很多，
29、但有时尽管嵌合抗体的免疫原性已降低很多，但有时它仍可能引发较强的免疫反应。为了进一步降低抗它仍可能引发较强的免疫反应。为了进一步降低抗体的鼠源成分，发展出体的鼠源成分，发展出CDRCDR移植技术。移植技术。CDRCDR移植即把鼠抗体的移植即把鼠抗体的CDRCDR序列移植到人抗体的序列移植到人抗体的可变区内，所得到的抗体称可变区内，所得到的抗体称CDRCDR移植抗体或改型抗移植抗体或改型抗体，也就是人源化抗体。体，也就是人源化抗体。（二）改型抗体（二）改型抗体 经过经过CDRCDR移植，抗移植，抗体的免疫原性极低，而体的免疫原性极低，而其抗原结合能力保持不其抗原结合能力保持不变变 结合半抗原及全
30、抗原结合半抗原及全抗原(如如细胞表面受体、病毒等细胞表面受体、病毒等)的的改形抗体都已有报道，到改形抗体都已有报道，到现在已有数百种人源化抗现在已有数百种人源化抗体。（美国正式上市的体。（美国正式上市的11种治疗性单抗中多数是改种治疗性单抗中多数是改型抗体）型抗体）FabFab：抗原结合片断抗原结合片断FvFv：可变区片段可变区片段ScFvScFv：单链可变区片段单链可变区片段单域抗体单域抗体最小识别单位最小识别单位 二、小分子抗体二、小分子抗体分子量较小但具有抗原结合功能的分子片段。分子量较小但具有抗原结合功能的分子片段。基基因工程小分子抗体仅表达鼠源性单克隆抗体的因工程小分子抗体仅表达鼠源
31、性单克隆抗体的V V区片段，其相对分子质量仅为原抗体区片段，其相对分子质量仅为原抗体1/801/31/801/3。(3)(3)单域抗体单域抗体(4)(4)最小识别单位最小识别单位可以用细菌发酵生产，成本低可以用细菌发酵生产，成本低;分子小，穿透力强分子小，穿透力强;不含不含Fc，没有，没有Fc带来的效应带来的效应;在体内循环的半衰期短，易清除，利于解毒排出在体内循环的半衰期短，易清除，利于解毒排出;易于与毒素或酶基因连接，便于直接获得免疫毒易于与毒素或酶基因连接，便于直接获得免疫毒素或酶标抗体等素或酶标抗体等。小分子抗体的优点及应用小分子抗体的优点及应用应用：应用：用于肿瘤的导向治疗用于肿瘤的
32、导向治疗肿瘤的影像分布肿瘤的影像分布基因治疗基因治疗优点优点：三、双特异性抗体和多价抗体三、双特异性抗体和多价抗体 分别分离纯化两种不同的分别分离纯化两种不同的McAbMcAb，使各抗体，使各抗体解离为单价抗体，再使两种不同抗原特异性的解离为单价抗体，再使两种不同抗原特异性的单价抗体通过化学试剂交联起来，然后分离出单价抗体通过化学试剂交联起来，然后分离出目的组分。此法缺点是容易导致抗体失去活性，目的组分。此法缺点是容易导致抗体失去活性，产物均一性不佳。产物均一性不佳。化学交联化学交联BsAb 将两种分泌不同特异性单抗的杂交瘤细胞进将两种分泌不同特异性单抗的杂交瘤细胞进行再次融合，产生四源杂交瘤
33、行再次融合，产生四源杂交瘤 (quadroma(quadroma)。但但二次杂交瘤细胞株分泌的是两套重链，轻链的随二次杂交瘤细胞株分泌的是两套重链，轻链的随机组合物。机组合物。BsAbBsAb在其中的比例可为在其中的比例可为10%10%50%50%不等。不等。多倍杂交瘤细胞的稳定性差，多倍杂交瘤细胞的稳定性差，BsAbBsAb的产量少且活的产量少且活性低，费时费力，临床应用时存在人抗鼠抗体免性低，费时费力，临床应用时存在人抗鼠抗体免疫反应疫反应 (HAMA)(HAMA)，因此不适用于临床。，因此不适用于临床。细胞工程细胞工程BsAb 多采用抗体分子片段多采用抗体分子片段,如如FabFab，Fv
34、Fv或或ScFvScFv,经基因操作修饰后经基因操作修饰后,或体或体外组装为外组装为BsAbBsAb,或直接表达分泌型或直接表达分泌型的的BsAbBsAb。基因工程基因工程BsAb从广义讲应属于双功能抗体范畴。从广义讲应属于双功能抗体范畴。（1）配基）配基配基型融合蛋白，如配基型融合蛋白，如 CD4-Fc.（2）配基）配基Ig型嵌合抗体，如型嵌合抗体，如 IL-2-Ig（3）配基）配基FV型嵌合蛋白，如型嵌合蛋白，如 CD4-FVCD3 (4)受体受体FV型融合蛋白型融合蛋白（5）酶）酶抗体型融合蛋白（抗体型融合蛋白（abeneyme,抗体酶）抗体酶）四、抗体融合蛋白四、抗体融合蛋白第四节第四
35、节 噬菌体抗体工程噬菌体抗体工程用用PCRPCR扩增人抗体重链可变区扩增人抗体重链可变区(VH)(VH)和轻链可变区和轻链可变区(VL)(VL)基因基因克隆到噬菌体载体并以融合蛋白的形式表达在其外壳表面克隆到噬菌体载体并以融合蛋白的形式表达在其外壳表面用抗原抗体反应筛选出表达所需要抗体的克隆并扩增。用抗原抗体反应筛选出表达所需要抗体的克隆并扩增。使抗体基因以分泌的方式表达，获得可溶性的抗体片段。使抗体基因以分泌的方式表达，获得可溶性的抗体片段。抗体库：抗体库：组合抗体文库：在建库过程中如果将组合抗体文库：在建库过程中如果将VHVH和和VLVL随机组合随机组合 人天然抗体库：抗体人天然抗体库：抗
36、体mRNAmRNA来源于未经免疫的正常人来源于未经免疫的正常人（一）基本原理和程序（一）基本原理和程序噬菌体抗体库噬菌体抗体库（二）噬菌体表面展示文库技术的要点（二）噬菌体表面展示文库技术的要点外源基因表达多肽以融合蛋白形式展示在外壳蛋白外源基因表达多肽以融合蛋白形式展示在外壳蛋白N N端端将基因组合文库插入噬菌体编码膜蛋白的基因将基因组合文库插入噬菌体编码膜蛋白的基因 g3g3或或g8 g8 的先导的先导系列的紧靠下游系列的紧靠下游随机克隆入相应载体形成组合文库随机克隆入相应载体形成组合文库从免疫或未被免疫的从免疫或未被免疫的B B细胞中细胞中PCRPCR扩增抗体全套基因片段扩增抗体全套基因
37、片段用固相化抗原经用固相化抗原经“亲和结合一洗脱一扩增亲和结合一洗脱一扩增”数个循环直接、方便、数个循环直接、方便、简捷、高效地筛选出表达特异性好、亲和力强的抗体噬菌体库。简捷、高效地筛选出表达特异性好、亲和力强的抗体噬菌体库。使翻译出的抗体分泌到细菌的质周腔内，形成游离的抗体片段，经使翻译出的抗体分泌到细菌的质周腔内，形成游离的抗体片段，经过纯化即可获得目的抗体。过纯化即可获得目的抗体。筛选到的噬菌体再将基因筛选到的噬菌体再将基因g3g3或或g8g8切除后，转入大肠杆菌，切除后，转入大肠杆菌，（三）噬菌体抗体库技术的特点（三）噬菌体抗体库技术的特点 1 1、模拟天然全套抗体库、模拟天然全套抗
38、体库 抗体文库可以达到或超过抗体文库可以达到或超过10101111库容，所以库容，所以能包含能包含B B细胞全部克隆。建库的外源基因来自人细胞全部克隆。建库的外源基因来自人体外周血、骨髓或脾脏的淋巴细胞提取的体外周血、骨髓或脾脏的淋巴细胞提取的mRNAmRNA反转录形成的反转录形成的cDNAcDNA扩增，这是人体多克隆细胞扩增，这是人体多克隆细胞的总的总mRNAmRNA。使用的通用引物采自多个人体，具。使用的通用引物采自多个人体，具有人的种属普遍性。抗体的有人的种属普遍性。抗体的VHVH和和VLVL基因的随机基因的随机重组也增加了抗体的多样性。重组也增加了抗体的多样性。2 2、避开了人工免疫和
39、杂交瘤技术、避开了人工免疫和杂交瘤技术 由于抗体库的大容量和极高的筛选效率，由于抗体库的大容量和极高的筛选效率，使得可以调出任意抗体基因，用基因工程方法使得可以调出任意抗体基因，用基因工程方法制备抗体，因而能避免使用人工免疫动物和细制备抗体，因而能避免使用人工免疫动物和细胞融合技术。胞融合技术。3 3、可获得高亲和力的人源化抗体、可获得高亲和力的人源化抗体 在噬菌体抗体库技术中，在噬菌体抗体库技术中，VHVH和和VLVL基因的随机基因的随机重组模拟了体内抗体亲和力成熟的过程，所用的重组模拟了体内抗体亲和力成熟的过程，所用的抗体基因又来自人体，因此，所产生的抗体必然抗体基因又来自人体，因此，所产
40、生的抗体必然都是高亲和力的人源化抗体。都是高亲和力的人源化抗体。1.1.原核细胞表达：原核细胞表达：2.2.真核细胞表达：酵母、昆虫细胞、中国仓真核细胞表达：酵母、昆虫细胞、中国仓鼠卵细胞、真菌等。鼠卵细胞、真菌等。3.3.转基因植物表达：烟草叶和拟南芥植物。转基因植物表达：烟草叶和拟南芥植物。其产量可达叶片总蛋白量的其产量可达叶片总蛋白量的1.3%1.3%。4.4.转基因动物表达：单基因水平上做转基因转基因动物表达：单基因水平上做转基因鼠。鼠。基因工程抗体的表达基因工程抗体的表达第五节第五节 转基因动物表达抗体转基因动物表达抗体第六节第六节 抗体诊断试剂和抗体药物抗体诊断试剂和抗体药物 抗原
41、抗体特异性结合，在体内和体外均可呈抗原抗体特异性结合，在体内和体外均可呈现某种反应。在体内，可表现为溶菌、杀菌、促现某种反应。在体内，可表现为溶菌、杀菌、促进吞噬或中和毒素等作用，故抗体类药物可用于进吞噬或中和毒素等作用，故抗体类药物可用于治疗。在体外，由于抗原性状和反应条件不同，治疗。在体外，由于抗原性状和反应条件不同，可发生凝集或沉淀等可见反应，故可用已知抗体可发生凝集或沉淀等可见反应，故可用已知抗体来鉴定抗原，做病原学诊断和血型测定，称为血来鉴定抗原，做病原学诊断和血型测定，称为血清学鉴定。抗体诊断药物基本分为三类：血清学清学鉴定。抗体诊断药物基本分为三类：血清学鉴定用的和免疫标记技术用
42、的抗体制剂，以及体鉴定用的和免疫标记技术用的抗体制剂，以及体内导向诊断药物。内导向诊断药物。一、抗体诊断试剂一、抗体诊断试剂1、血清学鉴定用的抗体类试剂、血清学鉴定用的抗体类试剂（1）鉴定病原菌用的抗体试剂）鉴定病原菌用的抗体试剂直接凝集直接凝集反应反应（2）乙型肝炎病毒表面抗原（）乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的反向）的反向被动血凝诊断试剂被动血凝诊断试剂（3）妊娠诊断试剂）妊娠诊断试剂妇女妊娠后，血液和尿液中的妇女妊娠后，血液和尿液中的HCG含量增高，在含量增高，在3个月内可达到高峰。此时检测尿液中的个月内可达到高峰。此时检测尿液中的HCG，就，就可确定是否怀孕。可确定是否怀孕。（4）
43、抗）抗ABO血型系统血清血型系统血清2、免疫标记技术用的抗体类试剂、免疫标记技术用的抗体类试剂 给抗体标记放射性核素、荧光素或酶活性，给抗体标记放射性核素、荧光素或酶活性，能将抗原抗体反应放大，使常规不能观察的能将抗原抗体反应放大，使常规不能观察的反应得以显现，可对微量抗原进行定性定量反应得以显现，可对微量抗原进行定性定量测定，灵敏度提高。结合显微镜技术，还可测定，灵敏度提高。结合显微镜技术，还可对抗原物质作出组织内或细胞内的定位测定。对抗原物质作出组织内或细胞内的定位测定。除临床诊断外，还能为探讨发病机制提供手除临床诊断外，还能为探讨发病机制提供手段。段。（1）荧光抗体诊断试剂）荧光抗体诊断
44、试剂 荧光抗体是用荧光色素荧光抗体是用荧光色素,如异硫氰酸荧光素如异硫氰酸荧光素（FITC）、罗丹明（）、罗丹明（RB200）、藻红素（）、藻红素（PE）等标记抗体蛋白，即成荧光抗体。用荧光抗体等标记抗体蛋白，即成荧光抗体。用荧光抗体浸染含有抗原物质的组织切片或细胞，荧光抗浸染含有抗原物质的组织切片或细胞，荧光抗体就与抗原结合，在荧光显微镜下成为发光的体就与抗原结合，在荧光显微镜下成为发光的可视物，从而达到诊断和定位的目的。可视物，从而达到诊断和定位的目的。酶标诊断试剂酶标诊断试剂a、HBsAg(乙型肝炎表面抗原乙型肝炎表面抗原)酶标诊断试剂酶标诊断试剂b、HBeAg(乙型肝炎乙型肝炎e抗抗原
45、原)酶标诊断试剂酶标诊断试剂c、HAVAg(甲型肝炎病毒抗原甲型肝炎病毒抗原)酶标诊断试剂酶标诊断试剂d、测定、测定HIV（人免疫缺陷病毒）抗原的酶标诊（人免疫缺陷病毒）抗原的酶标诊断试剂断试剂e、AFP（甲胎蛋白）酶标诊断试剂（甲胎蛋白）酶标诊断试剂f、CEA（癌胚抗原）酶标诊断试剂（癌胚抗原）酶标诊断试剂（2）免疫酶抗体诊断试剂：）免疫酶抗体诊断试剂：把放射性核素分析的高灵敏性与抗原抗体反应的把放射性核素分析的高灵敏性与抗原抗体反应的特异性两大特点结合起来建立的检测技术。能测出特异性两大特点结合起来建立的检测技术。能测出ng/ml，甚至，甚至pg/ml水平的微量抗原物质。水平的微量抗原物质
46、。（3）放射免疫用抗体诊断试剂）放射免疫用抗体诊断试剂常用的标记抗体试剂：常用的标记抗体试剂：a、HBsAg放射性核素标记抗体诊断试剂：放射性核素标记抗体诊断试剂：125I 标记，灵标记，灵敏度敏度0.1 ng/mlb、HBeAg放射性核素标记抗体诊断试剂：放射性核素标记抗体诊断试剂：125I 标记，灵标记，灵敏度敏度0.1 ng/mlc、HAV抗原放射性核素标记抗体诊断试剂：抗原放射性核素标记抗体诊断试剂：125I 标记标记d、AFP放射性核素标记抗体诊断试剂：放射性核素标记抗体诊断试剂：125I 标记，灵敏标记，灵敏度度15 ng/mle、CEA放射性核素标记抗体诊断试剂：放射性核素标记抗
47、体诊断试剂：125I 标记，灵敏标记，灵敏度度1 ng/ml3、导向诊断药物、导向诊断药物 由于肿瘤的特异性小分子抗体尚在研由于肿瘤的特异性小分子抗体尚在研究之中，所以导向药物还未爱临床广泛究之中，所以导向药物还未爱临床广泛应用。应用。二、抗体治疗药物二、抗体治疗药物 以抗体为载体的导向治疗药物的研究已以抗体为载体的导向治疗药物的研究已有有2020多年的历史，已制备出百余种单克隆抗体，多年的历史，已制备出百余种单克隆抗体，鉴定出数十种与肿瘤相关的抗原，受试病人超鉴定出数十种与肿瘤相关的抗原，受试病人超过数千例。但治疗用的制剂尚没有一种达到商过数千例。但治疗用的制剂尚没有一种达到商品化的程度。在
48、治疗药物中，单克隆抗体与毒品化的程度。在治疗药物中，单克隆抗体与毒素的偶联物治疗淋巴瘤效果最佳，但有效率仅素的偶联物治疗淋巴瘤效果最佳，但有效率仅30%30%目前的客观现实是目前的客观现实是：研究进展迅速，但未达到：研究进展迅速，但未达到常规治疗的应用阶段。常规治疗的应用阶段。障碍（原因）：障碍（原因）：抗体相对分子质量大，穿透力抗体相对分子质量大，穿透力低，不能达到靶部位或摄取量低。鼠源性抗体的低，不能达到靶部位或摄取量低。鼠源性抗体的排斥反应。排斥反应。常用的抗癌药物常用的抗癌药物：氨甲喋呤（氨甲喋呤（methotrexate,MTX）、）、阿霉素阿霉素(adriamycin,ADM)丝裂
49、霉素丝裂霉素(mitomycin,MMC）、）、环磷酰胺环磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)、新抑癌蛋白新抑癌蛋白(neocarzinostatin,NCS)、正定霉素正定霉素(doxorubicin,DOX)等。等。小结小结 杂交瘤单克隆抗体制备技术的原理是利用聚乙二杂交瘤单克隆抗体制备技术的原理是利用聚乙二醇作为细胞融合剂，使免疫的小鼠脾细醇作为细胞融合剂，使免疫的小鼠脾细 胞与具有在胞与具有在体外不断繁殖能力的小鼠骨髓瘤细胞融为一体外不断繁殖能力的小鼠骨髓瘤细胞融为一 体，在体，在HATHAT选择性培养基的作用下，只让融合成功的杂交瘤选择性培养基的作用下，只让融合成功的杂
50、交瘤细胞生长，经过反复的免疫学检测筛选和单个细胞培细胞生长，经过反复的免疫学检测筛选和单个细胞培养（克隆化）养（克隆化）,最终获得既能产生所需单克隆抗体最终获得既能产生所需单克隆抗体,又又能不断繁殖的杂交瘤能不断繁殖的杂交瘤 细胞系，将这种细胞扩大培养，细胞系，将这种细胞扩大培养，接种于小鼠腹腔，在其产生的腹水中即可得到高效价接种于小鼠腹腔，在其产生的腹水中即可得到高效价的单克隆抗体。的单克隆抗体。20 20世纪世纪8080年代诞生了应用年代诞生了应用DNADNA重组及蛋白工程技重组及蛋白工程技术对编码抗体基因按不同需要进行改造和装配，经术对编码抗体基因按不同需要进行改造和装配，经导入适当的受
