1、西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程第三章第三章 基因克隆的酶学基础基因克隆的酶学基础第一节第一节 限制性内切酶限制性内切酶第二节第二节 DNA、RNA连接酶连接酶第三节第三节 DNA聚合酶聚合酶第四节第四节 其它酶其它酶第三章第三章 基因工程酶学基础基因工程酶学基础西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程第一节第一节 限制性内切酶限制性内切酶返回第三章返回第三章3.1.1 寄主控制的限制与修饰现象（寄主控制的限制与修饰现象（50年代初）E.coli KE.coli CEOP=1EOP=1EOP=10-4 EOP=10-4 E
2、OP=1EOP=1EPO:efficiency of plate限制的实质是切割限制的实质是切割外源外源DNA,修饰的实修饰的实质是通过甲基化等质是通过甲基化等修饰自身修饰自身DNA而不而不被切割被切割起作用的是起作用的是核酸内核酸内切酶切酶和和甲基化酶甲基化酶第三章第三章 基因工程酶学基础基因工程酶学基础西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程v型内切酶的发现型内切酶的发现3H标记标记未修饰未修饰的的 噬菌体噬菌体DNA+32P标记标记修饰修饰的的 噬菌体噬菌体DNA 不同菌株细胞温育一定时间蔗糖梯度离心分析蔗糖梯度离心分析DNA未修饰的未修饰的DNA降解降解
3、 修饰的修饰的DNA未降解未降解表明菌株细胞中存在核酸内切酶的活性表明菌株细胞中存在核酸内切酶的活性3.1.23.1.2 限制酶的发现限制酶的发现返回第三章返回第三章第三章第三章 基因工程酶学基础基因工程酶学基础西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程特性特性型型型型型型限制修饰活性限制修饰活性单一功能单一功能分开的内切和甲基分开的内切和甲基活性活性双功能双功能蛋白质结构蛋白质结构三种亚基三种亚基单一成分单一成分2种亚基种亚基辅助因子辅助因子ATP，Mg+2、SAMMg+2ATP，Mg+2、SAM识别位点识别位点EcoB:TGA(N)8TGCT旋转对称旋转对称E
4、coP1:AGACC序列特异的切割序列特异的切割距识别位点至少距识别位点至少1000 bp 随机切割随机切割识别位点特异切割识别位点特异切割识别位点识别位点3端端24-26 bp处处基因克隆中的用处基因克隆中的用处无用无用十分有用十分有用用处不大用处不大3.1.3 3.1.3 限制性内切酶的一般特点限制性内切酶的一般特点返回第三章返回第三章第三章第三章 基因工程酶学基础基因工程酶学基础西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程3.1.4 3.1.4 限制性内切酶的命名方式限制性内切酶的命名方式 第一个字母采用含有此酶的细菌属名的第一个字第一个字母采用含有此酶的细菌
5、属名的第一个字母，母，后两个字母为种名的前两个字母，小写，株系数后两个字母为种名的前两个字母，小写，株系数字通常都省略，字通常都省略，罗马数字用来表示从同一个细菌中分离出的不同罗马数字用来表示从同一个细菌中分离出的不同的限制性内切酶。的限制性内切酶。比如比如HpaI和和HpaII就是从同一种细菌中分离出来的就是从同一种细菌中分离出来的第一种和第二种类型第一种和第二种类型II的限制性内切酶。的限制性内切酶。返回第三章返回第三章第三章第三章 基因工程酶学基础基因工程酶学基础西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程被被酶酶切开的双链切开的双链DNA在端口各形成在端口各
6、形成4个碱基暴露在外的单链，个碱基暴露在外的单链，即形成粘性末端，即形成粘性末端，内切部位为磷酸二酯键处内切部位为磷酸二酯键处返回第三章返回第三章第三章第三章 基因工程酶学基础基因工程酶学基础西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程5GTTAAC 3 3CAATTG 55GTT AAC 3 3CAA TTG 5返回第三章返回第三章第三章第三章 基因工程酶学基础基因工程酶学基础西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程第三章第三章 基因工程酶学基础基因工程酶学基础西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程
7、3.1.5 3.1.5 同尾酶和同裂酶同尾酶和同裂酶 AGATCT A GATCT TCTAGA TCTAG A CGATCG C GATCG GCTAGC GCTAG C返回第三章返回第三章第三章第三章 基因工程酶学基础基因工程酶学基础西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程第三章第三章 基因工程酶学基础基因工程酶学基础西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程3.1.6 3.1.6 型酶的特点和型酶的特点和识别位点识别位点大多数大多数II型酶结合并且切割回文序列型酶结合并且切割回文序列，又称为又称为识别序列识别序列或或识别位点识
8、别位点酶切后产生酶切后产生5磷酸突出或磷酸突出或3羟基突出的末端，它们统称为羟基突出的末端，它们统称为粘性末端粘性末端酶酶有一些在切割两条链时会产生两端平整有一些在切割两条链时会产生两端平整(平末端平末端)的的DNA分子分子酶的识别位点的可以是酶的识别位点的可以是4个、个、5个、个、6个、个、8个甚至更多的碱基对个甚至更多的碱基对在分子克隆实验中使用最普遍的是识别在分子克隆实验中使用最普遍的是识别4个或个或6个碱基对的酶个碱基对的酶星号活性星号活性:非最佳条件下表现出的活性非最佳条件下表现出的活性返回第三章返回第三章第三章第三章 基因工程酶学基础基因工程酶学基础西北师范大学西北师范大学 精品课
9、程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程3.1.7 3.1.7 类型类型IIII限制性内切酶的主要用途限制性内切酶的主要用途1，绘制物理图谱（酶切位点图谱），绘制物理图谱（酶切位点图谱）返回第三章返回第三章第三章第三章 基因工程酶学基础基因工程酶学基础西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程第三章第三章 基因工程酶学基础基因工程酶学基础西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程想看结果请单击第三章第三章 基因工程酶学基础基因工程酶学基础西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程l两个不同的两个不同的DN
10、A样品用同一种酶酶切后，能产生相同的粘性末端样品用同一种酶酶切后，能产生相同的粘性末端l两个平末端两个平末端DNA片段也可以进行相互拼接片段也可以进行相互拼接 HindIII HindIII -CTCGAAGCTTGTTC-GGCAAGCTTACT-CAGCTTCGAACAAG-CCGTTCGAATGA -CTCGAOH pAGCTTGTTC-GCAOH pAGCTTACT-CAGCTTCGAp HOACAAG-CCGTTCGAp HOATGA 混合 退火 HO p -C T C G A A G C T T G T T C-C A G C T T C G A A C A A G P OH图 2
11、10 两段粘性末端 DNA 的互补配对2，产生克隆位点，产生克隆位点返回第三章返回第三章第三章第三章 基因工程酶学基础基因工程酶学基础西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程返回第三章返回第三章第三章第三章 基因工程酶学基础基因工程酶学基础西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程3.1.8 影响核醚内切限制酶活性的因素影响核醚内切限制酶活性的因素(1)DNA的纯度的纯度(2)DNA的甲基化程度的甲基化程度(3)酶切消化反应的温度酶切消化反应的温度(4)DNA的分子结构的分子结构(5)核酸内切限制酶的缓冲液核酸内切限制酶的缓冲液返回
12、第三章返回第三章第三章第三章 基因工程酶学基础基因工程酶学基础西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程3.2.1 3.2.1 连接酶连接酶待连接二端之一须有磷酸根待连接二端之一须有磷酸根第二节第二节 DNA、RNA连接酶连接酶返回第三章返回第三章第三章第三章 基因工程酶学基础基因工程酶学基础西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程3.2.2 3.2.2 常见的常见的DNADNA连接酶连接酶n大肠杆菌大肠杆菌DNA连接酶连接酶,由细菌由细菌DNA编码，只连接编码，只连接 粘性末端。粘性末端。nT4 DNA连接酶连接酶，由由T4噬菌体
13、侵染的大肠杆菌产生。噬菌体噬菌体侵染的大肠杆菌产生。噬菌体DNA编码，对平末端的连接效率比编码，对平末端的连接效率比细菌细菌DNA连接酶连接酶高的多。高的多。n热稳定的热稳定的DNA连接酶：连接酶：嗜热高温放线菌中分离，嗜热高温放线菌中分离，85度有高活性，度有高活性，94仍有活性。仍有活性。返回第三章返回第三章第三章第三章 基因工程酶学基础基因工程酶学基础西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程3.2.3 3.2.3 连接酶的连接作用连接酶的连接作用返回第三章返回第三章第三章第三章 基因工程酶学基础基因工程酶学基础西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武
14、国凡武国凡基因工程基因工程返回第三章返回第三章第三章第三章 基因工程酶学基础基因工程酶学基础西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程3.2.4 DNA的连接策略的连接策略二、平末端二、平末端DNA片段的连接片段的连接一、粘性末端一、粘性末端DNA片段的连接片段的连接(1)同聚物加尾法同聚物加尾法返回第三章返回第三章第三章第三章 基因工程酶学基础基因工程酶学基础西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程(2)衔接物连接法衔接物连接法双衔接物法双衔接物法返回第三章返回第三章第三章第三章 基因工程酶学基础基因工程酶学基础西北师范大学西北师
15、范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程(3)DNA接头连接法接头连接法第三章第三章 基因工程酶学基础基因工程酶学基础西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程返回第三章返回第三章第三章第三章 基因工程酶学基础基因工程酶学基础西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程3.2.5热稳定的热稳定的DNA连接酶连接酶p从嗜热高温放线茵菌株中分离纯化从嗜热高温放线茵菌株中分离纯化p能够在高温下催化两条寡核苷酸探针发生连接作用的一种能够在高温下催化两条寡核苷酸探针发生连接作用的一种核酸酶核酸酶:在在85高温下都具有连接酶的活性，而
16、且在重复多次高温下都具有连接酶的活性，而且在重复多次升温到升温到940 之后也仍然保持活性。之后也仍然保持活性。p使用此种使用此种DNA连接酶进行体外连接，可明显降低形成非持连接酶进行体外连接，可明显降低形成非持异性连接产物的机率。异性连接产物的机率。p现已经能够从克隆的大肠杆菌中大量制备现已经能够从克隆的大肠杆菌中大量制备.返回第三章返回第三章第三章第三章 基因工程酶学基础基因工程酶学基础西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程3.2.6 寡核苷酸连接测定寡核苷酸连接测定返回第三章返回第三章第三章第三章 基因工程酶学基础基因工程酶学基础西北师范大学西北师范大学
17、 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程也叫连接扩增反应，是也叫连接扩增反应，是应用寡核苷酸探针通过应用寡核苷酸探针通过DNA连接酶的作用扩增连接酶的作用扩增已知序列的靶已知序列的靶DNA3.2.7 连接酶链式反应连接酶链式反应返回第三章返回第三章第三章第三章 基因工程酶学基础基因工程酶学基础西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程(1)裂口连接酶链裂口连接酶链式反应式反应(P151)(2)不对称裂口连不对称裂口连接酶链式反应接酶链式反应返回第三章返回第三章第三章第三章 基因工程酶学基础基因工程酶学基础西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武
18、国凡基因工程基因工程3.2.8 连接策略连接策略1、匹配的粘性末端：、匹配的粘性末端：、平末端：、平末端：、不匹配的粘性末端：、不匹配的粘性末端：返回第三章返回第三章第三章第三章 基因工程酶学基础基因工程酶学基础西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程第三节第三节 DNA聚合酶聚合酶返回第三章返回第三章DNA聚合酶：聚合酶：需要模板，有需要模板，有多种多种活性活性，催化催化1个个核苷酸在个个核苷酸在链的链的3接上去接上去Taq DNA聚合酶聚合酶：来自于嗜热的古细菌来自于嗜热的古细菌逆转录酶：逆转录酶：以以mRNA为模为模板，在逆转录酶的作用下，合成板，在逆转录
19、酶的作用下，合成一段与一段与mRNA互补的互补的 DNA片段片段末端核苷酸转移酶：末端核苷酸转移酶：需要模板需要模板第三章第三章 基因工程酶学基础基因工程酶学基础西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程三种活性，即三种活性，即5-3的聚合酶的聚合酶活性、活性、5-3的核酸外切酶的核酸外切酶活性和活性和3-5的核酸的核酸外切外切酶活性。酶活性。3-5的外切活性比的外切活性比T4或或T7聚合酶的相应活性低得多。聚合酶的相应活性低得多。3.3.1 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶(Pol)返回第三章返回第三章第三章第三章 基因工程酶学基础基因工程酶学基础西北师范大学
20、西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程第三章第三章 基因工程酶学基础基因工程酶学基础西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程第三章第三章 基因工程酶学基础基因工程酶学基础西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程返回第三章返回第三章第三章第三章 基因工程酶学基础基因工程酶学基础西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程返回第三章返回第三章第三章第三章 基因工程酶学基础基因工程酶学基础西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程枯草杆菌蛋白酶水解枯草杆菌蛋
21、白酶水解大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶全酶所得全酶所得K1enow聚合酶仍具有聚合酶仍具有5-3的聚合酶的聚合酶活性、活性、3-5的核酸外切的核酸外切酶酶活性活性,但失去了全酶的但失去了全酶的5-3的核酸外切酶的核酸外切酶活性。活性。在在DNA分子克隆中，分子克隆中，Klenow聚合酶的主要用途有：聚合酶的主要用途有：(1)修补经限制酶消化的修补经限制酶消化的DNA所形成的所形成的3隐蔽末端隐蔽末端(2)标记标记DNA片段的末端片段的末端(3)cDNA克隆中的第二链克隆中的第二链cDNA的合成的合成(4)DNA序列测定。序列测定。3.3.2 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶 K1enow
22、片段返回第三章返回第三章第三章第三章 基因工程酶学基础基因工程酶学基础西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程返回第三章返回第三章第三章第三章 基因工程酶学基础基因工程酶学基础西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程l从从T4噬菌体感染的大肠杆菌中纯噬菌体感染的大肠杆菌中纯化。化。l由噬菌体基因由噬菌体基因43编码的编码的.l具有两种酶催活性，即具有两种酶催活性，即5-3 聚合聚合活性、活性、3-5 外切外切活性活性l可以用来标记可以用来标记DNA平末端或隐蔽平末端或隐蔽的的3 末端。末端。l在没有核苷三磷酸存在的条在没有核苷三磷
23、酸存在的条l件下，件下，只具有只具有3-5 外切外切活性活性.3.3.3 T4DNA聚合酶和取代合成法标记聚合酶和取代合成法标记DNA返回第三章返回第三章第三章第三章 基因工程酶学基础基因工程酶学基础西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程3.3.4 反转录酶反转录酶l最普遍使用的是来源于鸟类最普遍使用的是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒骨髓母细胞瘤病毒(AMV)的反的反转录酶，由两条多肽链组成转录酶，由两条多肽链组成.l其中一条肽链具有反转录酶其中一条肽链具有反转录酶活性和活性和RNaseH活性。活性。RNaseH活性是一种核酸外切酶，它以活性是一种核酸外切酶，它以
24、5-3 或或 3-5的方向特异地降的方向特异地降解解RNADNA杂交分子中的杂交分子中的RNA链。链。l另一条肽链则具有以另一条肽链则具有以RNADNA杂交分子为底物的杂交分子为底物的5一一3脱氧核酸外切酶活性脱氧核酸外切酶活性返回第三章返回第三章第三章第三章 基因工程酶学基础基因工程酶学基础西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程返回第三章返回第三章第三章第三章 基因工程酶学基础基因工程酶学基础西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程3.3.5 Taq DNA聚合酶聚合酶 是从一种水生栖热菌分离提取的是从一种水生栖热菌分离提取的
25、。嗜热真菌能在嗜热真菌能在7075生长生长。该菌是该菌是1969年从美国黄石国家森林公园火年从美国黄石国家森林公园火山温泉山温泉 中分离。中分离。返回第三章返回第三章第三章第三章 基因工程酶学基础基因工程酶学基础西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程(一一)酶活性与热稳定性酶活性与热稳定性每个酶分子每秒钟可延伸约每个酶分子每秒钟可延伸约150bp，70 60bp/秒，秒，55 24bp/秒秒。过高过高(90以上以上)或过低或过低(22)都可影响酶的活性。都可影响酶的活性。在在90以上几乎以上几乎无无DNA合成合成，但有良好的但有良好的热稳定性热稳定性。在在92
26、.5、95、97.5时，时，PCR混合物中的混合物中的Taq DNA聚合酶分别经聚合酶分别经130min，40min和和56min后，仍可保持后，仍可保持50%的活性的活性。Taq DNA聚合酶还具有逆转录活性。聚合酶还具有逆转录活性。返回第三章返回第三章第三章第三章 基因工程酶学基础基因工程酶学基础西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程(二二)离子依赖性离子依赖性lMg2+依赖性酶，非常敏感依赖性酶，非常敏感。lMg2+能与能与dNTP结合而影响结合而影响PCR反应液中游离反应液中游离 的的Mg2+浓浓度，因而度，因而Mg2+的浓度在不同的反应体系中应适当调
27、整的浓度在不同的反应体系中应适当调整。l一般反应一般反应 中中Mg2+比比dNTP总浓度高总浓度高0.51.0mmol/L。l适当浓度的适当浓度的KCL能使能使Taq DNA聚合聚合 酶的催化活性提高酶的催化活性提高5060%，其最适浓度为，其最适浓度为50mmol/L。返回第三章返回第三章第三章第三章 基因工程酶学基础基因工程酶学基础西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程(三三)忠实性忠实性TaqDNA聚合酶具有聚合酶具有53聚合酶活性和聚合酶活性和53外切酶活外切酶活性，而无性，而无35外切活外切活 性性没有校正功能没有校正功能。Taq DNA聚合酶的碱基
28、错配机率为聚合酶的碱基错配机率为2.110-4.返回第三章返回第三章第三章第三章 基因工程酶学基础基因工程酶学基础西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程(四四)抑制剂抑制剂低浓度的尿素、甲酰胺、二甲基甲酰胺低浓度的尿素、甲酰胺、二甲基甲酰胺(DMF)和二甲基亚砜和二甲基亚砜(DMSD)无影响无影响极低浓度的离子表面活性剂如脱氧胆胺酸钠极低浓度的离子表面活性剂如脱氧胆胺酸钠(小于小于0.06%)，十二烷，十二烷 基肌氨酸钠基肌氨酸钠(小于小于0.02%)，十二烷基硫酸钠，十二烷基硫酸钠(SDS，小于小于0.01%)几乎几乎可完全抑制该酶的可完全抑制该酶的 活性活
29、性.非离子表面活性剂在较高浓度非离子表面活性剂在较高浓度(Tween20，NP-40.和和Tritox-100)如如5%时抑制酶活性时抑制酶活性.低浓度的低浓度的NP-40(0.05%)和和Tween20(0.05%)能增强酶活性能增强酶活性.低浓度低浓度SDS对酶的抑制作用可加入一定浓度的对酶的抑制作用可加入一定浓度的NP-40和和Tween20抵消抵消.TaqDNA聚合酶可在聚合酶可在-20贮贮 存至少存至少6个月。个月。返回第三章返回第三章第三章第三章 基因工程酶学基础基因工程酶学基础西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程.T7 DNA聚合酶聚合酶由两种
30、亚基组成：一种是由两种亚基组成：一种是T7噬菌体编码的噬菌体编码的基因基因5蛋白蛋白；另一种是大肠另一种是大肠杆菌编码的杆菌编码的硫氧还蛋白硫氧还蛋白。基因基因 5蛋白蛋白是一种非加工的是一种非加工的DNA聚合酶，具有单链的聚合酶，具有单链的3、5核酸外核酸外切酶活性。切酶活性。硫氧还蛋白硫氧还蛋白作为一种辅助蛋白作为一种辅助蛋白，增加增加基因基因 5蛋白蛋白同引物模板的亲合性，同引物模板的亲合性，使使DNA的加工合成达数千个核苷酸。的加工合成达数千个核苷酸。基因基因5蛋白质蛋白质一一硫氧还蛋白硫氧还蛋白复合物（复合物（T7 DNA聚合酶）是已商品化生产聚合酶）是已商品化生产的加工的的加工的
31、DNA聚合酶聚合酶。它一旦同多核苷酸模板链结合，便会不间断地它一旦同多核苷酸模板链结合，便会不间断地合成互补链。除此之外，合成互补链。除此之外，T7 DNA聚合酶还具有很高的单链及双链的聚合酶还具有很高的单链及双链的 35核酸外切酶活性。核酸外切酶活性。返回第三章返回第三章第三章第三章 基因工程酶学基础基因工程酶学基础西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程T7 DNA聚合酶有如下几个方面的用途：聚合酶有如下几个方面的用途：从大分子量模板（例如从大分子量模板（例如M13）上引物开始的上引物开始的DNA延伸合成，它能够根据延伸合成，它能够根据同样的引物模板延伸合成
32、数千核苷酸，中间不发生任何解离现象，同时基同样的引物模板延伸合成数千核苷酸，中间不发生任何解离现象，同时基本上也不受本上也不受 DNA二级结构的影响（大肠杆菌二级结构的影响（大肠杆菌DNA聚合酶、聚合酶、T4 DNA聚合酶聚合酶或反转录酶则不然）。或反转录酶则不然）。如同如同 T4 DNA聚合酶一样，可以通过单纯的延伸或取代合成的途径，标聚合酶一样，可以通过单纯的延伸或取代合成的途径，标记记DNA的的3一末端。一末端。可以用来将双链可以用来将双链 DNA的末端补平。的末端补平。返回第三章返回第三章第三章第三章 基因工程酶学基础基因工程酶学基础西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武
33、国凡基因工程基因工程修饰的修饰的 T7 DNA聚合酶聚合酶应用化学方法，对天然的应用化学方法，对天然的T7 DNA聚合酶进行修饰，使之完聚合酶进行修饰，使之完全失去全失去 3一一5的核酸外切酶活性。的核酸外切酶活性。聚合作用的速率增加了聚合作用的速率增加了 3倍。倍。返回第三章返回第三章第三章第三章 基因工程酶学基础基因工程酶学基础西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程.末端转移酶末端转移酶平头末端平头末端3加接一段多聚加接一段多聚A或或C等，成为粘性等，成为粘性末端末端5-3 dATP 末末 5-AAAA3 3-5 端端转移酶转移酶 3AAAA-5 返回第三
34、章返回第三章第三章第三章 基因工程酶学基础基因工程酶学基础西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程返回第三章返回第三章第三章第三章 基因工程酶学基础基因工程酶学基础西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程第四节第四节 其它酶其它酶3.4.1 核苷酸激酶核苷酸激酶返回第三章返回第三章第三章第三章 基因工程酶学基础基因工程酶学基础西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程返回第三章返回第三章第三章第三章 基因工程酶学基础基因工程酶学基础西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工
35、程3.4.2 碱性磷酸酶碱性磷酸酶返回第三章返回第三章第三章第三章 基因工程酶学基础基因工程酶学基础西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程 核酸酶底物切割位点产物大肠杆菌核酸外切酶I大肠杆菌核酸外切酶Ill大肠杆菌核酸外切酶V大肠杆菌核酸外切酶Vll噬菌体核酸外切酶T7噬菌体基因6核酸外切酶ssDNAdsDNADNAssDNAdsDNAdsDNA5OH末端3OH末端3OH末端3OH末端，5P末端5P末端5P末端5一单核着酸，加末端二核着酸5一单核苦酸5一单核着酸212hP的寡核酸短片段5单核着酸5一单核着酸3.4.3 核酸外切酶核酸外切酶返回第三章返回第三章第
36、三章第三章 基因工程酶学基础基因工程酶学基础西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程返回第三章返回第三章第三章第三章 基因工程酶学基础基因工程酶学基础西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程可制备链特异的放射性探针（同用可制备链特异的放射性探针（同用 T4 DNA聚合酶取代合成类似）。聚合酶取代合成类似）。构建单向缺失构建单向缺失。因为因为exolll是双链特异的，优先降解具是双链特异的，优先降解具3一隐蔽末端的双链一隐蔽末端的双链DNA分子。这种特性可用来构建一组从克隆分子。这种特性可用来构建一组从克隆DNA某一特定部位开始的单
37、向缺失。某一特定部位开始的单向缺失。返回第三章返回第三章第三章第三章 基因工程酶学基础基因工程酶学基础西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程3.4.4 单链核酸内切酶与单链核酸内切酶与RNA分子定位返回第三章返回第三章第三章第三章 基因工程酶学基础基因工程酶学基础西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程3.4.5 Bal 31核酸酶与核酸酶与限制位点确定返回第三章返回第三章第三章第三章 基因工程酶学基础基因工程酶学基础西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程返回第三章返回第三章第三章第三章 基因工程酶学基础基因工程酶学基础西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程返回第三章返回第三章谢谢谢谢
